使用人工微rna下調(diào)基因表達(dá)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用人工微RNA下調(diào)基因表達(dá)。具體地，本發(fā)明描述了包含前體miRNA分離的核酸片段、人工miRNA以及它們在下調(diào)基因表達(dá)中的用途。
【專利說明】使用人工微RNA下調(diào)基因表達(dá)
[0001] 本申請是申請日為2008年12月17日的中國專利申請200880121660.8 “使用人
工微RNA下調(diào)基因表達(dá)”的分案申請。
[0002]本申請要求于2007年12月18日提交的第61/014，510號美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)，該臨時申請的公開內(nèi)容全文引入本文以供參考。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明的領(lǐng)域一般涉及植物分子生物學(xué)。具體地講，它涉及下調(diào)靶序列表達(dá)的構(gòu)建體和方法。
【背景技術(shù)】
[0004]微RNA(miRNA)僅僅在幾年前被首次鑒定出來，但是已清楚的是，它們在調(diào)芐基因活性中起重要作用。這些20-22核苷酸非編碼RNA能夠經(jīng)由堿基配對與特異性靶mRNA雜交，并且通過介導(dǎo)RNA裂解或翻譯阻抑來下調(diào)這些轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。
[0005]最近的研究已經(jīng)表明，miRNA在發(fā)育期間具有重要功能。在植物中，已經(jīng)表明他們控制多個發(fā)育過程，包括開花時間、葉子形態(tài)學(xué)、器官極性、花形態(tài)學(xué)以及根發(fā)育(綜述于Mallory 和 Vaucheret (2006) Nat Genet38:S31_36 中)。由于 miRNA 的確定的調(diào)節(jié)作用，他們有可能還參與某些主要作物特征例如抗旱性和抗病性。
[0006]miRNA被RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化的和加帽的信使，稱為pri_miRNA。將這些pr1-miRNA加工成更小的轉(zhuǎn)錄物,稱為pre_miRNA,這些前體具有形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能力(參見 Bartel (2004)Cellll6:281-297 Jones-Rhoades MW，Bartel DP, BartelB.MicroRNAS and their regulatory roles in plants.Annu Rev Plant Biol.2006 ；57:19-53。)雖然在后生動物中,pr1-miRNA在細(xì)胞核中通過Drosha被加工成pre-miRNA,并且在細(xì)胞質(zhì)中Dicer裂解pre-miRNA，但是植物中的miRNA成熟與動物中的途徑不同，因為植物缺乏Drosha同系物。反而，除了其在發(fā)夾加工中的已知功能以外，與Dicer同源的RNaseIII 酶 DICER-LIKE1 (DCLl)還可具有 Drosha 功能(Kurihara 和 Watanabe (2004) Proc NatlAcad ScilOl:12753-12758)。
[0007]最近已經(jīng)在擬南芥祀向病毒mRNA序列(Niu等人(2006) NatureBiotechnology24:1420-1428)或內(nèi)源基因(Schwab等人(2006)Plant Celll8:1121-1133)中描述了人工微RNA (amiRNA)。為了改變沉默的空間模式，可在不同啟動子下表達(dá)amiRNA構(gòu)建體(Schwab 等人(2006)Plant Celll8:1121-1133)。人工 miRNA 置換微 RNA 及其在前體miRNA中的互補星狀序列并替代靶向?qū)⒈怀聊膍RNA的序列。內(nèi)源miRNA導(dǎo)致的沉默可見于多種空間上的、時間上的、和發(fā)育表達(dá)上的模式中(Parizotto等人(2007)GeneSDevl8:2237-2242 ;Alvarez 等人(2006)Plant Celll8:1134-51)?？蓸?gòu)建人工 miRNA 以收集和擴(kuò)展沉默模式的多樣性和特異性。迄今仍無在作物植物中使用amiRNA的報道。
[0008]公布于2004年I月29日的W02004/009779描述了用于在植物中調(diào)芐基因表達(dá)的組合物和方法。[0009] 申請人:的受讓人的美國專利申請公布2005/0138689公布于2005年6月23日，描述了 miRNa以及它們沉默靶序列的作用。
[0010]序列表簡沭
[0011]根據(jù)以下的詳細(xì)描述以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細(xì)描述和序列表形成本申請的一部分。
[0012]序列描述概要說明了后附的序列列表。此序列列表中以單個字母表示核苷酸，以單獨的3字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Researchl3:3021-3030 (1985)和Biochemical Journal219 (2):345-373(1984)所描述的 IUPAC-1UB 標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的。
[0013]SEQ ID NO:1-10對應(yīng)于用于擴(kuò)增玉米基因組微RNA(miRNA)前體的引物。
[0014]SEQ ID NO分別對應(yīng)于 159c、164h、168a、169r、和 396h 的玉米 miRNA 前體序列。
[0015]SEQ ID NO: 16對應(yīng)于人工miRNA (amiRNA)序列，該序列用于沉默玉米八氫番茄紅素去飽和酶(ros)轉(zhuǎn)錄。
[0016]SEQ ID NO:17-21 分別對應(yīng)于 159c_PDS、164h_PDS、168a_PDS、169r_PDS、和396h-PDS的amiRNA前體包含的“星狀序列”。星狀序列主要是miRNA前體中的互補序列，miRNA前體與miRNA形成雙鏈。
[0017]SEO ID NO:22-26 分別對應(yīng)于 159c_PDS、164h_PDS、168a_PDS、169r_PDS、和396h-PDS的amiRNA前體。這些前體當(dāng)在玉米中表達(dá)時導(dǎo)致內(nèi)源PDS轉(zhuǎn)錄的沉默。
[0018]SEQ ID NO:27-30 分別對應(yīng)于截短的 amiRNA 前體 169r-PDS-sht、169r-PDS-med、396h-PDS-sht、和 396-PDSied。與 169r_PDS 相比，將 169r_PDS 前體(SEQ ID NO:25)截短了其長度的 11% (169r-PDS-sht, SEQ ID NO:27)和其長度的 35% (169r-PDS_med，SEQID NO:28)。與 396h-PDS 相比，將 396h-PDS 前體(SEQ ID NO:26)截短了其長度的 18%(396h-PDS-sht,SEQ ID NO:29)和其長度的 46% (396h-PDS-med, SEQ ID NO:30)。所有截短的前體包含miRNA和星狀序列。
[0019]SEQ ID NO:31_34 分別對應(yīng)于 159c_FAD、168a_FAD、169r_FAD、和 396h_FAD 的amiRNA前體。這些前體當(dāng)在玉米中表達(dá)時導(dǎo)致內(nèi)源fad2_l (負(fù)責(zé)將油酸轉(zhuǎn)化成亞油酸的脂肪酸去飽和酶)轉(zhuǎn)錄的沉默。
[0020]SEQ ID NO:35_38對應(yīng)于致死葉斑病的miRNA靶和星狀序列。
[0021]SEQ ID NO:39-41對應(yīng)于多藥耐藥性蛋白的miRNA靶和星狀序列，該蛋白是一種轉(zhuǎn)運蛋白。
[0022]SEQ ID NO:42_43 分別對應(yīng)于 168a_MRP 和 396h_MRP 的 amiRNA 前體序列。這些前體當(dāng)在玉米中表達(dá)時導(dǎo)致MRP沉默，MRP導(dǎo)致植酸含量減少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]本發(fā)明涉及包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應(yīng)于如SEQ ID NO:11所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:11的核苷酸430至450被第一可變核苷酸亞序列置換，取決于要減少表達(dá)的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷 酸的范圍內(nèi)，以及(ii)進(jìn)一步地，其中SEQ ID N0:11的核苷酸244至264被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交。
[0024]受關(guān)注的其它分離的核酸片段也包括以下片段:
[0025]a)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應(yīng)于如SEQ IDNO:12所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:12的核苷酸94至114被第一可變核苷酸亞序列置換，取決于要減少表達(dá)的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，以及(ii)進(jìn)一步地，其中SEQ ID NO:12的核苷酸163至183被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；
[0026]b)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應(yīng)于如SEQ IDNO:13所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:13的核苷酸53至73被第一可變核苷酸亞序列置換，取決于要減少表達(dá)的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，以及(ii)進(jìn)一步地，其中SEQ ID NO:13的核苷酸97至117被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；
[0027]c)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應(yīng)于如SEQ IDNO:14所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:14的核苷酸110至130被第一可變核苷酸亞序列置換，取決于要減少表達(dá)的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，以及(ii)進(jìn)一步地，其中SEQ ID NO: 14的核苷酸184至203被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，所述第 可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；以及
[0028]d)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應(yīng)于如SEQ IDNO:15所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO: 15的核苷酸83至103被第一可變核苷酸亞序列置換，取決于要減少表達(dá)的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，以及(ii)進(jìn)一步地，其中SEQ ID NO:15的核苷酸172至192被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交。
[0029]可將這些分離的核酸片段中的任何一種用于制備重組構(gòu)建體，所示重組構(gòu)建體包含這些可操作地連接至至少一個調(diào)控序列的分離核酸片段。
[0030]可將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中以便轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在其基因組中包含重組構(gòu)建體。
[0031]在另一方面，本發(fā)明涉及減少靶基因在植物細(xì)胞中表達(dá)的方法，所述方法包括:
[0032](a)用包含任何一種本文所述分離的核酸片段的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至少一種植物細(xì)胞；以及
[0033](b)選擇那些轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其靶序列的表達(dá)水平在與野生型植物細(xì)胞中的靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較時減少。
【具體實施方式】
[0034]與本申請有關(guān)的信息可參見于2004年10月12日提交的美國專利申請10/963，238和10/963,394。上述專利申請全文引入本文以供參考。
[0035]可用于理解本發(fā)明的其他參考文獻(xiàn)包括于2004年7月I日提交的美國專利申請10/883,374 ;于2004年8月6日提交的美國專利申請10/913,288 ;和于2006年I月6日提交的美國專利申請11/334，776。
[0036]本文中所列出的每篇參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容均全文以引用方式并入本文。
[0037]如本文所用的并在所附的權(quán)利要求書中的單數(shù)形式“一個”和“所述”包括復(fù)數(shù)涵義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵義包括多株該類植物?！耙环N細(xì)胞”的涵義包括一個或多個細(xì)胞及其本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的等同物，等等。
[0038]在此公開的上下文中使用了許多術(shù)語和縮寫。給出了如下定義。
[0039]“微RNA或miRNA”指寡核糖核酸，它調(diào)控包含靶序列的多核苷酸的表達(dá)。微RNA(miRNA)是長度為約19至約24個核苷酸(nt)的已經(jīng)在動物和植物中鑒定出的非編石馬 RNA(Lagos-Quintana 等人，Science294:853-8582001, Lagos-Quintana 等人，Curr.Biol.12:735-7392002 ；Lau 等人，Science294:858-8622001 ；Lee 和 Ambros, Science294:862-8642001 ；Llave 等人，Plant Celll4:1605-16192002 ；Mourelatos 等人，Genes.Dev.16:720-7282002 ；Park 等人，Curr.Biol.12:1484-14952002 ； Re inhart 等人，Genes.Dev.16:1616-16262002),它調(diào)控包含靶序列的多核苷酸的表達(dá)。它們由更長的前體轉(zhuǎn)錄物加工得到，前體轉(zhuǎn)錄物的大小在大約70至2000nt的范圍內(nèi)或者更長，并且這些前體轉(zhuǎn)錄物具有形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能力。在動物中，涉及miRNA前體加工的酶稱為Dicer，這是一種 RNAse II1-樣蛋白(Grishok 等人，Celll06:23-342001 ；Hutvagner 等人，Science293:834-8382001 ;Ketting 等人，Genes.偏差(Dev.) 15:2654-26592001)。植物也具有 Dicer-樣酶，DCLl (以前稱為 CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENS0R1)，并且最近的證據(jù)表明，其象Dicer —樣也涉及發(fā)夾前體的加工以產(chǎn)生成熟miRNA (Park等人，Curr.Biol.12:1484-14952002 ； Re inhart 等人，Genes.Dev.16:1616-16262002)。此外，最近的研究已經(jīng)清楚地表明，至少某些miRNA發(fā)夾前體最初是作為較長的聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄物存在，并且在單個轉(zhuǎn)錄物中可以存在幾個不同的miRNA以及相關(guān)發(fā)夾(Lagos-Quintana等人，Science294:853-8582001 ;Lee 等人，EMBO J21:4663-46702002)。最近的研究還測定了從dsRNA產(chǎn)物的miRNA鏈選擇，所述dsRNA產(chǎn)物是通過DICER加工發(fā)夾而產(chǎn)生的(Schwartz等人，2003，Cellll5:199-208)。似乎所加工的dsRNA的兩個末端的穩(wěn)定性(即G:C vs.A:U含量，和/或錯配)影響鏈選擇，低穩(wěn)定性末端更易于通過解旋酶解旋。低穩(wěn)定性末端的
末端鏈被整合至RISC復(fù)合物內(nèi)，而另一條鏈被降解。
[0040]“pr1-miRNA”或“初級miRNA”是由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄得到的長的、聚腺苷酸化的RNA,它編碼miRNA。“pre-miRNA”是已經(jīng)進(jìn)行了加工以形成較短序列的初級miRNA，該較短序列的RNA具有形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能力，并且可被進(jìn)一步加工以釋放miRNA。在植物中由dicerlik e進(jìn)行兩個加工步驟，因此在功能上區(qū)別“pr1-miRNA”和“pre-miRNA”是困難的。因此，本文將前體miRNA或初級miRNA在功能上定義為能夠產(chǎn)生miRNA的核苷酸序列。根據(jù)該功能定義，以及根據(jù)本文實施例和討論，這一點將是清楚的:前體miRNA、初級miRNA和/或本發(fā)明的miRNA能以“基本上對應(yīng)于”前體miRNA、初級miRNA和/或miRNA的核糖核酸或脫氧核糖核酸的形式表示。應(yīng)當(dāng)理解，以其雙鏈形式存在的DNA將包含一個能夠被轉(zhuǎn)錄成所述miRNA前體的鏈。描述了具有miRNA的表達(dá)構(gòu)建體、重組DNA構(gòu)建體、和轉(zhuǎn)基因生物，該miRNA編碼導(dǎo)致所述miRNA前體表達(dá)的DNA。
