一種控制油菜菌核病的基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種控制甘藍(lán)型油菜菌核病基因及其應(yīng)用，具體涉及一種控制甘藍(lán)型油菜菌核病的基因BnWRKY33的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。BnWRKY33基因具有控制作物菌核病的功能，在菌核病處理甘藍(lán)型油菜時(shí)BnWRKY33的表達(dá)量顯著提高。通過基因工程技術(shù)提高BnWRKY33基因的表達(dá)量能夠控制油菜菌核病，從而對(duì)提高甘藍(lán)型油菜及其他作物的菌核病抗性和產(chǎn)量具有重要的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種控制油菜菌核病的基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種控制油菜菌核病的基因及其應(yīng)用，具體涉及一種控制甘藍(lán)型油菜菌核病的基因和含有該基因或其同源基因的載體，并涉及利用該基因或其功能類似物調(diào)控植物抗菌核病在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]油菜作為一種重要的油料作物，在中國的油料生產(chǎn)中占有重要的地位。我國油菜年種植面積700萬公頃(I億畝)，占全世界的1/3，居世界首位，其所產(chǎn)菜籽油占我國整個(gè)食用植物油供應(yīng)的40% (沈金雄等，中國油菜生產(chǎn)及遺傳改良潛力與油菜生物柴油發(fā)展前景[J]，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007年，26卷6期894-899頁)。此外，菜籽油也是適宜于生產(chǎn)生物柴油，油菜已被歐美各國作為解決全球能源短缺的重要原料作物。因此油菜不僅是食用油的主要來源，也是解決全球能源短缺的重要原料作物，具有十分重要的戰(zhàn)略地位。
[0003]然而，我國的菜籽生產(chǎn)量目前僅能滿足國內(nèi)2/3的消費(fèi)需求，大量依賴進(jìn)口。我國2005年進(jìn)口植物油600多萬噸，是世界上最大的油料進(jìn)口國，隨著人口數(shù)量的增長和人民生活水平的提高，按目前的生產(chǎn)規(guī)模，缺口將會(huì)變得更大(王漢中，中國油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀、問題與對(duì)策[J]，中國油料作物學(xué)報(bào)，2005年，27卷4期100-105頁)。在當(dāng)前和今后相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)，我國都將面臨食用油和化石能源短缺的嚴(yán)峻局面。
[0004]油菜菌核病(5b7<9roii/?iasclerotiorum (Lib.) de Bary)是限制我國油菜生產(chǎn)的主要因子之一。在長江中下游及東南沿海油菜主產(chǎn)區(qū)，油菜菌核病的發(fā)生率很高，產(chǎn)量損失高達(dá)50%以上；全國發(fā)生面積在7000萬畝以上，產(chǎn)量損失高達(dá)30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)到50-80%。目前油菜菌核病的防治方法主要是化學(xué)防治技術(shù)和抗病品種的選育，但化學(xué)防治存在防效不高、病原難以根除、花期噴藥困難以及農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等諸多問題；常規(guī)育種因難以找到有效的抗性材料以及速度非常緩慢等缺點(diǎn)，也很難有效解決抗病問題。由此，對(duì)抗菌核病油菜品種進(jìn)行分子改良，快速培育抗菌核病品種，是提高菜籽單位面積產(chǎn)量的重要策略。
[0005]基因工程方法是按預(yù)先設(shè)計(jì)好的目標(biāo)和計(jì)劃，通過遺傳操作，在分子水平上改良品種的技術(shù)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所發(fā)現(xiàn)了一個(gè)植物抗病基因?yàn)榛騛或基因b，將基因a或基因b修飾后對(duì)植物的抗性有顯著提高(申請(qǐng)?zhí)?201110048518.9，2011)。而像油菜菌核病這類在寄主植物種內(nèi)難于找到抗原的病害，基因工程方法提供了一種解決問題的途徑。
