滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置，包括密封貼合的上蓋板、下墊板和位于二者間的中間流道板；所述中間流道板設(shè)有通孔流道，該通孔流道的兩端分別是與外界相通的進水口和出水口；流道類型和生物膜培養(yǎng)單元的設(shè)置根據(jù)灌水器原型進行設(shè)計，所述生物膜培養(yǎng)單元包括若干個能拆卸的取樣片。本發(fā)明實現(xiàn)了室內(nèi)可控條件下滴灌灌水器附生生物膜的培養(yǎng)及取樣和測試，可以有效地解決灌水器內(nèi)部附生生物膜的快速培養(yǎng)、生物膜動態(tài)生長過程可視化及動態(tài)監(jiān)測。
【專利說明】滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及節(jié)水灌溉技術(shù)和環(huán)境微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]面對當前水資源嚴重緊缺的局勢，利用再生水、地表微污染水、高含沙水、微咸水等劣質(zhì)水源回用灌溉已成為解決農(nóng)業(yè)用水緊缺問題的有效途徑之一。但是劣質(zhì)水源的水質(zhì)往往較差，過量以及不恰當?shù)氖褂昧淤|(zhì)水源可能給環(huán)境甚至人類生活帶來風險。滴灌技術(shù)因其精量、可控等優(yōu)點被認為是劣質(zhì)水源回用灌溉最可靠的方式之一，但劣質(zhì)水復(fù)雜的水質(zhì)條件使得灌水器發(fā)生堵塞的風險更大，堵塞的機理也更為復(fù)雜。
[0003]已有研究表明，滴灌灌水器堵塞程度與其內(nèi)部附生生物膜的動態(tài)生長過程密切相關(guān)，生物膜是由微生物群體(細菌、原生動物、真菌等)、固體顆粒以及微生物分泌的胞外多聚物等多物質(zhì)構(gòu)成的一個三維異質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能整體，結(jié)構(gòu)和組分十分復(fù)雜。生物膜的形成和生長是造成灌水器堵塞加劇的主要誘因，不同階段生物膜的生長特性存在明顯差異。灌水器內(nèi)部附生生物膜生長過程及其對灌水器堵塞的影響一直是眾多科研工作者關(guān)心的問題。實際上，滴灌灌水器內(nèi)部附生生物膜的形成和生長是灌水器流道類型、滴灌水質(zhì)、溫度、營養(yǎng)物質(zhì)供給、水力學(xué)條件等多種因素綜合影響下的結(jié)果，很難加以區(qū)分和衡量。尤其是流道結(jié)構(gòu)尺寸狹小且流態(tài)復(fù)雜，灌水器內(nèi)部附生生物膜動態(tài)生長過程及其對灌水器堵塞的影響難以研究。
[0004]目前滴灌灌水器附生生物膜的取樣和測試主要依賴于滴灌系統(tǒng)原位試驗，難以獲得足夠的樣本，且取樣和測試的難度都比較大。與此同時，灌水器內(nèi)部局域微觀水動力學(xué)特性對流道內(nèi)附生生物膜的生長也有著顯著影響，使得灌水器內(nèi)部生物膜也存在明顯的空間非均勻性，因為流道狹小，采用常規(guī)的取樣方法，難以反映灌水器內(nèi)部局域生物膜的形成機制以及堵塞的形成機理。因此，急需開發(fā)一套灌水器內(nèi)部附生生物膜快速培養(yǎng)裝置及測試分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是模擬實際使用的滴灌灌水器，提供一種滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置，其為灌水器放大模型。
[0006]本發(fā)明提供的滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置，其包括密封貼合的上蓋板7、下墊板8、位于二者間的中間流道板9，所述中間流道板設(shè)有通孔流道12，該通孔流道的兩端分別是與外界相通的進水口 10和出水口 11，所述通孔流道內(nèi)壁上設(shè)有生物膜培養(yǎng)單元14，所述生物膜培養(yǎng)單元包括若干個能拆卸的取樣片15。