[0041 ] “可變核苷酸亞序列”是指置換一部分pre-miRNA序列的一部分核苷酸序列，前提條件是該亞序列不同于被置換的序列，即，它不能是相同的序列。
[0042]“靶基因”指編碼靶RNA的基因，即，從其中轉(zhuǎn)錄靶RNA的基因。該基因可編碼mRNA、tRNA、小 RNA 等。
[0043]“靶基因”指其表達(dá)將被調(diào)節(jié)(例如下調(diào))的RNA。靶序列可以是一部分開放閱讀框、5’或3’非翻譯區(qū)域、外顯子、內(nèi)含子、側(cè)接區(qū)域等。
[0044]“星狀序列”是miRNA前體中的互補序列，miRNA前體與miRNA形成雙鏈。星狀序列的互補序列不需要是完全互補序列。有時存在非螺旋的中斷取代(即G:T堿基配對等)以及1-3個錯配。
[0045]術(shù)語“基因組”是指:(I)存在于生物體的每一個細(xì)胞或者病毒或細(xì)胞器中的全套遺傳物質(zhì)(基因和非編碼序列)；(2)作為(單倍體)單位從一個親本遺傳的全套染色體。
[0046]“子代”包括植物的任何后續(xù)世代。后代將從其親本植物遺傳并且穩(wěn)定地分離基因和轉(zhuǎn)基因。
[0047]單位、前綴和符號可以以其SI接受的形式表示。除非另外說明，核酸是以5'到 方向從左往右寫；氨基酸序列分別是以氨基到羧基方向從左往右寫。本說明書中提及
的數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)字，并且包括在該限定范圍內(nèi)的每一個整數(shù)。在本文中氨基酸可用通常已知的三字母符號或IUPAC-1UB Biochemical Nomenclature Commission推薦的單字母符號表示。同樣，核苷酸可以用其通常接受的單字母代碼表示。除非另有說明，在本文中使用的軟件、電和電子術(shù)語是如在The New IEEE Standard Dictionary ofElectrical and Electronics Terms (第5版，1993)中所定義的。把說明書作為一個整體時，下面定義的術(shù)語就定義得更全面。
[0048]術(shù)語“重組構(gòu)建體”、“表達(dá)構(gòu)建體”、“嵌合構(gòu)建體”、“構(gòu)建體”和“重組DNA構(gòu)建體”本文可互換使用。重組構(gòu)建體包括人造的核酸片段組合，例如天然條件下不一起存在的調(diào)控序列和編碼序列。例如嵌合構(gòu)造可包括源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者包括源于同一來源但以不同于天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。此類構(gòu)建體可獨自使用或與載體組合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于用以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法，該宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。例如可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員熟知為了成功地轉(zhuǎn)化、篩選和繁殖包括本發(fā)明任何分離的核酸片段的宿主細(xì)胞，必須存在于載體上的遺傳元件。技術(shù)人員也將認(rèn)識到不同的獨立轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同水平和不同模式的表達(dá)(Jones 等人，EMBO J.4:2411-2418 (1985) ；De Almeida 等人，Mol.Gen.Genetics218:78-86(1989))，因此，必須篩選多次事件以獲得顯示期望表達(dá)水平和模式的品系。這樣的篩選可以通過DNA的Southern印跡分析、mRNA表達(dá)的Northern印跡分析、蛋白表達(dá)的免疫印跡分析或表型分析等完成。
[0049]該構(gòu)建體可以包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或修飾核苷酸的任何組合。構(gòu)建體可以轉(zhuǎn)錄以形成RNA，其中RNA可以能夠形成雙鏈RNA和/或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。構(gòu)建體可以在細(xì)胞中表達(dá)，或者分 離，或者合成制得。構(gòu)建體還可以包含啟動子或幫助構(gòu)建體操作或表達(dá)的其他序列。
[0050]本文所用"阻抑“或”沉默"或“抑制”可互換使用，是指相對于野生型生物體中其正常表達(dá)水平，靶序列的產(chǎn)物表達(dá)的下調(diào)。抑制包括，相對于野生型表達(dá)水平，表達(dá)降低了約 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100%。
[0051]本文所用術(shù)語“編碼”是指可被加工以產(chǎn)生RNA和/或多肽的DNA序列。
[0052]本文所用術(shù)語“表達(dá)”是指產(chǎn)生功能產(chǎn)物，例如由導(dǎo)入的構(gòu)建體、內(nèi)源DNA序列或穩(wěn)定導(dǎo)入的異源DNA序列產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物。該術(shù)語還可以指由產(chǎn)生自任何上述DNA前體的mRNA產(chǎn)生多肽。因此，核酸片段的表達(dá)可以指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(例如生成mRNA或其他功能RNA的轉(zhuǎn)錄)和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白(多肽)。
[0053]本文在序列方面所用的“異源”是指，源自外來物種的序列，或者，如果源自相同物種，通過人為介入而從其天然形式在組成和/或基因組基因座方面顯著修飾的序列。例如，對于核酸，其可以是源自外來物種的核酸，或者是合成設(shè)計的核酸，或者，如果源自相同物種，通過人為介入而從其天然形式在組成和/或基因組基因座方面顯著修飾的核酸。異源蛋白可以源自外來物種，或者，如果源自相同物種，通過人為介入而從其起源形式顯著修飾。
[0054]術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指含有或者其中導(dǎo)入核酸構(gòu)建體，并且支持該構(gòu)建體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞例如大腸桿菌(E.coli)，或真核細(xì)胞例如真菌、酵母、昆蟲、兩棲動物、線蟲或哺乳動物細(xì)胞?；蛘?，宿主細(xì)胞是單子葉植物或雙子葉植物細(xì)胞。單子葉植物宿主細(xì)胞的一個實例是玉米宿主細(xì)胞。
[0055]“植物”包括整個植株、植物器官、植物組織、種子和植物細(xì)胞以及同一植株的子代。植物細(xì)胞包括但不限于 得自下列物質(zhì)的細(xì)胞:種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。
[0056]術(shù)語“植物部分”包括分化和未分化的組織，包括但不限于下列部分:根、莖、芽、葉、花粉、種子、腫瘤組織和多種形式的細(xì)胞和培養(yǎng)物(例如單個細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚和愈傷組織)。植物組織可存在于植株或植物器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中。
[0057]術(shù)語“植物器官”是指構(gòu)成植株的形態(tài)和功能不同部分的植物組織或組織群。
[0058]術(shù)語“導(dǎo)入”是指將核酸(例如表達(dá)構(gòu)建體)或蛋白提供至細(xì)胞中。導(dǎo)入包括指將核酸整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸可以整合進(jìn)細(xì)胞的基因組內(nèi)，以及包括指將核酸或蛋白暫時提供給細(xì)胞。導(dǎo)入包括指穩(wěn)定的或暫時性的轉(zhuǎn)化方法以及有性雜交。因此，將核酸片段(例如重組DNA構(gòu)建體/表達(dá)構(gòu)建體)插入細(xì)胞內(nèi)的情況下的“導(dǎo)入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸片段可以整合進(jìn)細(xì)胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)、轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子或瞬時表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0059]在應(yīng)用于植物細(xì)胞時，術(shù)語“基因組”不僅包括在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)的染色體DNA，而且還包括在細(xì)胞的亞細(xì)胞成分(例如線粒體、質(zhì)體)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器DNA。
