一種單粒玉米種子活力快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，包括以下步驟：利用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB）提取玉米胚乳核DNA；利用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測玉米胚乳核DNA中8-OHdG的含量；通過建立種子老化模型和檢測玉米胚乳核DNA中8-OHdG氧化水平實現(xiàn)對玉米胚乳核DNA氧化損傷的檢測，快速檢測單粒玉米種子活力。本發(fā)明提供的方法，分析速度快，簡單且準(zhǔn)確的實現(xiàn)單粒玉米種子的活力檢測。
【專利說明】一種單粒玉米種子活力快速檢測方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及種子活力檢測技術(shù)，特別是涉及一種單粒玉米種子活力快速檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]種子活力是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。高活力種子具有明顯的生長優(yōu)勢和生產(chǎn)潛力，是單粒播種的關(guān)鍵。近年來，我國玉米生產(chǎn)逐漸向機(jī)械化單粒精量播種的方向發(fā)展。因此，有必要建立快速、簡便且準(zhǔn)確的單粒玉米種子的活力檢測方法。
[0003]現(xiàn)有測定玉米種子活力的方法主要包括:(I)發(fā)芽實驗，真實客觀，但耗時長，且會消耗種子庫存量；(2)2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、紅墨水染色法，簡單快速，但破壞種子結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確性和靈敏度也差；(3) Q2技術(shù)，通過測定呼吸參數(shù)快速、準(zhǔn)確的測定種子活力，不破壞種子的完整性，但需要昂貴的專門儀器。
[0004]玉米種子由胚和胚乳兩大部分組成，其基因型分別為2η和3η，但它們的DNA組成相同。玉米種子成熟后，活力會發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的劣變。核DNA在種子劣變過程中最容易遭受氧化損傷，尤其是DNA中的鳥嘌呤，其氧化產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是DNA氧化損傷最常用的生物標(biāo)志物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有種子活力檢測方法耗時長、種子用量大、準(zhǔn)確性差的缺陷，提供一種快速、準(zhǔn)確的單粒玉米種子活力檢測的方法。通過檢測玉米胚乳中核DNA氧化損傷程度分析單粒種子的活力，以適應(yīng)玉米精播生產(chǎn)的需要。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，它由以下步驟組成:玉米胚乳核DNA的提取，玉米胚乳核DNA氧化損傷檢測，玉米胚乳核DNA活力分析。
[0007]所述玉米胚乳核DNA的提取利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB);所述玉米胚乳核DNA氧化損傷檢測利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳核DNA中8-OHdG的含量；所述玉米胚乳核DNA活力分析通過建立種子老化模型實現(xiàn)。
[0008]一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，它由以下步驟組成:
a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA ；
Cl)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.13^0.17 g ；
(2)將(I)中所得胚乳和0.9^1.1 ml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中；
(3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次；
(4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ；
(5)向(4)中所得的胚乳中加入0.9^1.1 ml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(6)將(5)所得胚乳以5600^6400g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(7)向(6)中所得上清液中加入0.9^1.1 ml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(8)將(7)所得物以5600^6400g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次；
(10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時；
(11)將(10)所得物以5600~6400g離心力離心5 min，離心后收集沉淀;
(12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇0.9^1.1 ml，輕輕上下顛倒3 min ；
(13)將(12)中所得物以5600~6400g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ；
(14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 48~52μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中；
b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量；
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8-OHdG特異抗體、通過ELISA檢測；8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買；
(1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml,80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各48~52 μL，向各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液中分別加第一抗體溶液48、2μL,搖晃酶標(biāo)板使其充分混合,封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h ；
(2)反應(yīng)結(jié)束后，倒掉反應(yīng)液，分別加入洗凈液230-270PL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次； (3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液96~104μL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ；
(4)將所述酶標(biāo)板各孔板用洗凈液洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液96~104μL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min ;反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合；
(5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液96~104PL，使反應(yīng)停止，在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值；
(6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程，將各樣品檢測OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)值再乘以稀釋倍數(shù)即為各樣品中8-OHdG濃度；
C、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力。
[0009]一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，它由以下步驟組成:
a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA ；
Cl)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.14"?.16 g ；
(2)將(I)中所得胚乳和0.95^1.05 ml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中；
(3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次；
(4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ；
(5)向(4)中所得的胚乳中加入0.95~1.05 ml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(6)將(5)所得胚乳以5800~6200g離心力離心5 min，離心后收集上清液;(7)向(6)中所得上清液中加入0.95~1.05 ml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(8)將(7)所得物以5800^6200g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次；
(10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時；
(11)將(10)所得物以5800~6200g離心力離心5 min，離心后收集沉淀;
(12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇0.95~1.05 ml,輕輕上下顛倒3 min ；
(13)將(12)中所得物以5800~6200g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ；
(14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 49~5?μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中；
b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量；
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8-OHdG特異抗體、通過ELISA檢測；8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買；
(1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml, 80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各49~5?μL，分別加第一抗體溶液49~5?μL，搖晃酶標(biāo)板使其充分混合，封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h ；
(2)反應(yīng)結(jié)束后，倒掉反應(yīng)液，分別加入洗凈液240-260PL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次；
(3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液98~102PL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ；