[0006] WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是近年來研究較廣泛的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，它存在于整個(gè)綠色植物系中，在調(diào)控植物生物脅迫反應(yīng)及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要作用(AsaiT et al.,, MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity [J],Nature, 2002年，415卷6875期977-983頁)。FMTJJ轉(zhuǎn)錄因子是WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要一員，含有兩個(gè)WRKY蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于第I類WRKY蛋白(Eulgem et al.，The WRKYsuperfamily of plant transcription factors[J], Trends Plant Sci,2000 年，5 卷 5期199-206頁)。已有研究表明轉(zhuǎn)錄因子是腐生型真菌抗性所必需的，它能夠與(T) TGACC(A / T)序列(w-box)發(fā)生特異性作用，調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中含W — box元件的調(diào)芐基因或功能基因的表達(dá)(Lippok B et al., Expression of AtWRKY33 encoding a pathogen-or PAMP-responsive WRKY transcription factor is regulated by a composite DNAmotif containing W box elements[J] ,Mol Plant Microbe Interact,2007年，20卷4期420-429頁)。中國科學(xué)院植物研究所研究發(fā)現(xiàn)，WRKY的多肽Glyma02g39870能夠調(diào)控植物中水楊酸的合成，從而增強(qiáng)植物的抗病性(金京波等，2012 ;申請(qǐng)?zhí)?201010541600.0)。擬南芥通過遞與AtMPK4形成一個(gè)復(fù)合體，當(dāng)受到病原菌侵害時(shí)，AtWRKY33和AtMPK4從AtMKSl中脫離，從而引起下游一些激素相關(guān)的基因，如PRl、TOF1.2等的表達(dá)(Jin-Long Qiu et al, Arabidopsis MAP Kinase 4 regulates gene expression viatranscription factor release in the nucleus [J], EMBO Journal, 2008 年，27 卷 16 期2214 - 2221頁)。將大白菜過表達(dá)后，大白菜呈現(xiàn)出對(duì)軟腐病一定的抗性(范榮偉等，大白菜份fMTJJ基因上游調(diào)控序列的克隆及其功能研究[J]，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010年，18卷4期670-675頁)。而對(duì)于油菜的作用，目前還未見有文獻(xiàn)及專利的報(bào)道。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，菌核病對(duì)油菜脅迫處理之后，的表達(dá)顯著提高，進(jìn)而，甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因過表達(dá)植株顯著增強(qiáng)菌核病抗性，這一結(jié)果在增強(qiáng)油菜菌核病抗性和提高菜籽油產(chǎn)量上具有重要的應(yīng)用前景。
[0007]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種控制作物菌核病的基因BnWRKY33。
[0009]一種來源于油菜的基因及其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0010]本發(fā)明還公開了基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所
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[0011]本發(fā)明還公開了帶有BnWRKY33基因的重組載體1300-35S-WRKY33-N0S。在載體pCAMBIA1300 (購于北京鼎國昌盛生物公司)的上游EcoRI/Kpnl酶切位點(diǎn)處加入CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子，其下游BamHI/Hindlll酶切位點(diǎn)處加上CaMV Nos終止子，將其改造成載體pCAMBIA1300-35S-Nos。而重組載體 1300-35S-WRKY33-N0S 熱:X BnWRKY33_? (5' -ggtaccATGGCTGCTTCTTCCCTTC-3' ) ,BnWRKY33~R{^' -ggatccTCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3')為引物擴(kuò)增出目的基因及?腸，進(jìn)而按照gateway試劑盒(Gateway? LR Clonase?II EnzymeMix , Invitrogen Corporation)操作，將目的基因克隆到 pCAMBIA1300-35S_Nos 的酶切位點(diǎn) KpnI/BamHI，得到 1300-35S-WRKY33-N0S。