[0007]上述通孔流道可以為`圖3所示的梯形鋸齒形流道，也可以為圖5所示的流線形鋸齒形流道，也可以為圖6所示的矩形鋸齒形流道，也可以為圖7所示的圓角鋸齒形流道。
[0008]以梯形鋸齒形流道為例，所述通孔流道的兩側(cè)交錯設(shè)置有若干梯形凹槽13，每一側(cè)每兩相鄰梯形凹槽的腰底邊連接成一 V形凸棱，每一側(cè)的各所述V形凸棱的尖部，分別對應(yīng)另一側(cè)所述梯形凹槽槽底中心；所述梯形凹槽的內(nèi)壁上設(shè)置有若干所述生物膜培養(yǎng)單元。
[0009]以該鋸齒形流道為基礎(chǔ)，考慮到實際使用的灌水器流道尺寸較小，以相關(guān)的水工模型定律作為相似模擬的控制條件，通過綜合權(quán)衡計算流體力學(xué)(CFD)分析結(jié)果以及生物膜取樣需求，本發(fā)明按比例擴大40-50倍制作灌水器放大模型。實際上，根據(jù)相似模型放大定律，灌水器內(nèi)部流體運動往往僅考慮重力和慣性力。但是由于灌水器流道結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，水流流態(tài)一般為紊流，邊界層效應(yīng)不是很顯著，粘滯力也不是促進水流運動主要作用力之一。因此，灌水器放大模型與灌水器原型要做到相似性，只須滿足以下關(guān)系:
[0010]①幾何尺寸關(guān)系:12/111=40-50/1 (11為灌水器原型流道長度，12為放大模型流道長
[0011]度)；
[0012]w2/w1=40-50/1 (W1為灌水器原型流道寬度，W2為放大模型流道
[0013]寬度)；
[0014]4/^=40-50/1 (Cl1為灌水器原型流道深度，(12為放大模型流道
[0015]深度)；
[0016]②工作壓力關(guān)系:4/^=40-50/1 (H1為灌水器原型工作壓力，H2為放大模型工作壓力)；
[0017]③糙率關(guān)系:n2/n1=(40-50)1/6=1.85-1.92/1 Cn1為灌水器原型糙率，n2為放大模型糙率)；
[0018]④流量關(guān)系:Q2/Q1=(40-50)2.5/1=10119.3-17677.1/1(.% 為灌水器原型流量，Q2 為
放大模型流量)。
[0019]由于上述條件，因此上述裝置中，綜合考慮計算流體力學(xué)(CFD)模擬結(jié)果和生物膜取樣測試的需求，設(shè)置在所述通孔流道一側(cè)的所述生物膜培養(yǎng)單元為正方形，且位于遠離所述V形凸棱的所述梯形凹槽槽底兩側(cè)的內(nèi)壁上，其長占其所在內(nèi)壁長的1/4-1/2 ；
[0020]設(shè)置在所述通孔流道另一側(cè)的所述生物膜培養(yǎng)單元為長方形，且位于所述V形凸棱尖部兩側(cè)的所述梯形凹槽內(nèi)壁上，且長占其所在內(nèi)壁長的1/2-3/4。上述裝置中，所述生物膜培養(yǎng)單元還包括金屬框架16和設(shè)在其上的金屬卡槽17，所述取樣片與所述金屬框架通過金屬卡槽固定，以保證每個取樣片可以固定在所述生物膜培養(yǎng)單元上；為了固定生物膜培養(yǎng)單元，在流道底部均設(shè)有卡槽18，所述生物膜培養(yǎng)單元通過所述卡槽固定在對應(yīng)的內(nèi)壁上(即流道底部)。
[0021]在上述裝置中，所述上蓋板、所述下墊板和所述中間流道板通過鉚接緊密貼合，且三個板的四邊用膠密封，具體的鉚接方式可以采用螺釘19，膠為玻璃膠。
[0022]為了使模型透明化，便于觀察，所述上蓋板和所述下墊板均為透明有機玻璃板；
[0023]為了使生物膜培養(yǎng)模擬裝置與實際使用的灌水器一致，所述取樣片采用黑色PE材料，且粗糙度為實際使用灌水器的PE材料的1.85-1.92倍。所述中間流道板采用不銹鋼材料，且裝置中的金屬采用不銹鋼；所述模擬培養(yǎng)裝置的放大倍數(shù)為實際使用灌水器的40-50 倍。
