一種抗病增產的生防菌多效復合制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗病增產的生防菌多效復合制劑及其制備方法，它以兩株生防菌株枯草芽孢桿菌的復合發(fā)酵液為主要有效成分，并含有乳化劑、紫外線保護劑、增效劑、防凍劑、黏著劑。其制備方法是將乳化劑與主藥共置于乳化機中攪拌乳化，再依次加入助劑繼續(xù)攪拌乳化，即得枯草芽胞桿菌類乳劑成品。該產品在水中能迅速均勻分散，抑菌譜廣，增產效果顯著，適用范圍廣。
【專利說明】一種抗病增產的生防菌多效復合制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物領域，具體涉及抗病增產枯草芽孢桿菌復合微生物農藥及其制備方法。
【背景技術】
[0002]據(jù)FAO統(tǒng)計，全世界農林業(yè)中每年因各種病害造成的損失占總產值的12%，為了挽回損失，化學農藥起了舉足輕重的作用，但隨著其用量的逐年增加，化學農藥固有的毒性和農藥殘留嚴重污染了人類懶以生存的環(huán)境，破壞了生態(tài)平衡，給人類健康造成極大的威脅，在這種情況下，安全、低毒、高效、無污染、無殘留的生物農藥隨之蓬勃興起，越來越受到重視，其中，微生物農藥以其防治對象不易產生抗藥性，不傷害天敵，對人畜安全，繁殖生產速度快，能充分利用工農業(yè)廢料，適宜于工廠化大生產等優(yōu)點，成為生產無公害農副產品的首選農藥種類。
[0003]枯草芽孢桿菌(bacillus subtillis)作為微生物農藥中的一員，在防治植物病害方面有其獨特的優(yōu)勢:易于生產，抗逆性強，適應性廣，效果穩(wěn)定，功能多(防治病害的同時，還有促進作物生長、增收、增強植物抗病蟲的能力)而備受國內外關注。作為生物殺菌劑枯草芽孢桿菌制劑，美國、日本、德國等已有多個廠商進行產品登記注冊，并進行商品化生產，用于防治蕃茄晚疫病，蔬菜灰霉病和小麥白粉病等，還可作為增產促進劑。我國關于枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究，已達到了世界先進水平，現(xiàn)在開發(fā)成功并小規(guī)模生產的商品有亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧等，田間用于防治黃瓜白粉病、草莓灰霉病、小麥水稻紋枯病等，其效果優(yōu)于或者相當于常用的化學殺菌劑，各種用途的枯草芽孢桿菌其主要活性成份是活的生物體，所以與化學農藥相比，劑型加工更為困難，生防枯草芽孢桿菌在劑型開發(fā)方面相對落后，現(xiàn)在主要有可濕性粉劑、懸浮劑和油劑，這些劑型雖然也各有優(yōu)點，但依然存在芽胞死亡率高、保質期短、殺菌效果不理想、粉塵飄散、對作物附著能力低而造成農用成本增高等諸多自身克服不了的缺點。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種具有防病效果好，使用方便、無粉塵污染、無殘留、對人畜和天敵安全、產品生產工藝簡單，適用于大批量工廠化生產的環(huán)保防病增產的一種抗病增產的生防菌多效復合制劑；本發(fā)明的目的是提供一種抗病增產的生防菌多效復合制劑的制備方法。
[0005]本發(fā)明技術方案如下:一種抗病增產的生防菌多效復合制劑，由下列重量份的原料組成:主藥66.5-85.5份、助劑14.4-35.5份，主藥由1:1的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) Bs-16, CGMCC 編號 1.1216 和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Bs-20, ACCC編號03120兩菌的原液發(fā)酵液組成，助劑為乳化劑、紫外保護劑、抑菌活性增效劑、黏著劑、防凍劑的混合物，其中乳化劑12-30重量份、紫外保護劑0.1 — 1.0重量份、抑菌活性增效劑
0.1—1.0重量份、黏著劑0.2-0.5重量份、防凍劑2.0-3.0重量份。[0006]本發(fā)明的另一個技術方案如下:一種抗病增產的生防菌多效復合制劑，其特征在于它由下列重量份的原料組成:主藥50-60份、助劑33.9-59.3份，主藥由1:1的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) Bs-16, CGMCC 編號 1.1216 和枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis) Bs-20, ACCC編號03120兩菌的濃縮發(fā)酵物組成，助劑為乳化劑、紫外保護劑、抑菌活性增效劑、黏著劑、防凍劑和稀釋劑的混合物，其中乳化劑20-28重量份、紫外保護劑0.1—0.5重量份、抑菌活性增效劑0.1-0.5重量份、黏著劑0.2-0.5重量份、防凍劑