[0012]本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述BnWRKY33基因在提高油菜對(duì)菌核病的抗性中的應(yīng)用，本發(fā)明通過過量表達(dá)該基因來達(dá)到提高甘藍(lán)型油菜對(duì)死體營養(yǎng)型病菌菌核病的抗性。具體實(shí)驗(yàn)技術(shù)步驟如下:
創(chuàng)建甘藍(lán)型油菜cDNA文庫，從cDNA文庫中PCR擴(kuò)增出與AtWRKY33同源的cDNA，進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)這個(gè)cDNA克隆為1452bp,在GenBank數(shù)據(jù)庫對(duì)其Blast核苷酸比對(duì),發(fā)現(xiàn)這個(gè)cDNA序列與擬南芥、煙草等的轉(zhuǎn)錄因子WRKY33在核苷酸水平上有很高的同源性。為了初步探測WRKY33對(duì)菌核病侵染的反應(yīng)，用核盤菌(從江蘇鎮(zhèn)江油菜中分離)接種油菜葉片，分別在接種0、12、24、36、48 h時(shí)采樣然后提取葉片總RNA，然后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測BnWRKY33的表達(dá)量。用攜帶有1300-35S-WRKY33-N0S載體的農(nóng)桿菌以浸花法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，采用PCR技術(shù)鑒定出轉(zhuǎn)基因株系，通過RT -PCR技術(shù)鑒定出表達(dá)水平顯著高于非轉(zhuǎn)基因株系的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。菌核病抗病評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)表明，與非轉(zhuǎn)基因株系相比，BnWRKY33過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系顯著提高菌核病抗性。這些結(jié)果表明BnWRKY33基因在增強(qiáng)油菜菌核病抗性上具有重要的應(yīng)用前景。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明中所采用的從油菜CDNA文庫來克隆基因，可靠性高、速度快、效率高。
[0014]2.本發(fā)明中所采用的花粉管通道法轉(zhuǎn)化油菜，速度快、成本低、操作簡單。
[0015]3.本發(fā)明中克隆得到的基因，為其它作物抗病育種提供了新的基因源；為研究怎樣提高其它作物的菌核病抗性具有指導(dǎo)借鑒作用。
[0016]4.本發(fā)明所獲得的轉(zhuǎn)基因材料，為進(jìn)一步培育高度菌核病抗性的油菜新品種提供新的育種材料。
[0017]5.BnWRKV33轉(zhuǎn)基因油菜植株顯著提高菌核病抗性，對(duì)油菜的生產(chǎn)具有重要意義。
[0018]^.BnVRKY33被鑒定為油菜菌核病抗性基因，對(duì)闡明BnWRKY33基因的生物學(xué)功能
有重要意義。
[0019]7.BnWRKY33這一油菜菌核病抗性基因的發(fā)現(xiàn)，為發(fā)掘和鑒定作物抗菌核病基因，并深入探討抗菌核病基因的分子作用機(jī)理，具有重要的理論指導(dǎo)意義；在作物抗菌核病的育種實(shí)踐、品種改良及品種推廣均具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)價(jià)值。
[0020]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為與其它物種WRKY33的氨基酸序列比對(duì)；其中各物種的縮寫為:Bn {Brassica 似/瓜^):甘藍(lán)型油菜；Bo ( Brassica oJeracea):花椰菜；Cr {Capsellarubella ):莽菜；AtPu_protein (Thellungi el la halophila unnamed protein):小鹽芥；AtPu—protein (.Arabidopsis thaliana putative WRKY33):擬南芥；A1 (.Arabidopsis深山南介；RcTF(TPicizw1S communis transcription factor):蓖麻；Jc?/rcM):桐油樹。黑色區(qū)域顯示的為相同的氨基酸，灰色區(qū)域顯示的為類似的氨基酸，WRKYGQK為WRKY結(jié)構(gòu)域，用方框標(biāo)出。