[0024]本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測灌水器滴灌時內(nèi)部附生生物膜生長狀態(tài)的模擬系統(tǒng)。[0025]本發(fā)明提供的系統(tǒng)，包括水泵1、第一球閥2.1、第二球閥2.2、第三球閥2.3、過濾器3、截止閥4、壓力表5、若干個所述滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置6和水源7。
[0026]上述系統(tǒng)中，在所述水源的出口通過管路依次連接所述水泵、所述第一球閥、所述過濾器、所述截止閥和所述壓力表，在所述壓力表出口的管路分為并列的若干個之路，每個支路上間隔設(shè)置兩個第二球閥，在所述兩個第二球閥之間設(shè)有所述的滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置；所有所述支路出口合并為一路后，通過所述第三球閥、管路連接至所述水源進口 ；在所述過濾器和所述截止閥之間的管路設(shè)有另一支路，所述另一支路通過另一第一球閥連接至所述水源進口。
[0027]上述的裝置或系統(tǒng)在檢測模擬灌水器使用時產(chǎn)生的生物膜特征組分的取樣和測試方法也是本發(fā)明保護的范圍。
[0028]本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測灌水器中生物膜特征組分的方法。
[0029]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:將用于灌溉的水源流經(jīng)上述的裝置或系統(tǒng)，收集取樣片，檢測生物膜特征；
[0030]上述方法中，依據(jù)相似放大模型原理，所述放大模型的初始流量為實際使用灌水器的 10119.3-17677.7 倍。
[0031]所述生物膜培養(yǎng)裝置的工作壓力為實際使用灌水器的40-50倍；上述生物膜特征包括表面形貌、干重、胞外聚合物含量和/或磷脂脂肪酸含量，在本發(fā)明的實施例中，表面形貌具體通過平均厚度、粗糙度、峰值高度或表面展開面與投影面的面積比率體現(xiàn)。
[0032]本發(fā)明實現(xiàn)了室內(nèi)可控條件下滴灌灌水器附生生物膜的快速培養(yǎng)及取樣和測試方法，可以有效地解決以下幾個方面的問題且具有如下優(yōu)點:
[0033](I)室內(nèi)可控條件下灌水`器內(nèi)部附生生物膜快速培養(yǎng)問題:開發(fā)了一套室內(nèi)可控條件下的滴灌灌水器附生生物膜快速培養(yǎng)裝置，能夠在不同水質(zhì)、不同環(huán)境條件、不同位置等因素影響下實現(xiàn)灌水器內(nèi)部附生生物膜的快速培養(yǎng)，功能多樣；
[0034](2)生物膜取樣及測試方法問題:系統(tǒng)地提出了滴灌灌水器內(nèi)部單元段、結(jié)構(gòu)單元附生生物膜微域取樣樣點布置以及取樣方法，提出了系統(tǒng)的生物膜組分測試方法；
[0035](3)灌水器內(nèi)部附生生物膜動態(tài)生長過程可視化問題:本裝置在室內(nèi)進行，可以有效控制溫度等環(huán)境條件，借助透明材料和慢線切割技術(shù)實現(xiàn)了生物膜生長過程的可視化。同時通過等比例放大模型模擬灌水器內(nèi)部生物膜的生長條件，并經(jīng)過CFD模擬方法驗證了恒定壓力下模型中水流狀態(tài)與灌水器原型的相似性，該裝置運行可靠性較高；解決了傳統(tǒng)灌水器流道尺寸狹小、灌水器不透明的限制，可以直觀觀察不同工況下灌水器內(nèi)部附生生物膜的動態(tài)生長過程，同時大幅提升了取樣精度和可靠性；
[0036](4)灌水器內(nèi)部附生生物膜取樣困難的問題:生物膜培養(yǎng)部分采用鑲嵌式方形取樣模塊設(shè)計，并利用卡槽固定每塊生物膜取樣片，保證生物膜培養(yǎng)過程中的穩(wěn)定性以及取樣的便捷性。