[0060]術(shù)語“分離的”是指材料例如核酸或蛋白，其:(1)基本上或本質(zhì)上不含通常伴隨在其天然存在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的材料或者與在其天然存在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的材料相互作用的成分，或者(2)如果材料在其天然環(huán)境中，則已經(jīng)通過人為介入改變了材料的組成和/或在細(xì)胞基因座上放置了不是該材料的天然基因座的基因座。
[0061]本文所用的“結(jié)構(gòu)域”或“功能結(jié)構(gòu)域”是指能夠引起植物中的生物反應(yīng)的核酸序列。本發(fā)明涉及由單獨起作用或者與其他miRNA序列協(xié)同起作用的至少21核苷酸序列組成的miRNA。由此，結(jié)構(gòu)域可以指個體miRNA或miRNA群。而且，與其骨架序列有關(guān)的miRNA序列可以被認(rèn)為是用于將miRNA加工成其活性形式的結(jié)構(gòu)域。本文所用的“亞結(jié)構(gòu)域”或“亞功能結(jié)構(gòu)域”是指能夠引起植物中的生物反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域的亞序列。miRNA可以被認(rèn)為是骨架序列的亞結(jié)構(gòu)域。“鄰接”序列或結(jié)構(gòu)域是指順序連接的，在結(jié)構(gòu)域之間沒有加入的核苷酸插入的序列。鄰接結(jié)構(gòu)域串的一個實例存在于SEQ ID NO:7957中，其代表作為連續(xù)串的SEQ ID NO:1-2652，據(jù)信該連續(xù)串可以是以順序串聯(lián)而連接在一起的2652miRNA序列。
[0062]RNA干擾是指由短干擾性RNA(SiRNA)介導(dǎo)的動物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程(Fire等人，Nature391 =8061998)。在植物中的對應(yīng)過程通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也稱為阻抑作用(quelling)。據(jù)信轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程是用于防止外來基因表達(dá)的進(jìn)化保守的細(xì)胞防御機制，并且通常由不同植物區(qū)系和門所共享(Fire等人，Trends Genet.15:3581999)。這種防止外來基因表達(dá)的保護(hù)作用可能是通過特異性破壞病毒基因組RNA的同源單鏈RNA的細(xì)胞反應(yīng)，響應(yīng)源自病毒感染或源自轉(zhuǎn)座因子隨機整合到宿主基因組內(nèi)的雙鏈RNA(dsRNA)的生成而進(jìn)化而來。dsRNA在細(xì)胞中的存在通過還沒有完全表征的機制引發(fā)了 RNAi反應(yīng)。
[0063]細(xì)胞中長dsRNA的存在刺激稱為“dicer”的核糖核酸酶III酶的活性。Dicer參與dsRNA加工成稱為短干擾性RNA(siRNA)的dsRNA的短片段(Berstein等人.，Nature409:3632001)和/或pre miRNA加工成miRNA。源自dicer活性的短干擾性RNA的長度通常是約21至約23個核苷酸，并且包含約19個堿基對雙鏈體(Elbashir等人，Genes Dev.15:1882001)。還有人提出Dicer參與從保守結(jié)構(gòu)的前體RNA上切下21-和22-核苷酸小的時序RNA(stRNA)，所述小的時序 RNA 參與翻譯控制(Hutvagner 等人,2001, Science293:834)。RNAi響應(yīng)還涉及內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，通常稱為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，其介導(dǎo)具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補的序列的單鏈RNA的裂解。靶RNA的裂解在與siRNA雙鏈體的反義鏈互補的區(qū)域中間發(fā)生(Elbashir等人，Genes Dev.15:1882001)。此外，RNA干擾還涉及小RNA(例如微RNA或miRNA)介導(dǎo)的基因沉默，假定是經(jīng)由調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并由此防止靶基因序列轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞機制(參見，例如，Allshire，Science297:1818-18192002 ；Volpe等人，Science297:1833-18372002 Jenuwein, Science297:2215-22182002 ;和 Hall 等人，Science297:2232-22372002)。這樣，本發(fā)明的miRNA分子可用于通過與RNA轉(zhuǎn)錄物相互作用或者作為另一種選擇通過與特定基因序列相互作用來介導(dǎo)基因沉默，其中這樣的相互作用導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默。
[0064]已經(jīng)在多種系統(tǒng)中研究了 RNAi。(Nature391:8061998)首次在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中觀察到 RNAi。Wianny 和 Goetz (Nature Cell Biol.2:701999)描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介導(dǎo)的RNAi。Hammond等人(Nature404:2932000)描述了在用dsRNA轉(zhuǎn)染的果妮(Drosophila)細(xì)胞中的 RNAi。Elbashir 等人,(Natur e411:4942001)描述了通過在包括人胚胎腎和HeLa細(xì)胞 的培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中導(dǎo)入合成21-核苷酸RNA的雙鏈體而誘導(dǎo)的RNAi。
[0065]小RNA在控制基因表達(dá)中起重要作用。很多發(fā)育過程(包括開花)的調(diào)節(jié)是由小RNA控制的?，F(xiàn)在有可能通過使用在植物中產(chǎn)生小RNA的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體來以工程手段改變植物基因的基因表達(dá)。[0066]小RNA似乎是通過與互補RNA或DNA靶序列堿基配對來行使功能的。當(dāng)與RNA結(jié)合時，小RNA或者引發(fā)靶序列的RNA裂解或者引發(fā)翻譯抑制。當(dāng)與DNA靶序列結(jié)合時，據(jù)信小RNA可介導(dǎo)靶序列的DNA甲基化。無論具體機制是什么，這些事件的后果是基因表達(dá)受到抑制。
[0067]微RNA(miRNA)是長度為約19至約24個核苷酸(nt)的已經(jīng)在動物和植物中鑒定出的非編碼 RNA(Lagos-Quintana 等人，Science294:853-8582001, Lagos-Quintana 等人，Curr.Biol.12:735-7392002；Lau 等人，Science294:858-8622001 ；Lee 和 Ambros,Science294:862-8642001 ；Llave 等人，Plant Celll4:1605-16192002 ；Mourelatos 等人，Genes.Dev.16:720-7282002 ；Park 等人，Curr.Biol.12:1484-14952002 ；Reinhart 等人，Genes.Dev.16:1616-16262002)。它們是由大小為大約70至200nt的較長的前體轉(zhuǎn)錄物加工生成的，并且這些前體轉(zhuǎn)錄物能夠形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在動物中，涉及miRNA前體加工的酶稱為 Dicer，這是一種 RNAse II1-樣蛋白(Grishok 等人，Celll06:23-342001 ；Hutvagner 等人，Science293:834-8382001 ；Ketting 等人，Genes.偏差(Dev.) 15:2654-26592001)。植物也具有 Dicer-樣酶，DCLl (以前稱為 CARPEL FACTORY/SHORTINTEGUMENTS1/SUSPENS0R1)，并且最近的證據(jù)表明，其象Dicer —樣也涉及發(fā)夾前體的加工以產(chǎn)生成熟 miRNA (Park 等人，Curr.Biol.12: 1484-14952002 ； Re inhart 等人，Genes.Dev.16:1616-16262002)。此外，最近的研究已經(jīng)清楚地表明，至少某些miRNA發(fā)夾前體最初是作為較長的聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄物存在，并且在單個轉(zhuǎn)錄物中可以存在幾個不同的miRNA以及相關(guān)發(fā)夾(Lagos-Quintana 等人，Science294:853-8582001 ；Lee 等人，EMBO J21:4663-46702002)。最近的研究還測定了從dsRNA產(chǎn)物的miRNA鏈選擇，所述dsRNA產(chǎn)物是通過DICER加工發(fā)夾而產(chǎn)生的(Schwartz等人，2003，Cellll5:199-208)。似乎所加工的dsRNA的兩個末端的穩(wěn)定性(即G:C vs.A:U含量,和/或錯配)影響鏈選擇，低穩(wěn)定性末端更易于通過解旋酶解旋。低穩(wěn)定性末端的5'末端鏈被整合至RISC復(fù)合物內(nèi)，而另一條鏈被降解。