[0021 ] 圖2為BnWRKY33對(duì)核盤菌侵染的反應(yīng)。
[0022]圖3 為 BnWRKY33 表達(dá)載體 1300-35S-WRKY33-N0S 構(gòu)建示意圖；
圖4為油菜轉(zhuǎn)基因株系的鑒定；“正”為1300-35S-WRKY33-N0S載體的PCR陽性對(duì)照。#1到#20分別為20個(gè)轉(zhuǎn)基因株系?！柏?fù)”為非轉(zhuǎn)基因野生型對(duì)照。
[0023]圖5為RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因過表達(dá)株系與非轉(zhuǎn)基因野生型株系中表達(dá)水平的比較；WT為非轉(zhuǎn)基因野生型對(duì)照；#6、#8、#10為獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。
[0024]圖6為過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因野生型株系的菌核病抗性比較；WT為非轉(zhuǎn)基因野生型對(duì)照；#8為轉(zhuǎn)基因株系。
[0025]圖7為過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因野生型株系菌核病病斑擴(kuò)展的比較；WT為非轉(zhuǎn)基因野生型對(duì)照；#6、#8、#10為獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1: BnWRKY33基因的分離克隆(I)BnWRKY33基因的分離和克隆
以甘藍(lán)型油菜的中雙9號(hào)品種作為實(shí)驗(yàn)材料，生長條件為:溫度為20 土 2° C;濕度為60-90% ;每天光周期為光照8 h黑暗16 h ;光照強(qiáng)度為44 μ mo I m_2 s — 1。
[0027]油菜葉片總RNA的提取和cDNA的合成采用UNIQ- 10柱式Trizol試劑盒(購于上海英俊生物技術(shù)有限公司)，使用DNase I (寶生物工程(大連)有限公司)除去總RNA中混有的少量DNA，最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。cDNA的合成按照MMLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)的操作說明進(jìn)行，引物用50μ mol/L Oligo (dT) 18 (Thermo Fisher Scientific)。然后使用引物(5'-ATGGCTGCTTCTTCCCTTC-3')和及(5' - TCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3')來擴(kuò)增目的條帶，然后將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pMD18-T載體(寶生物工程(大連)有限公司)。目的片段的回收、連接與轉(zhuǎn)化參照UNIQ- 10柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)進(jìn)行操作。目的片段與T載體的連接體系為:4.6 UL目的片段、0.4 ULPMD-18T載體、5 μ L Solution I (寶生物工程(大連)有限公司)在16°C下連接過夜。將其送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序。
[0028]基因序列結(jié)構(gòu)分析
經(jīng)測序，發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因的核苷酸序列長為1452bp，含有一個(gè)全長的開放閱讀框，使用ClustalX (Thompson et al., 1997 )程序進(jìn)行多種氨基酸序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn),這個(gè)目的條帶與擬南芥、花椰菜、薺菜、小鹽芥、深山南介、蓖麻和桐油樹的WRKY33在氨基酸水平上有很高的同源性(圖1)。因此，這個(gè)基因被命名為將其提交到GenBank，登錄號(hào)為KF712488。BnWRKY33含有兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，其上攜帶有各自的CXt5CX22I3HX1H的鋅指結(jié)構(gòu)，屬于 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的 I 類(Eulgem et al., The WRKY superfamily of planttranscription factors [J], Trends Plant Sci, 2000 年，5 卷 5 期 199-206 頁)。