2.0-3.0重量份、稀釋劑11.5-26.8重量份；優(yōu)選的，所述稀釋劑為枯草芽孢桿菌Bs_16和Bs-20兩菌株的共發(fā)酵液經離心后的上清液，本發(fā)明中稀釋劑選用枯草芽孢桿菌發(fā)酵液經離心后的上清液代替水，具有增效和節(jié)約資源的作用。實驗證明枯草芽胞桿菌發(fā)酵上清液對多數(shù)病原菌的拮抗作用也特別顯著。
[0007]枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)Bs_16, CGMCC編號1.1216,購買于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所(100015);枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Bs-20, ACCC編號03120，購買于中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京市中關村南大街12號，中國農業(yè)科學院土壤肥料研究所(100081)。
[0008]優(yōu)選的，所述乳化劑選自阿拉伯膠、西黃蓍膠、十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、吐溫-80、聚甘油酯、農乳300、農乳700、三乙醇胺中的一種或兩種的混合物，兩種物質可選自質量比為2:1的阿拉伯膠和西黃蓍膠，或選自質量比為2:1的聚甘油酯和十二烷基磺酸鈉，或選自質量比為2:1的吐溫-80和十二烷基硫酸鈉，或選自質量比為2:1的吐溫_80和二乙醇胺。
[0009]優(yōu)選的，所述紫外保護劑選自熒光素鈉、剛果紅、茶多酚、七葉靈、甲基綠、對氨基苯甲酸、葉酸、吖啶黃、脫脂牛奶中的一種。
[0010]優(yōu)選的，所述抑菌活性增效劑選自L-絲氨酸、磷酸二氫鈉、糖蜜、蔗糖、甘油、牛血清、亮氨酸、吐溫-80、海藻酸鈉中的一種。
[0011]優(yōu)選的，所述粘著劑選自淀粉、桐油、蓖麻油、糖蜜、脫脂乳粉、酪蛋白、聚氯乙烯膠乳中的一種；
優(yōu)選的，所述防凍劑(也是助乳化劑)選自乙二醇、甘油、聚乙二醇中的一種。
[0012]本發(fā)明第一種技術方案中的一種抗病增產的生防菌多效復合制劑的制備方法，包括以下步驟:
A、制備發(fā)酵液
將枯草芽孢桿菌Bs-16和枯草芽孢桿菌Bs-20兩菌分別在預制備量的現(xiàn)有NYDA培養(yǎng)液中靜置發(fā)酵36-48小時得原液發(fā)酵液，菌數(shù)達101°孢子/ml以上，
B、備料
按權利要求1所列配方備料，所有固體助劑均過100目篩，紫外表面滅菌，液體助劑盡量用新的，以避免污染；
C、乳化
取主藥發(fā)酵液與乳化劑和防凍劑(也是助乳化劑)共置于乳化機中攪拌乳化，
D、加助劑 依次加入紫外保護劑、抑菌活性增效劑、黏著劑于乳化液中，乳化后即得成品，成品為均一透明液體。
[0013]本發(fā)明第二種技術方案中的一種抗病增產的生防菌多效復合制劑的制備方法，包括以下步驟:
A、制備主藥和稀釋劑
將枯草芽孢桿菌Bs-16和枯草芽孢桿菌Bs-20兩菌株分別于27-29°C恒溫靜置發(fā)酵36-48小時得發(fā)酵液，將兩菌株發(fā)酵液一起在離心機中3500-4500轉/分的轉速，于5_10°C溫度下離心10-15分鐘得離心產物，離心沉淀物為主藥，離心上清液作為稀釋劑；
B、備料
按權利要求1所列配方備料，所有固體助劑均過100目篩，紫外表面滅菌，液體助劑盡量用新的，以避免污染；
C、乳化
取主藥發(fā)酵液與乳化劑和防凍劑(也是助乳化劑)共置于乳化機中攪拌乳化，
D、加助劑
加入總配方量50%的稀釋劑乳化30分鐘，再依次加入紫外保護劑、抑菌活性增效劑、黏著劑于乳化液中，再乳化30分鐘，加入剩余50%的稀釋劑使其達預制備的體積量，繼續(xù)攪拌乳化50分鐘，即得成品。
[0014]本發(fā)明生防制劑的劑型介于乳劑和微乳劑之間，屬熱力學穩(wěn)定體系，它是將在水中溶解度較小的微生物及其代謝產物與適量的乳化劑或乳化穩(wěn)定劑，經高速剪切力最終形成粒徑為0.01-20 μ m的水包油型或油包水型均相體系，乳化劑用量比一般乳劑大，但比微乳劑又少，制備這種制劑最關鍵的環(huán)節(jié)是合適乳化劑的選擇，生產成本相對一般水劑和粉劑要高些，但對其生產設備的要求遠比這些劑型要低。另外，它是以水為基質，加之大量乳化劑的使用改變了傳統(tǒng)劑型與作物之間的潤濕性和延展性關系，是一種具有開發(fā)應用價值的生防枯草芽孢桿菌新制劑。本發(fā)明中乳化劑是制備類乳劑的關鍵助劑，其選擇尤為關鍵，應從產品防治效果和成本兩方面權衡。