[0068]在動物中，有直接的證據(jù)表明特異性miRNA在發(fā)育中的作用?；诋?dāng)產(chǎn)生lin_4和let-7miRNA的基因突變時所產(chǎn)生的表型，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲(Celegans)中的 I in-4 和 let_7miRNA 控制時序發(fā)育(Lee 等人，Cell75:843-8541993 ； Re inhart 等人，Nature403-901-9062000)。此外，這兩種miRNA都表現(xiàn)出與其在發(fā)育定時中的作用一致的時序表達(dá)模式。其他動物miRNA表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的表達(dá)模式，是時序和組織特異性的(Lagos-Quintana 等人，Science294:853-8532001, Lagos-Quintana 等人，Curr.Biol.12:735-7392002 ;Lau 等人，Science294:858-8622001 ；Lee 和 Ambros，Science294:862-8642001)，導(dǎo)致這樣的假設(shè)，在很多情況下，miRNA可能涉及重要發(fā)育過程的調(diào)節(jié)。同樣，在植物中，很多miRNA的差異表達(dá)模式意味著其在發(fā)育中的作用(Llave等人，PlantCelll4:1605-16192002 ；Park 等人，Curr.Biol.12:1484-14952002 ；Reinhart 等人，Genes.Dev.16 =1616-16262002)。然而，miRNA的發(fā)育作用尚未在植物中直接證實，因為迄今為止沒有關(guān)于特異性植物miRNA相關(guān)發(fā)育表型的報道。
[0069]微RNA看起來通過與位于由這些基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物中的互補序列結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因。對于lin-4和let-7，靶位點位于靶mRNA的3 ' UTR中(Lee等人，Cell75:843-8541993 ；ffightman 等人，Cell75:855-8621993 ；Reinhart 等人，Nature403:901-9062000 ;Slack 等人，Mol.Cell5:659-6692000)，并且在 lin-4 和 let_7miRNA 與其革巴位點之間有幾個錯配。結(jié)合lin-4或let-7miRNA似乎引起由祀miRNA編碼的蛋白的穩(wěn)態(tài)水平的下調(diào)，而不影響自身的轉(zhuǎn)錄物(Olsen和Ambros, Dev.Biol.216 =671-6801999)。另一方面，最近有證據(jù)表明，在某些情況下，miRNA可引起靶轉(zhuǎn)錄物在靶位點內(nèi)特異性RNA裂解(Hutvagner 和 Zamore, Science297:2056-20602002 ；Llave 等人，Plant Celll4:1605-16192002)。看起來有可能miRNA可進(jìn)入至少兩條靶基因調(diào)控途徑:蛋白下調(diào)和RNA裂解。進(jìn)入RNA裂解途徑的微RNA摻入了 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，該復(fù)合物與RNAi相似或相同。
[0070]本發(fā)明涉及包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應(yīng)于如SEQ ID NO: 11所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO: 11的核苷酸430至450被第一可變核苷酸亞序列置換，取決于要減少表達(dá)的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，以及(ii)進(jìn)一步地，其中SEQ ID N0:11的核苷酸244至264被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交。
[0071]該分離的核酸片段包含前體miRNA，也可稱為“miRNA主鏈”。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知區(qū)分轉(zhuǎn)錄物是全長pr1-miRNA或是pre-miRNA是困難的。因此,將前體miRNA功能定義為能夠生產(chǎn)miRNA的核苷酸序列。
[0072]受關(guān)注的其它分離的核酸片段包括以下片段；
[0073]a)從包含前體miRNA的分離的核酸片段轉(zhuǎn)錄得到的片段，所述前體miRNA基本上對應(yīng)于如SEQ ID NO: 12所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID N0:12的核苷酸94至114被第一可變核苷酸亞序列置換，取決于要減少表達(dá)的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，以及(ii)進(jìn)一步地，其中SEQ ID NO:12的核苷酸163至183被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；
[0074]b)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應(yīng)于如SEQ IDNO:13所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:13的核苷酸53至73被第一可變核苷酸亞序列置換，取決于要減少表達(dá)的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，以及(ii)進(jìn)一步地，其中SEQ ID NO:13的核苷酸97至117被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；
[0075]c)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應(yīng)于如SEQ IDNO:14所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:14的核苷酸110至130被第一可變核苷酸亞序列置換，取決于要減少表達(dá)的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，以及(ii)進(jìn)一步地，其中SEQ ID NO: 14的核苷酸184至203被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；以及
[0076]d)包含前體m iRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應(yīng)于如SEQ IDNO:15所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO: 15的核苷酸83至103被第一可變核苷酸亞序列置換，取決于要減少表達(dá)的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，以及(ii)進(jìn)一步地，其中SEQ ID NO:15的核苷酸172至192被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的范圍內(nèi)，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交。
[0077]可將這些分離的核酸片段中的任何一種用于制備重組構(gòu)建體，所示重組構(gòu)建體包含這些可操作地連接至至少一個調(diào)控序列的分離核酸片段。
[0078]可將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中以便轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在其基因組中包含重組構(gòu)建體。優(yōu)選地植物細(xì)胞可以是單子葉植物植物細(xì)胞。單子葉植物細(xì)胞的實例包括但不限于玉米、高梁、小麥、大米、燕麥、裸麥、大麥、甘鹿、小米、竹子、香蕉和蘭花
[0079]最優(yōu)選的單子葉植物細(xì)胞是玉米。
[0080]在另一方面，本發(fā)明涉及減少靶序列在植物細(xì)胞中表達(dá)的方法，所述方法包括:
[0081](a) 用包含任何一種本文所述分離的核酸片段的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至少一種植物細(xì)胞；以及
[0082](b)選擇那些轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其靶序列的表達(dá)水平在與野生型植物細(xì)胞中的靶序列表達(dá)水平進(jìn)行比較時減少。
[0083]生物信息學(xué)方法已經(jīng)成功地用于預(yù)測植物miRNA的祀標(biāo)(Llave等人，PlantCelll4:1605-16192002 ；Park 等人，Curr.Biol.12:1484-14952002 ；Rhoades 等人，CellllO =513-5202002)，因此，似乎植物miRNA與其推定靶的整個互補性高于動物miRNA。植物miRNA的這些預(yù)測靶標(biāo)中的大部分編碼涉及植物發(fā)育模式或細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。
[0084]所關(guān)注序列的一般種類包括例如涉及調(diào)節(jié)或信息的基因，例如鋅指、轉(zhuǎn)錄因子、同源異型基因，或細(xì)胞周期和細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑例如激酶，以及涉及持家的基因，例如熱激蛋白。
[0085]靶序列可包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)如啟動子、增強子、終止子、內(nèi)含子等。
[0086]靶序列可以是內(nèi)源性序列，或者可以是導(dǎo)入的異源序列或轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明方法可用于改變轉(zhuǎn)基因的調(diào)節(jié)或表達(dá)，或用于除去轉(zhuǎn)基因或其他導(dǎo)入的序列例如導(dǎo)入的位點特異性重組位點。靶序列還可以是來自病原體的序列，例如，靶序列可以來自植物病原體例如病毒、霉菌或真菌，昆蟲或線蟲。miRNA可以在植物中表達(dá)，這樣在感染或侵染之后，植物將靶向病原體并且給植物賦予一定程度的抗性。
[0087]在植物中，靶序列的其他種類包括影響農(nóng)學(xué)特征、抗昆蟲性、抗病性、抗除草劑性、不育、谷粒特征和商品的基因。所關(guān)注基因應(yīng)當(dāng)還包括涉及油、淀粉、糖類或營養(yǎng)物代謝的那些，以及影響例如種仁大小、蔗糖載量等的那些。谷粒質(zhì)量在特征中反應(yīng)，例如油的水平和類型，飽和與不飽和，必需氨基酸的質(zhì)量和量，以及纖維素水平。例如，可抑制植酸生物合成途徑的基因以產(chǎn)生高可利用磷表型。參見例如在W002/059324中公開的植酸生物合成酶，包括肌醇多磷酸激酶-2多核苷酸，在W003/027243中公開的肌醇I，3，4-三磷酸5/6-激酶多核苷酸，以及在W099/05298中公開的肌醇1_磷酸合成酶和其他植酸生物合成多核苷酸，所有這些專利都引入本文以供參考?？梢种颇举|(zhì)化途徑中的基因來提高消化性或能量利用率。可抑制影響細(xì)胞周期或細(xì)胞死亡的基因來抑制生長或應(yīng)激反應(yīng)?？梢种朴绊慏NA復(fù)制和/或重組的基因以提高遺傳變異性。可抑制影響開花時間的基因以及影響能育性的基因?？梢种迫魏伟行蛄幸栽u估或證實其在特定特征或表型中的作用，或切開分子、調(diào)節(jié)、生化或蛋白組學(xué)(proteomic)途徑或網(wǎng)絡(luò)。
[0088]可使用多種啟動子。能基于所需結(jié)果選擇這些啟動子。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，通過在植物表達(dá)盒中使用不同啟動子來提高不同應(yīng)用，以調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)的時間、位置和/或水平。如果需要的話，這樣的植物表達(dá)盒可以含有啟動子調(diào)節(jié)區(qū)(例如賦予誘導(dǎo)型、組成型、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的、或細(xì)胞或組織特異性/選擇性表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))，轉(zhuǎn)錄起始開始位點、核糖體結(jié)合位點、RNA加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點和/或聚腺苷酸化信號。
[0089]可以采用組成型、組織優(yōu)先型或誘導(dǎo)型啟動子。組成型啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，源自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的I'-或2'-啟動子，遍在蛋白I啟動子，Smas啟動子，肉桂醇脫氫酶啟動子(美國專利5，683，439)，Nos啟動子，pEmu啟動子，rubiSco啟動子，GRP1-8啟動子，以及來自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種植物基因的其他轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。如果需要低水平的表達(dá)，可以使用弱啟動子。弱組成型啟動子包括例如Rsyn7啟動子的核心啟動子(W099/43838和美國專利6，072，050)，核心35S CaMV啟動子等。其他組成型啟動子包括例如美國專利5，608，149 ；5，608，144 ;5，604，121 ;5，569，597 ;5，466，785 ;5，399，680 ;5，268，463 ；和 5，608，142。還參見美國專利6，177，611，其引入本文以供參考。
[0090]誘導(dǎo)型啟動子的是可以通過低氧或寒冷脅迫誘導(dǎo)的Adhl啟動子，可通過熱脅迫誘導(dǎo)的Hsp70啟動子,PPDK啟動子和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepcarboxylase)啟動子,二者都是可通過光誘導(dǎo)的。還有用的啟動子有，是可化學(xué)誘導(dǎo)的啟動子，例如是安全劑誘導(dǎo)的In2-2啟動子(美國專利5，364，780)，是雌激素誘導(dǎo)的ERE啟動子，以及是植物生長素誘導(dǎo)的，并且是絨氈層(tapetum)特異性的，但是在愈傷組織中也有活性的Axigl啟動子(PCTUS01/22169)。
[0091]處于發(fā)育控制下的啟動子的實例包括優(yōu)先在一些組織例如葉、根、果實、種子或花中啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子。示例性啟動子是花藥特異性啟動子5126 (美國專利5，689，049和5，689，051)。種子優(yōu)先的啟動子的實例包括但不限于27kD g玉米醇溶蛋白啟動子和臘狀啟動子，Boronat, A.等人(1986) Plant Sc1.47:95-102 ；Reina, Μ.等人 Nucl.AcidsRes.18(21):6426 ;和 Kloesgen，R.B.等人(1986)Mol.Gen.Genet.203:237_244。在胚芽、果皮和胚乳中表達(dá)的啟動子公開在US專利6，225，529和PCT出版W000/12733中。這些專利的公開內(nèi)容全文引入本文以供參考。
[0092]在某些實施方案中，由誘導(dǎo)型啟動子，特別是由病原體誘導(dǎo)型啟動子表達(dá)基因是有益的。這樣的啟動子包括源自發(fā)病機理相關(guān)蛋白(PR蛋白)的那些，其是在被病原體感染后誘導(dǎo)的，所述蛋白是例如PR蛋白、SAR蛋白、b-Ι，3-葡聚糖酶，殼多糖酶等。參見例如Redolfi 等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254 ；Uknes 等人(1992)Plant Cell4:645-656;和 Van Loon (1985) Plant Mol.Virol.4:111_116。還參見 W099/43819，其引入本文以供參考。
[0093]所關(guān)注的啟動子是在 病原體感染部位或接近病原體感染部位局部表達(dá)的啟動子。參見例如Marineau等人(1987) Plant Mol.Biol.9:335-342 ;Matton等人(1989)MolecularPlant-Microbe Interactions〗:325-331 ;Somsisch 等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:2427-2430 ；Somsisch 等人(1988)Mol.Gen.Genet.2:93-98 ；和 Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:14972-14977。還參見 Chen 等人(1996) Plant J.10:955-966 ；Zhang等人(1994) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:2507-2511 ;Warner 等人(1993) Plant J.3:191-201 ；Siebertz 等人(1989) Plant Celll:961-968 ;美國專利 5，750，386 (線蟲誘導(dǎo)型)；以及其中所引用的參考文獻(xiàn)。特別關(guān)注的是有關(guān)玉米PRms基因的誘導(dǎo)型啟動子，其表達(dá)是由病原體串珠鐮孢菌(Fusarium moniIiforme)誘導(dǎo)的(參見例如Cordero等人