比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這些序列在C末端的WRKY結(jié)構(gòu)域保守位點(diǎn)都具有與蛋白互作相關(guān)的關(guān)鍵殘基天冬氨酸(Cheng et al., Structural and Functional Analysis of VQ Motif-ContainingProteins in Arabidopsis as Interacting Proteins of WRKY Transcription Factors[J], Plant Physiology, 2012年，159卷2期810-825頁)。同時(shí)，在相對(duì)保守的N-末端，都含有4-5個(gè)絲氨酸-脯氨酸殘基位點(diǎn)，其可能為潛在的MAP激酶磷酸化位點(diǎn)(Shairockset al., Docking domains and substrate-specificity determination for MAPkinases [J], Trends Biochem Sci, 2000 年，25 卷 9 期 448-453 頁)。通過軟件 PSORT II預(yù)測發(fā)現(xiàn)，這些蛋白序列中含有高度保守的核定位信號(hào)。
[0029]實(shí)施例2:對(duì)核盤菌的反應(yīng)
(I)核盤菌的處理
對(duì)油菜幼苗(四葉一心期時(shí))第三葉進(jìn)行菌核病病原菌核盤菌的接種處理，處理前將植株進(jìn)行23°C恒溫培養(yǎng)4~5天，然后葉片置于黑暗環(huán)境保濕24 h。然后用核盤菌的菌絲塊進(jìn)行接種，對(duì)照接以無菌培養(yǎng)基塊。分別在接種后O h、12 h、24 h、36 h、48 h采樣。
[0030](2)甘藍(lán)型油菜RNA的提取
利用植物Trizol (上海英俊生物技術(shù)有限公司)試劑抽提其總RNA。
[0031](3)實(shí)時(shí)定量PCR
突光定量 PCR 使用 SYBR? Green Realtime PCR Master Mix - Plus -試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)，采用漢 napusUBC21 (ubiquitin-conjugating enzyme 21)作為內(nèi)標(biāo)基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。UBC21的引物是F:5’ -CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT-3 ’和 5Λ - CATATCTCCCCTGTCTTGAAATGC-3'，BnVRKY33 基因的引物序列:5Λ- AGAGGACGGTTACAACTGGAGAAA-3^ and 5^- TGTCGGACAGCTTGGGAAAG- 3Λ。熒光定量反應(yīng)體系為20 μι:含有SYBR Mix 10 μL，正反向引物(10 Mmol/L)各0.8 μL，模板2 μL和DEPC處理過的無菌水。擴(kuò)增條件為:95°C，30sec ;然后95°C 5s,60°C 30 s，72°C 27s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)于72°C復(fù)性末端進(jìn)行熒光檢測。反應(yīng)結(jié)束后先加熱到95°C，然后降至720C，再緩慢升溫至95°C，記錄熒光信號(hào)的變化，得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。每組實(shí)驗(yàn)均完成三個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)生物學(xué)重復(fù)至少做三次技術(shù)重復(fù)。檢測分別在油菜核盤菌誘導(dǎo)的葉片0-48 h的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。
[0032]首先以溶解曲線為標(biāo)準(zhǔn)，利用ABI (美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)型號(hào)為QPCR7300儀所自帶的軟件7300 System-SDSS hell，優(yōu)化內(nèi)標(biāo)基因和目的基因PCR反應(yīng)條件，使之?dāng)U增產(chǎn)物特異。本實(shí)驗(yàn)以油菜BnUBC21為內(nèi)標(biāo)基因，分別測定BnUBC21和目的基因的Ct值，取其平均值，用比較Ct法得到目的基因?qū)?nèi)標(biāo)基因的DCt，然后以水處理的葉片為參照(即將其值轉(zhuǎn)換成I)分別獲得其它處理的DDCt，最后通過2-DDCt估算目的基因的相對(duì)表達(dá)值，并且求出系統(tǒng)誤差。[0033]結(jié)果顯示，當(dāng)核盤菌侵染24h樹,BnWRKY33的轉(zhuǎn)錄水平升高9.1倍，當(dāng)核盤菌侵染48h樹,BnWRKY33的表達(dá)量相較于未接種核盤菌菌株提高11倍(圖2)。說明油菜