[0037]本發(fā)明的總體思路:本發(fā)明根據(jù)水力學(xué)原理和計算流體力學(xué)計算方法，提出了一種基于透明灌水器放大模型的滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置，實現(xiàn)了室內(nèi)可控條件下生物膜的快速培養(yǎng)，根據(jù)取樣片的大小和系統(tǒng)運行方式，提出了生物膜取樣樣點布置及取樣方法，建立了生物膜組分測試方法?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0038]圖1為測試系統(tǒng)布置示意圖
[0039]圖2為滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置示意圖
[0040]圖3為齒狀結(jié)構(gòu)單元中的生物膜培養(yǎng)單元布置示意圖[0041 ]圖4為生物膜測試流程圖
[0042]圖5為流線形鋸齒形流道
[0043]圖6為矩形鋸齒形流道
[0044]圖7為圓角鋸齒形流道
【具體實施方式】
[0045]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0046]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0047]實施例1、滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置及測試系統(tǒng)布置
[0048]本試驗選取Netafim公司一種齒形流道灌水器作為灌水器原型，等比例放大40倍。灌水器放大模型原型采用鋸齒形流道，流道長度為60.6mm,寬度和深度都為1.0mm,齒高1.3mm,齒間距2.2mm,齒轉(zhuǎn)角116.5°。
[0049]滴灌灌水器內(nèi)部附生生物膜培養(yǎng)的測試系統(tǒng)如圖1所示，包括水泵1、第一球閥
2.1、第二球閥2.2、第三球閥2.3、過濾器3、截止閥4、壓力表5、8套滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置6和水源7。在水源的出口通過管路依次連接水泵、第一球閥、過濾器、截止閥和壓力表，在壓力表出口的管路分為并列的若干個之路，每個支路上間隔設(shè)置兩個第二球閥，在兩個第二球閥之間設(shè)有的滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置；所有支路出口合并為一路后，通過第三球閥、管路連接至水源進口 ；在過濾器和截止閥之間的管路設(shè)有另一支路，另一支路通過另一第一球閥連接至水源進口。
[0050]該系統(tǒng)使用揚程400m的水泵I進行供水；調(diào)整閥門2.1即可利用分流原理控制系統(tǒng)工作壓力，通過壓力表5確定工作壓力；過濾器3使用120目疊片式過濾器；調(diào)整閥門2.2來控制供給滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置6的水源，滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置取樣后關(guān)閉閥門2.2后重新調(diào)壓即可；系統(tǒng)每天重新啟動后必須調(diào)整工作壓力。
[0051]依據(jù)相似模型放大定律，每套滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置6的放大倍數(shù)為實際使用灌水器的40倍，結(jié)構(gòu)如圖2所示，其包括緊密貼合的上蓋板7、下墊板8、位于二者間的中間流道板9，為了使模型透明化，便于觀察，所述上蓋板和所述下墊板均為透明有機玻璃板；中間流道板采用不銹鋼材料；三個板分別加工后再進行組合，將每個板的兩個長邊均每隔5cm打一個孔，以實現(xiàn)用螺釘19鉚接使三板之間緊密貼合，邊緣處使用玻璃膠密封。中間流道板設(shè)有通孔流道12，該通孔流道的兩端分別是與外界相通的進水口 10和出水口 11 ;進水口和出水口之外通過PVC管件進行連接。該模型采用梯形鋸齒形流道原型進行方法，流道放大模型的兩側(cè)交錯設(shè)置有12個梯形凹槽13。