(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189-200)。
[0094]此外，在病原體發(fā)現(xiàn)經(jīng)由傷口或昆蟲損害而找到進(jìn)入植物的入口時，傷口誘導(dǎo)型啟動子可用于多核苷酸的構(gòu)建。這樣的傷口誘導(dǎo)型啟動子包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28:425-449 ;Duan 等人(1996)NatureBiotech.14:494-498) ；wunl 和 wun2,美國專利 5, 428,148 ；winl 和 win2 (Stanford 等人(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208);系統(tǒng)素(McGurl 等人(1992)Science225:1570-1573) ；WIP1(Rohmeier 等人(1993)Plant Mol.Biol.22:783-792 ；Eckelkamp 等人
(1993)FEBS Lett.323:73-76) ;MPI 基因(Corderok 等人(1994) Plant J.6 (2):141-150)；等，其引入本文以供參考。
[0095]化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動子可用于通過施用外來化學(xué)調(diào)節(jié)劑來調(diào)芐基因在植物中的表達(dá)。根據(jù)這一目標(biāo)，啟動子可以是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，其中施用化學(xué)物質(zhì)來誘導(dǎo)基因表達(dá)，或化學(xué)抑制型啟動子，其 中施用化學(xué)物質(zhì)來抑制基因表達(dá)。化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于玉米In2-2啟動子，其是通過苯磺酰胺除草劑安全劑來激活的，玉米GST啟動子，其是通過用作芽前除草劑的疏水親電性化合物而激活的，以及煙草PR-1a啟動子，其是通過水楊酸激活的。所關(guān)注的其他化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動子包括留類化合物反應(yīng)性啟動子(參見例如糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子，Schena等人(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.14(2):247-257)，以及四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素抑制型啟動子(參見例如Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227:229_237，和美國專利5，814，618和5，789，156)，其引入本文以供參考。
[0096]組織優(yōu)先的啟動子可用于定向提高特定植物組織內(nèi)的序列的表達(dá)。組織優(yōu)先的啟動子包括 Yamamoto 等人(1997) Plant J.12 (2):255-265 ;Kawamata 等人(1997) PlantCell Physiol.38(7):792-803 ;Hansen 等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343;Russell 等人(1997)Transgenic Res.6(2):157-168 ;Rinehart 等人(1996)PlantPhysiol.112(3):1331-1341 ；Van Camp 等人(1996)Plant Physiol.112(2):525-535;Canevascini 等人(1996)Plant Physiol.112(2):513-524 ；Yamamoto 等人(1994)PlantCell Physiol.35(5):773-778 ;Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196 ；Orozco 等人(1993) Plant Mol Biol.23 (6):1129-1138 ;Matsuoka 等人(1993) Proc Natl.Acad.Sc1.USA90 (20):9586-9590 ;和 Guevara-Garcia等人(1993) Plant J.4(3):495_505。如果需要的話，可修飾這樣的啟動子以進(jìn)行弱表達(dá)。
[0097]葉優(yōu)先的啟動子是本領(lǐng)域已知的。參見例如Yamamoto等人(1997) PlantJ.12(2):255-265 ；Kwon 等人(1994)Plant Physiol.105:357-67 ;Yamamoto 等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778 ;Gotor 等人(1993)Plant J.3:509-18 ;0rozco 等人(1993) Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138 JPMatsuoka 等人(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (20):9586-9590。此外，可以使用cab和rubisco的啟動子。參見例如Simpson等人(1958)EMBO J4:2723-2729 和 Timko 等人(1988)Nature318:57_58。
[0098]根優(yōu)先的啟動子是已知的，并且可以選自文獻(xiàn)中記載的很多啟動子或者從不同相容物種中重新分離的啟動子。參見例如Hire等人(1992) Plant Mol.Biol.20 (2):207-218 (大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner (1991)PlantCell3(10):1051-1061(法國菜豆的GRP1.8基因的根特異性控制元件);Sanger等人(1990)Plant Mol.Biol.14 (3):433-443 (根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特異性啟動子)JPMiao等人(1991)Plant Cell3(l):11-22(編碼胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達(dá))。還參見Bogusz等人(1990)Plant Cell2(7):633_641，其中描述了兩種根特異性啟動子，它們是從得自固氮非豆科(nonlegume)Parasponia andersonii以及相關(guān)非固氮非豆科(nonlegume)山麻黃(Trema tomentosa)的血紅蛋白基因分離的。將這些基因的啟動子與β -葡糖醒酸酶報道基因連接，并且導(dǎo)入非豆科(nonlegume)煙草(Nicotiana tabacum)和豆科百脈根(Lotus corniculatus)內(nèi)，在這兩種情況下,都保持了根特異性啟動子活性。Leach和Aoyagi (1991)描述了他們對于發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表達(dá)的rolC和rolD根誘導(dǎo)基因的啟動子的分析(參見Plant Science (Limerick) 79 (I):69-76)。他們推斷，增強 子和組織特異性DNA決定子在這些啟動子中解離。Teeri等人(1989)使用與IacZ的基因融合以表明編碼章魚堿合酶的農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)菌T-DNA基因在根尖的表皮中具有特別活性，以及TR2'基因在完整植物中是根特異性的，并且通過葉組織中的傷害來刺激，這是用來與殺蟲或殺幼蟲基因一起使用的特別期望的特征組合(參見EMBO J.8 (2) =343-350) 0與nptll (新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TRl'基因表現(xiàn)出類似特征。另外的根優(yōu)選的啟動子包括VfEN0D-GRP3基因啟動子(Kuster等人(1995) Plant Mol.Biol.29(4):759-772) JProlB 啟動子(Capana 等人(1994) Plant Mol.Biol.25(4):681-691。還參見美國專利 5,837,876 ;5，750，386 ；5, 633,363 ;5，459，252 ；5，401,836 ;5，110，732 ;和5，023，179。云扁豆蛋白(Murai 等人(1983) Science23:476-482和 Sengopta-Gopalen 等人(1988)PNAS82:3320_3324。