對(duì)核盤菌的侵染有顯著的響應(yīng)。
[0034]實(shí)施例3:過表達(dá)轉(zhuǎn)基因油菜植株的獲得
(I)植物表達(dá)載體構(gòu)建
設(shè)計(jì)引 物 5 ' -gaattcTTAATTAAGAGCTCGCATGCC-3 ' 和5 ' -ggtaccGTCCCCGTGTTCTCTCCAA-3 '，采用PCR的手段從pEGAD載體(購于寶生物工程(大連)有限公司)中擴(kuò)增得到CaMV 35S片段，然后將其連接到pCAMBIA1300載體(購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)的EcoRI/Kpnl酶切位點(diǎn)；同時(shí)設(shè)計(jì)引物5'-ggatccGAATTTCCCCGATCGTTCAA ' -3 '和 5 ' -aagcttGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3 '，用PCR從pEGAD載體中擴(kuò)增得到CaMV Nos片段，將其連接到pCAMBIA1300載體的Bamm/NindlII 酶切位點(diǎn)，則得到 pCAMBIA1300-35S_Nos 載體。所用內(nèi)切酶 EcoR1、KpnI^afflHI及均購于寶生物工程(大連)有限公司，酶切條件為37°C靜置12h。接著設(shè)計(jì)引物 5' -ggtaccATGGCTGCTTCTTCCCTTC-3 '和5' -ggatccTCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3'，以甘藍(lán)型油菜cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所需的長為1473kb的目的片斷，將其連接到pCAMBIA1300-35S-Nos的KpnI/BamHI酶切位點(diǎn)上，反應(yīng)體系為:1.KpnI I ul,10*Hbufferlul, DNA Iul (2ug)，ddH20 7ul ；I1.BamHI I ul,10*Kbufferlul, DNA Iul(2ug)，ddH20 7ul，將其置于37°C靜置12h。從而創(chuàng)建到甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)載體1300-35S-WRKY33-N0S，在其T-DNA區(qū)內(nèi)含有抗潮霉素的篩選標(biāo)記，過量表達(dá)的啟動(dòng)子為35s啟動(dòng)子(圖3)。
[0035](2)油菜的遺傳轉(zhuǎn)化
將1300-35S-WRKY33-N0S轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，浸染油菜花三次，每次五分鐘。浸染步驟
為:(I)在含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101，然后按10%的比例接入含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶使農(nóng)桿菌培養(yǎng)液終濃度為0D600約為2.0左右。
[0036](2)在培養(yǎng)基內(nèi)加入轉(zhuǎn)化緩沖液:
0.1%Silwet-77
2ng/L6-BA
8mg/L乙酰丁香酮
(3)把油菜的整個(gè)未開的花蕾部分浸泡在農(nóng)桿菌溶液中3-5min，同時(shí)輕輕搖動(dòng)使花蕾充分接觸農(nóng)桿菌液。把浸泡過的花蕾套入羊皮紙袋24h，以保持花蕾具有較高的濕度，避免花蕾在過量的陽光中暴曬，防止農(nóng)桿菌失去活性。
[0037](4)隔一天重復(fù)步驟(3)，并把整個(gè)花蕾套在羊皮紙袋中48h。
[0038](5)浸花結(jié)束后，去掉花序上的羊皮紙袋，剪切新生出的側(cè)枝花序以及經(jīng)過浸花的花序其頂端新萌發(fā)的花蕾，并利用彩色絲線對(duì)浸染過農(nóng)桿菌的花序進(jìn)行系線標(biāo)記，不同重組質(zhì)粒的構(gòu)建進(jìn)行標(biāo)簽標(biāo)記。
[0039](6)正常的澆灌培養(yǎng)植株，并定時(shí)剪除新生的側(cè)枝花序以及新生花蕾，直到種子成熟時(shí)停止灌溉。收獲干種子。通過重組質(zhì)粒上攜帶的選擇標(biāo)記進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選。通過此方法篩選出大量的轉(zhuǎn)基因植株。
[0040](3)轉(zhuǎn)基因植株鑒定
收獲的種子出苗以后先用25mg/L的潮霉素篩選，選取抗潮霉素的植株，提取基因組，用 PCR 進(jìn)行鑒定，所用的引物為 5’ -CTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’ 和 5’ -ggatccTCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3’。對(duì)照為野生型非轉(zhuǎn)基因植株(WT)。