[0052]如圖3所示，每一側(cè)每兩相鄰梯形凹槽的腰底邊連接成一 V形凸棱，每一側(cè)的各所述V形凸棱的尖部，分別對應(yīng)另一側(cè)所述梯形凹槽槽底中心；所述梯形凹槽的內(nèi)壁上設(shè)置有若干所述生物膜培養(yǎng)單元14 (1#_4#)，生物膜培養(yǎng)單元包括4個能拆卸的取樣片15。
[0053]根據(jù)計算流體力學(xué)(CFD)模擬的放大模型流道壓力分布結(jié)果以及生物膜取樣測試需求，將生物膜培養(yǎng)單元分成兩種，一種為2 X 2正方形生物膜培養(yǎng)單元，另一種為I X 4長方形生物膜培養(yǎng)單元。
[0054]具體設(shè)置在通孔流道一側(cè)的生物膜培養(yǎng)單元為正方形(4#為迎水區(qū)、3#為背水區(qū))，且位于遠離V形凸棱的所述梯形凹槽槽底兩側(cè)的內(nèi)壁上，其長占其所在內(nèi)壁長的1/4-1/2 ;設(shè)置在通孔流道另一側(cè)的所述生物膜培養(yǎng)單元為長方形(2#為背水區(qū)，1#為迎水區(qū))，且位于V形凸棱尖部兩側(cè)的梯形凹槽內(nèi)壁上；，且長占其所在內(nèi)壁長的1/2_3/4。
[0055]每個生物膜培養(yǎng)單元包括4個取樣片15、不銹鋼框架16和設(shè)在其上的不銹鋼卡槽17，其中，每個取樣片均為IcmX Icm的正方形取樣片，使用黑色的PE材料，粗糙度為灌水器原型的1.85倍。上述取樣片與不銹鋼框架通過不銹鋼卡槽固定，以保證每個取樣片可以固定在生物膜培養(yǎng)單元上；為了固定生物膜培養(yǎng)單元，在流道底部均設(shè)有卡槽18(方型槽)，生物膜培養(yǎng)單元通過方型槽固定在對應(yīng)的內(nèi)壁上(即流道底部)。
[0056]實施例2、滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置檢測生物膜的方法
[0057]1、取樣 [0058]本實例旨在測試再生水滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置生物膜特征組分(干重、胞外聚合物和磷脂脂肪酸)的動態(tài)生長過程。
[0059]使用再生水進行試驗，再生水取自北京市昌平區(qū)北七家鎮(zhèn)污水處理廠，該污水處理廠位于北京市昌平區(qū)北七家鎮(zhèn)境內(nèi)，污水處理工藝為周期循環(huán)式活性污泥法(CyclicActivated Sludge System,CASS)。研究不同階段再生水滴灌灌水器附生生物膜組分變化，摸清附生生物膜特征組分動態(tài)變化特征。
[0060]將再生水水儲存在儲水桶中為系統(tǒng)提供水源，使用水泵供水，保持壓力恒定為4MPa，為實際使用灌水器時的40倍，且保證初始流量為實際使用灌水器時的10119.3倍。
[0061]系統(tǒng)運行后滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置每天8:00-20:00運行12小時。再生水水源經(jīng)過分流后直接進入8套滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置的并聯(lián)系統(tǒng)，同時從進水口進入。通水后，在灌水器每個結(jié)構(gòu)單元的4個生物膜培養(yǎng)點位(B卩1#迎水區(qū)、2#背水區(qū)、3#背水區(qū)和4#迎水區(qū))觀測生物膜的特征組分的生長情況，多余的水經(jīng)過回路后回到儲水桶中。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，在灌水器放大模型表面能明顯看到附生生物膜的生長。