[0015]本發(fā)明兩株枯草芽孢桿菌其發(fā)酵菌數(shù)高，對紫外線耐受，傳代穩(wěn)定性強(已傳十五代)，二者組合互補對灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、二孢白粉菌和腐霉菌均表現(xiàn)很強的拮抗作用。其生長適宜溫度28-30°C，耐高溫，發(fā)酵液80°C恒溫處理I小時，有效菌數(shù)仍可達IO9Cfu / ml以上；耐酸堿，PH3-9范圍內都可正常生長；NYDA培養(yǎng)液中28°C恒溫培養(yǎng)48h，平均菌數(shù)可達IO11 cfu/ml以上。經室內生物活性測定證明，這兩株生防菌復合使用，對茄果類灰霉病、瓜類猝倒病、白粉病、菜苗立枯病和根腐病有效，平均防效均可達80%以上，而且促進番茄、黃瓜、茄子等種子發(fā)芽和出苗，尤其對番茄灰霉病有特效，平均防效可達90%，增產率達37%。
[0016]本發(fā)明提供的的生防菌復合制劑與其組成的單菌株和陽性對照相比具有以下優(yōu)
占-
^ \\\.(I)擴大抑菌譜，降低使用量。室內外生物活性測定顯示:枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) Bs-16, CGMCC編號1.1216主要對瓜果蔬菜灰霉病、猝倒病有明顯的抑制作用，但對苗期立枯病、根腐病的抑制作用十分微弱；而枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Bs-20, ACCC編號03120對瓜果蔬菜的苗期立枯病、根腐病和白粉病抑制作用十分顯著，對灰霉病抑制作用弱。將二者組合成復合制劑后，可同時有效防治瓜果蔬菜的苗期立枯病、根腐病、白粉病、灰霉病和猝倒病，避免了多次重復用藥。
[0017](2)提高了抑菌活性。復合制劑中兩菌株及其代謝產物之間有協(xié)同增效效應，與各單菌株制劑相比，復合制劑的抑菌活性提高了 20%以上。
[0018](3)延長了有效期。按本發(fā)明配方制備的復合制劑，其有效保質期均在2年以上，比單菌制劑和陽性對照有效時限穩(wěn)定性好。
[0019](4)增產效果顯著。本發(fā)明提供的生防菌復合制劑在促進植物長高、增重方面效果顯著，增產率在20%-30%。
[0020](5)成本降低。與單菌制劑相比，延緩了靶標病原菌的抗藥性的產生，共發(fā)酵使得其生產成本降低了 30%以上，農用成本降低了 30%-50%。
[0021](6)環(huán)保、安全。本發(fā)明提供的生防菌復合制劑主要成份屬于自然界獲得的，助劑也為環(huán)保可降解產品，所以使用中無殘留。用最大一次限量法，以2X IO11個芽孢(孢子)/千克體重的量對小白鼠的急性經口和經皮毒性實驗證明，無致死、致敏和不良反應。
[0022]本發(fā)明提供的產品，每畝用該復合制劑80ml兌入50_60升水中，充分搖勻后可直接用于噴霧作物表面防治其灰霉病、白粉病、枯萎病等真菌病，也可攪種、灌根，用于預防作物幼苗期的猝倒病、立枯病和根腐病等真菌性病害或細菌性病害。同時被保護植物的生長、開花、結果，特別是增產具有十分顯著的促進作用。
[0023]經田間試驗證明本發(fā)明產品對灰霉菌的防治效果達95%以上，對立枯絲核菌達90%以上，對腐爛病的防治效果也達85%以上，持效期延長至12天。與其它乳劑、微乳劑的配方相比，本發(fā)明省略了有機溶劑，且乳化劑選擇對人安全無毒害的產品，保質期可達2年以上，常溫、避光、密封保存即可。所以，可以保證其對人畜安全、對環(huán)境友好。為生物農藥增添一新成員，為枯草芽胞桿菌開辟了更為廣闊的應用前景。
[0024]本發(fā)明產品生產工藝和設備要求簡單，原料來源廣泛易得，易于大規(guī)模工業(yè)化生產。其在水中能迅速均勻分散，抑菌譜廣，增產效果顯著，適用范圍廣。
【具體實施方式】
[0025]下面的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0026]實施例1-6主藥為枯草芽孢桿菌原液發(fā)酵液的多效生防制劑配方(參見表1)，其中各產品均預制備100kg。
【權利要求】