[0041]檢測結(jié)果表明(圖4)，陽性對(duì)照和#1-#2，#4-#9，#11-#15，#17_#20這17個(gè)轉(zhuǎn)化植株均能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的電泳條帶(1021bp)，而陰性對(duì)照則沒有電泳條帶，表明轉(zhuǎn)基因油菜基因組中已經(jīng)含有外源基因DNA片段。
[0042](4)邊mkBnWRKY33轉(zhuǎn)基因油菜的RT-PCR鑒定
為了確定在油菜中是否過量表達(dá)，采樣RT-PCR方法進(jìn)行分析，BnWRKY33的擴(kuò)增引物為 5’ AGAGGACGGTTACAACTGGAGAAA 3’ 和 5’ TGTCGGACAGCTTGGGAAAG3’，內(nèi)參基因?yàn)?UBC21，其擴(kuò)增引物 5’ - CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT -3’ 和 5’ -CATATCTCCCCTGTCTTGAAATGC-3’，上海生工合成。PCR程序:95°C預(yù)變性30S，然后經(jīng)40個(gè)循環(huán)(95°C 10s、57°C 10s、72°C 26s)。
[0043]如圖所示，#6、#8、#10株系的表達(dá)水平顯著高于非轉(zhuǎn)基因的野生型對(duì)照，表明#6、#8、#10株系為三個(gè)獨(dú)立的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。
[0044]實(shí)施例4 MRKY33過表達(dá)轉(zhuǎn)基因油菜抗菌核病的評(píng)價(jià)
取上述PCR檢測為陽性的四葉一心期的轉(zhuǎn)他腸光7幻陽性植株的第四片真葉進(jìn)行離體接種。葉片剪下置于白瓷盤中，每個(gè)轉(zhuǎn)基因植株葉片與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹⑴胖糜谝粋€(gè)盤中，葉片下鋪一層濕紗布，取新鮮制備的Φ5πιπι菌絲塊，有菌絲的面朝下，接種于葉片中部稍稍偏離主脈的位置，每葉接種兩個(gè)菌絲塊。用透氣膜蒙上盤口利于保濕，然后置22°C黑暗培養(yǎng)。
[0045]菌絲培養(yǎng)后12 h 開始觀察記錄菌絲的發(fā)生情況，培養(yǎng)后24 h開始觀測記錄菌斑生長量，每隔24 h一次，直至菌絲長到離體葉邊緣為止。[0046]離體葉片接種鑒定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株明顯增強(qiáng)菌核病抗性。如圖6和圖7所示，核盤菌病斑在BnWRKY33過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中的生長面積要比非轉(zhuǎn)基因株系中小很多，損傷組織的面積也要小。根據(jù)核盤菌的生長面積可以發(fā)現(xiàn)，軟腐壞死發(fā)生在核盤菌接種24h后，且在36-48 h期間生長迅速，在48 h時(shí)其生長面積達(dá)到最大。#6，#8和#10這三個(gè)獨(dú)立株系一直保持相同的趨勢，且對(duì)核盤菌的抗性表型相同。在接種48小時(shí)時(shí)，BnWRKY33轉(zhuǎn)基因植株#6，#8和#10葉片病斑僅為野生型對(duì)照的一半。在病菌的擴(kuò)散速度方面，可以發(fā)現(xiàn)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的擴(kuò)散速度要明顯緩于非轉(zhuǎn)基因株系中病斑的擴(kuò)散速度，在油菜中BnWRKY33具有提高菌核病抗性的作用。
【權(quán)利要求】
1.一種控制油菜菌核病的基因，其序列為SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
2.一種控制油菜菌核病的基因編碼的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID N0.2所示氨基酸序列。
3.一種重組載體1300-35S-WRKY33-N0S，它含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種控制油菜菌核病的基因，其特征在于，該基因在控制油菜菌核病 中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103911384SQ201410026575
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】王政, 方和娣, 譚小力, 陳克平, 張志燕, 陳宇, 李冠英, 顧守來 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)