[0062]在系統(tǒng)分別累積運行268h，420h，620h，740h，884h，988h，1040h，1212h 時，灌水器放大模型的流量分別達到初始流量的90%、80%、75%、60%、50%、25%、20%和O。在上述每個時間點進行生物膜取樣，每次取樣時取I套灌水器放大模型，并取出每個位點的培養(yǎng)單元(1#_4#取樣片)。分別將各個培養(yǎng)單元加入15mL去離子水后置于超聲波清洗器中脫膜處理，然后取出灌水器，將所得含有不溶物的液體分別用于干重、胞外聚合物(EPS)和磷脂脂肪酸(PLFAs)的測試。
[0063]2、檢測附生生物膜特征組分
[0064]檢測附生生物膜特征組分流程圖如圖4所示。
[0065]對于每次取樣，每套滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置的每一個生物膜培養(yǎng)單元的4個取樣片按以下步驟進行測試:表面形貌測試使用1#取樣片進行，測試完之后脫膜處理，通過質(zhì)量差確定生物膜干重；生物膜PLFAs和EPS分別取2-4#取樣片的1/2進行測試，取三者的平均值的2倍作為放大模型生物膜PLFAs和EPS含量。
[0066]生物膜干重、PLFAs和EPS的含量，根據(jù)放大模型與灌水器原型的比例進行換算，具體方法為:對于長為I1,寬為W1的灌水器流道原型，放大模型取樣片面積為Atl(即I2Xw2),則
[0067]灌水器原型生物膜組分含量=放大模型生物膜組分含量X (I1Xw1) /A0
[0068]=放大模型生物膜組分含量Xk
[0069]生物膜測試內(nèi)容具體如下:[0070]I)表面形貌:生物膜的表面形貌特征包括生物膜表面的粗糙度、厚度、覆蓋率等微觀特征，是生物膜在水力條件、時間、溫度、水質(zhì)等多重因素的共同影響下的整體體現(xiàn)，有望成為一種能較好地反映生物膜的形成態(tài)勢及其對滴灌系統(tǒng)堵塞影響的綜合指標。生物膜的表面形貌可以通過三維白光干涉形貌儀(型號=MiciO-XPM)進行測試，測試樣品大小為
0.3cmX0.3cm，物鏡為50X，測試范圍為128X 173 μ m的矩形區(qū)域；并使用配套的SPIP軟件進行分析，得到生物膜的平均厚度(Sd)、平均粗糙度(S,)、峰值高度(sy)、表面展開面與投影面的面積比率(Ste)等參數(shù)。
[0071]2)干重:固體顆粒是滴灌灌水器堵塞物質(zhì)(即附生生物膜)的主要組分，灌水器附生生物膜干重是灌水器內(nèi)部堵塞干物質(zhì)量的總體表現(xiàn)，直接反映了堵塞物質(zhì)中的物理作用。用高精度電子天平測量1#取樣片的重量，然后將各取樣片分別裝入自封袋中，加入15mL去離子水后置于超聲波清洗器中脫膜處理，取出后置于烘箱中60°C恒溫烘干，再稱量取樣片，則取樣片的初始重量和經(jīng)過脫膜、烘干后的重量之差即為取樣片生物膜干重。取樣片干重的平均值乘以k作為灌水器原型生物膜干重的測試結(jié)果。
[0072]3)胞外聚合物(EPS):胞外聚合物是微生物的生長過程中分泌出的粘性物質(zhì)，凝膠狀的胞外聚合物首先附著在水環(huán)境中各種基質(zhì)的表面，并借此不斷吸附水中的微生物、顆粒物等物質(zhì)，使生物膜不斷生長。
[0073]①將各取樣片分別裝入自封袋中，加入30mL去離子水后置于超聲波清洗器中脫膜處理，然后取出取樣片，將所得含有不溶物的液體15mL采用12000r/min離心15min后將懸浮物收集到1.5mL離心管中，用無菌水重懸；
[0074]②制備多糖標準曲線:在0.1mL的懸浮物中加入lmL6%的苯酚和5mL濃硫酸溶液，室溫靜置30min，采用分光光度計UV-1100于490nm波長測定光密度值，使用BSA標準品以葡萄糖制作標準曲線；
[0075]③制備蛋白質(zhì)標準曲線:配置試劑A (143mmol/L的NaOH和270mmol/L的Na2CO3混合液)、試劑B (將試劑A與57mmol/L的CuSO4溶液、124mmol/L的Na_tatrate按照體積比100:1:1混合)，然后在0.5mL樣品中依次加入0.7mL試劑B、0.1mL的福林溶液(采用無菌水稀釋，V:V=5:6)后，混合后室溫振蕩45min，采用分光光度計UV-1100于750nm波長處測定光密度值，使用BSA標準品以小牛血清白蛋白制作標準曲線；