1.一種抗病增產的生防菌多效復合制劑，其特征在于它由下列重量份的原料組成:主藥66.5-85.5份、助劑14.4-35.5份,主藥由1:1的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)Bs-16，CGMCC 編號 1.1216 和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Bs_20，ACCC 編號 03120兩菌的原液發(fā)酵液組成，助劑為乳化劑、紫外保護劑、抑菌活性增效劑、黏著劑、防凍劑的混合物，其中乳化劑12-30重量份、紫外保護劑0.1—1.0重量份、抑菌活性增效劑0.1—1.0重量份、黏著劑0.2-0.5重量份、防凍劑2.0-3.0重量份。
2.一種抗病增產的生防菌多效復合制劑，其特征在于它由下列重量份的原料組成:主藥50-60份、助劑33.9-59.3份,主藥由1:1的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)Bs_16,CGMCC 編號 1.1216 和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Bs_20，ACCC 編號 03120 兩菌的濃縮發(fā)酵物組成，助劑為乳化劑、紫外保護劑、抑菌活性增效劑、黏著劑、防凍劑和稀釋劑的混合物，其中乳化劑20-28重量份、紫外保護劑0.1—0.5重量份、抑菌活性增效劑0.1-0.5重量份、黏著劑0.2-0.5重量份、防凍劑2.0-3.0重量份、稀釋劑11.5-26.8重量份。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種抗病增產的生防菌多效復合制劑，其特征在于:所述乳化劑選自阿拉伯膠、西黃蓍膠、十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、吐溫-80、聚甘油酯、農乳300、農乳700、三乙醇胺中的一種或兩種的混合物。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的一種抗病增產的生防菌多效復合制劑，其特征在于:所述紫外保護劑選自熒光素鈉、剛果紅、茶多酚、七葉靈、甲基綠、對氨基苯甲酸、葉酸、吖啶黃、脫脂牛奶中的一種。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的一種抗病增產的生防菌多效復合制劑,其特征在于:所述抑菌活性增效劑選自L-絲氨酸、磷酸二氫鈉、糖蜜、蔗糖、甘油、牛血清、亮氨酸、吐溫-80、海藻酸鈉中的一種。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的一種抗病增產的生防菌多效復合制劑，其特征在于:所述粘著劑選自淀粉、桐油、蓖麻油、糖蜜、脫脂乳粉、酪蛋白、聚氯乙烯膠乳中的一種。
7.根據(jù)權利要求1或2所述的一種抗病增產的生防菌多效復合制劑，其特征在于:所述防凍劑選自乙二醇、甘油、聚乙二醇中的一種。
8.根據(jù)權利要求2所述的一種抗病增產的生防菌多效復合制劑，其特征在于:所述稀釋劑為枯草芽孢桿菌Bs-16和Bs-20兩菌株的共發(fā)酵液經離心后的上清液。
9.權利要求1所述一種抗病增產的生防菌多效復合制劑的制備方法，其特征在于它包括以下步驟: A、制備發(fā)酵液 將枯草芽孢桿菌Bs-16和枯草芽孢桿菌Bs-20兩菌分別在預制備量的培養(yǎng)液中靜置發(fā)酵36-48小時得原液發(fā)酵液，菌數(shù)達101°孢子/ml以上， B、備料 按權利要求1所列配方備料， C、乳化 取主藥發(fā)酵液與乳化劑和 防凍劑共置于乳化機中攪拌乳化， D、加助劑 依次加入紫外保護劑、抑菌活性增效劑、黏著劑于乳化液中，乳化后即得成品，成品為均一透明液體。
10.權利要求2所述一種抗病增產的生防菌多效復合制劑的制備方法，其特征在于它包括以下步驟: A、制備主藥和稀釋劑 將枯草芽孢桿菌Bs-16和枯草芽孢桿菌Bs-20兩菌株分別于27-29°C恒溫靜置發(fā)酵36-48小時得發(fā)酵液，將兩菌株發(fā)酵液一起在離心機中3500-4500轉/分的轉速，于5_10°C溫度下離心10-15分鐘得離心產物，離心沉淀物為主藥，離心上清液作為稀釋劑； B、備料 按權利要求1所列配方備料， C、乳化 取主藥發(fā)酵液與乳化劑和防凍劑共置于乳化機中攪拌乳化， D、加助劑 加入總配方量50%的稀釋劑乳化30分鐘，再依次加入紫外保護劑、抑菌活性增效劑、黏著劑于乳化液中，再乳化30分鐘，加入剩余50%的稀釋劑使其達預制備的體積量，繼續(xù)攪拌乳化50分鐘，即得成品。
【文檔編號】A01P3/00GK103783085SQ201410049564
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月13日 優(yōu)先權日:2014年2月13日
【發(fā)明者】劉錦霞, 李娜, 李晶, 杜文靜, 張建軍, 丁品, 柳軍璽, 武建榮 申請人:甘肅省科學院生物研究所