[0099]轉(zhuǎn)化方案以及用于將核苷酸序列導(dǎo)入植物內(nèi)的方案可以根據(jù)被定向轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的類型，例如單子葉植物或雙子葉植物而改變。導(dǎo)入DNA構(gòu)建體的合適的方法包括微注射(Crossway 等人(1986) Biotechniques4:320-334 ;和美國專利 6, 300, 543)，性雜交，電穿孔(Riggs 等人(1986) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:5602-5606),農(nóng)桿菌屬菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Townsend等人，美國專利5，563，055 ;和美國專利5，981，840)，直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski 等人(1984) EMBO J.3:2717-2722)，和彈道離子加速(參見例如 Sanford 等人，美國專利4，945，050 ；Tomes等人，美國專利5，879，918 ；Tomes等人，美國專利5，886，244 ;Bidney 等人,美國專利 5,932, 782 ;Tomes 等人(1995) “Direct DNA Transfer intoIntact Plant Cells via Microproj ectile Bombardment,，，in Plant Cell,Tissue,andOrgan Culture-Fundamental Methods, ed.Gamborg and Phillips (Springer-Verlag,Berlin)；和 McCabe 等人(1988)Biotechnology6:923-926)。還參見 Weissinget 等人(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477 ;Sanford 等人(1987)Particulate Science andTechnology5:27-37(洋蔥)；Christou 等人(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆);Finer 和 McMullen (1991) In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182 (大豆)；Singh 等人(1998) Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta 等人(I99O)Biotechnology8:736-740(稻)；Klein 等人(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4305-4309 (玉米)；Klein等人(1988) Biotechnology6:559-563 (玉米)；Tomes,美國專利 5, 240,855 ；Buising 等人，美國專利 5，322，783 和 5，324，646 ；Klein 等人(1988) Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm 等人(1"0) Biotechnology8:833-839 (玉米)；Hooykaas_Van Slogteren 等人(1984) Nature (London) 311:763-764 ；Bowen 等人，美國專利 5, 736, 369 (谷類)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:5345-5349(百合科)；De Wet 等人(1985)，TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues, ed.Chapman 等人(Longman, New York),第 197-209 頁(花粉);Kaeppler 等人(1990)Plant Cell Reports9:415-418 和 Kaeppler等人(1992) Theor.Appl.Genet.84:560-566 (頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化);D' Halluin 等人(1992)Plant Cell4:1495-1505(電穿孔)；Li 等人(1993)Plant Cell R印ortsl2:250-255 和Christou 和 Ford (1995) Anbals of Botany75:407-413 (稻);0sioda 等人(1996) NatureBiotechnologyl4:745-750 (經(jīng)由根癌土壤桿菌的玉米);和美國專利5，736，369 (分生組織轉(zhuǎn)化)，所有這些文獻(xiàn)都引入本文以供參考。
[0100]可通過將植物與病毒或病毒核酸接觸來將核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物內(nèi)。通常，這樣的方法包括將本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體整合進(jìn)入病毒DNA或RNA分子內(nèi)。此外，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，有用的啟動子包括用于通過病毒RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟動子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于將核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物內(nèi)并且表達(dá)其中編碼的蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如美國專利公開 5,889,191,5,889,190,5,866, 785,5,589, 367 和 5,316, 931 ;這些專利引入本文以供參考。
[0101]在某些實施方案中，瞬時表達(dá)可能是期望的。在這些情況下，可使用標(biāo)準(zhǔn)瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)。這樣的方法包括但不限于病毒轉(zhuǎn)化方法，和DNA或RNA的微注射，以及本領(lǐng)域眾所周知的其他方法。
[0102]可根據(jù)常規(guī)方法，將得自已經(jīng)穩(wěn)定摻入核苷酸序列的植物的細(xì)胞生長成植物。參見例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5:81_84。然后可讓這些植物生長，并且用相同的轉(zhuǎn)化株或不同的株授粉，所得雜交體具有所希望的表型特征的組成型表達(dá)，所述表型特征是由包含在靶位點或轉(zhuǎn)移盒內(nèi)的所關(guān)注核苷酸序列盒/或遺傳標(biāo)記賦予的。可以生長兩代或多代以保證所希望的表型特征的表達(dá)穩(wěn)定地保持和遺傳，然后收獲種子以保證所希望的表型特征的表達(dá)已經(jīng)實現(xiàn)。
[0103]實施例
[0104]實施例1
[0105]分離基因組微RNA前體基因
[0106]如Zhang B 等人所述(2006) FEBS Lett.580:3753-62),俥用編碼玉米微 RNA 某閔的序列作為查詢序列進(jìn)行BLAST分析,使用表達(dá)序列標(biāo)記的Pioneer Unicorn6.0集合。在Unicorn6.0集合中大約30%的查詢序列具有完全匹配。設(shè)計以下引物(購自MWG-BIOTECHInc.)擴(kuò)增在這些序列中選擇的五個序列(參見表1)。
[0107]表1:用于擴(kuò)增基因組微RNA前體的引物
[0108]
【權(quán)利要求】
1.用于減少玉米細(xì)胞中靶序列表達(dá)的核酸片段，其中(i)SEQID NO: 15的核苷酸83至103被第一可變核苷酸亞序列置換，取決于要減少表達(dá)的靶序列，所述第一可變核苷酸亞序列的大小在19至30個核苷酸的范圍內(nèi)，(ii)SEQ ID NO: 15的核苷酸172至192被第二可變核苷酸亞序列置換，所述第二可變核苷酸亞序列的大小在19至30個核苷酸的范圍內(nèi)，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與第一可變亞序列雜交，并且(iii)由所述核酸片段產(chǎn)生的前體miRNA與由內(nèi)源性SEQ ID NO: 15產(chǎn) 生的前體miRNA具有相同的莖結(jié)構(gòu)，并且所述第一和第二可變核苷酸亞序列不同于被置換的序列。
2.包含權(quán)利要求1的核酸片段的重組構(gòu)建體，所述核酸片段與至少一種調(diào)控序列可操作地連接。
3.減少玉米細(xì)胞中靶序列表達(dá)的方法，所述方法包括: (a)用權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至少一種玉米細(xì)胞；以及 (b)選擇那些轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞的靶序列的表達(dá)水平與野生型玉米細(xì)胞中的靶基因的表達(dá)水平相比被減少。
【文檔編號】A01H5/00GK103898114SQ201410102903
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2007年12月18日
【發(fā)明者】B.麥戈尼格爾 申請人:納幕爾杜邦公司