[0076]④數(shù)值計算:根據(jù)標準品制作出標準曲線，通過Excel計算出回歸線及相關(guān)系數(shù)，相關(guān)系數(shù)大于0.99方可進行樣品測定，根據(jù)標準曲線計算出的回歸方程，將光度值帶入方程即可換算出胞外多糖和胞外蛋白的含量，EPS的含量為兩者之和。取2-4#這3個取樣片EPS含量的平均值乘以2k作為灌水器原型生物膜EPS含量的測試結(jié)果。
[0077]4)磷脂脂肪酸(PLFAs):微生物的數(shù)量及其分泌的胞外聚合物是生物膜生長的基礎(chǔ)，將直接影響灌水器內(nèi)部附生生物膜的生長及累積情況，微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)在生物膜形成和生長過程中都具有舉足輕重的作用。[0078]①微生物PLFAs的提取:取2_4#取樣片剩余的15mL液體與氯仿、甲醇和磷酸緩沖液的混合液(V:V:V=1:2:0.8)35mL混合，避光振蕩提取2_4h，在離心機中以7000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min,取上清液,轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，再加入IOmL磷酸緩沖液和IOmL氯仿,室溫下避光分離2-4h，收集下層的氯仿相，氮氣吹干；
[0079]②純化:將硅膠在烘箱中100°C活化lh，分別用15mL的氯仿、30mL的丙酮和15mL的甲醇溶劑在硅膠柱中洗脫，收集甲醇洗液，氮氣吹干；
[0080]③甲酯化:加入ImL的甲醇:甲苯(V:V=1:1)和ImL的0.56%(w/v)K0H的干甲醇，置于35°C條件下反應(yīng)30min，冷卻至室溫，然后加入醋酸中和，再加入有機溶劑氯仿與正己烷(V:V=1:4)2mL和適量超純水后靜置分層，最后取上清液(正己烷相)，氮氣吹干，在-20°C的條件下下貯存或直接進行檢測；
[0081]④質(zhì)譜測定(GC-MS):將上述提取物溶解在含有33μ g/mL的正19烷脂肪酸甲酯(Nonadecanoic acid methyl ester)內(nèi)標物的氯仿:正己燒(V:V=1:4)溶劑中。本試驗使用HP6890氣相色譜-HP5973質(zhì)譜聯(lián)用儀，氣譜與質(zhì)譜之間的連接溫度是280°C，用高純氦氣(lmL/min)作為載氣，該質(zhì)譜儀采用的是電子電離(EI)方式，電子能量是70eV。⑤進行生物量評估，并取3個取樣片PLFAs含量的平均值乘以2k作為灌水器原型生物膜PLFAs含量的測 試結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置，其特征在于:所述裝置包括密封貼合的上蓋板、下墊板和位于二者間的中間流道板；所述中間流道板設(shè)有通孔流道，該通孔流道的兩端分別是與外界相通的進水口和出水口 ；所述通孔流道內(nèi)壁上設(shè)有生物膜培養(yǎng)單元，所述生物膜培養(yǎng)單元包括若干個能拆卸的取樣片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于:所述通孔流道的兩側(cè)交錯設(shè)置有若干梯形凹槽，每一側(cè)每兩相鄰梯形凹槽的腰底邊連接成一 V形凸棱，每一側(cè)的各所述V形凸棱的尖部，分別對應(yīng)另一側(cè)所述梯形凹槽槽底中心；所述梯形凹槽的內(nèi)壁上設(shè)置有若干所述生物膜培養(yǎng)單元。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于:設(shè)置在所述通孔流道一側(cè)的所述生物膜培養(yǎng)單元為正方形，且位于遠離所述V形凸棱的所述梯形凹槽槽底兩側(cè)的內(nèi)壁上；設(shè)置在所述通孔流道另一側(cè)的所述生物膜培養(yǎng)單元為長方形，且位于所述V形凸棱尖部兩側(cè)的所述梯形凹槽內(nèi)壁上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的裝置，其特征在于:所述正方形生物膜培養(yǎng)單元的長占其所在內(nèi)壁長的1/4-1/2 ； 所述長方形生物膜培養(yǎng)單元的長占其所在內(nèi)壁長的1/2-3/4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的裝置，其特征在于:所述生物膜培養(yǎng)單元還包括金屬框架和設(shè)在其上的金屬卡槽，所述取樣片與所述金屬框架通過金屬卡槽固定。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的裝置，其特征在于:所述內(nèi)壁上均設(shè)有卡槽，所述生物膜培養(yǎng)單元通過所述卡槽固定在對應(yīng)的所述內(nèi)壁上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的裝置，其特征在于: 所述上蓋板、所述下墊板和所述中間流道板通過鉚接緊密貼合，且三個板的四邊用膠密封； 所述模擬培養(yǎng)裝置的放大倍數(shù)為實際使用灌水器的40-50倍； 所述取樣片采用黑色PE材料，且粗糙度為實際使用灌水器的PE材料的1.85-1.92倍； 所述上蓋板和所述下墊板均為透明有機玻璃板； 所述中間流道板采用不銹鋼材料； 所述金屬為不銹鋼。
8.—種檢測灌水器滴灌時產(chǎn)生的生物膜特征組分的模擬系統(tǒng)，包括水泵、第一球閥、第二球閥、第三球閥、過濾器、截止閥、壓力表、若干個權(quán)利要求1-7任一所述的滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置和水源。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的模擬系統(tǒng)，其特征在于:在所述水源的出口通過管路依次連接所述水泵、所述第一球閥、所述過濾器、所述截止閥和所述壓力表，在所述壓力表出口的管路分為并列的若干個之路，每個支路上間隔設(shè)置兩個第二球閥，在所述兩個第二球閥之間設(shè)有權(quán)利要求1-7任一所述的滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置；所有所述支路出口合并為一路后，通過所述第三球閥、管路連接至所述水源進口 ；在所述過濾器和所述截止閥之間的管路設(shè)有另一支路，所述另一支路通過另一第一球閥連接至所述水源進口。
10.權(quán)利要求1-7中任一所述的裝置或權(quán)利要求8或9所述的系統(tǒng)在檢測灌水器使用時產(chǎn)生的生物膜特征組分中的應(yīng)用； 或一種檢測灌水器中生物膜特征組分的方法，包括如下步驟:將用于灌溉的再生水流經(jīng)權(quán)利要求8或9所述的系統(tǒng)，收集取樣片，檢測生物膜特征組分； 所述的系統(tǒng)中的滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置的工作壓力為灌水器原型的40-50 倍； 所述的系統(tǒng)中的滴灌灌水器附生生物膜模擬培養(yǎng)裝置中再生水的流量為灌水器原型的 10119.3-17677.7 倍； 所述生物膜特征組分為表面形貌、干重、胞外聚合物含量和/或磷脂脂肪酸含量。
【文檔編號】A01G25/02GK103865757SQ201410105514
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】李云開, 周博, 王天志, 吳乃陽 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)