(4)將所述酶標(biāo)板各孔板洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液98~102μL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min ;反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合；
(5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液98~102μL，使反應(yīng)停止，在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值；
(6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程，將樣品溶液OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)再乘以稀釋倍數(shù)即為各樣品中8-OHdG濃度；
C、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力。
[0010]一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，它由以下步驟組成:
a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA ；
Cl)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.15 g ；
(2)將(I)中所得胚乳和Iml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中；
(3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次；
(4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ；
(5)向(4)中所得的 胚乳中加入Iml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(6)將(5)所得胚乳以6000g離心力離心5min，離心后收集上清液；
(7)向(6)中所得上清液中加入Iml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；(8)將(7) 所得物以6000g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次；
[10]將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時；
(11)將(10)所得物以6000g離心力離心5min,離心后收集沉淀；
(12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇Iml，輕輕上下顛倒3 min ；
(13)將(12)中所得物以6000g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ；
(14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 50μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中；
b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量；
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8-OHdG特異抗體、通過ELISA檢測；8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買；
(1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml, 80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各50μL，分別加第一抗體溶液50μL，搖晃酶標(biāo)板使其充分混合，封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h;
(2)反應(yīng)結(jié)束后,倒掉反應(yīng)液,分別加入洗凈液250μL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次；
(3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液100μL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ；
(4)將所述酶標(biāo)板各孔板洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液100μL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min ;反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合；
(5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液?οομL,使反應(yīng)停止,在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值；
(6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程，將樣品溶液OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)即為樣品中8-OHdG濃度；
C、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力。
[0011]所述CTAB 溶液由 3%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,20 mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCl，20mmol/LDTT 組成。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中種子活力檢測方法耗時長、種子用量大、準(zhǔn)確性差等問題，提供了一種簡單、快速、準(zhǔn)確的單粒玉米種子活力檢測的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為切去部分胚乳的玉米種子發(fā)芽情況。
[0014]【具體實施方式】:
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0015]實施例1
一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，它由以下步驟組成:
a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA ；
Cl)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.13^0.17 g ；
(2)將(I)中所得胚乳和0.9^1.1 ml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0，20 mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl，20mmol/LDTT 組成；
(3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次；
(4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ；
(5)向(4)中所得的胚乳中加入0.9^1.1 ml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(6)將(5)所得胚乳以5600^6400g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(7)向(6)中所得上清液中加入0.擴(kuò)1.1 ml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻； (8)將(7)所得物以5600^6400g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次；
(10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時；
(11)將(10)所得物以5600~6400g離心力離心5 min，離心后收集沉淀;
(12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇0.9^1.1 ml，輕輕上下顛倒3 min ；
(13)將(12)中所得物以5600~6400g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ；
(14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 48~52μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中；
b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量。
[0016]胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8_0HdG特異抗體、通過ELISA檢測；8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買；
(1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml, 80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各48~52 μL，分別加第一抗體溶液48~52μL，搖晃酶標(biāo)板使其充分混合，封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h ；
(2)反應(yīng)結(jié)束后，倒掉反應(yīng)液，分別加入洗凈液230-270PL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次；
(3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液96~104μL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ；
(4)將所述酶標(biāo)板各孔板用洗凈液洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液96~104μL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min ;反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合；
(5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液96~104PL，使反應(yīng)停止，在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值；
(6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程，將各樣品檢測OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)值再乘以稀釋倍數(shù)即為各樣品實際濃度；
C、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力；
(1)種子老化模型的建立。
[0017]種子于45 V、100%濕度條件下分別處理0d，2d，4d，6d，其發(fā)芽率分別為96.7%、83.3%,36.7%、0%，種子活力隨老化天數(shù)增加而劇烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
[0018]根據(jù)測定結(jié)果,8-OHdG含量在當(dāng)年玉米種子中低于1.00 ng/g ;老化2天的種子為1.00-6.00 ng/g ;老化4天的種子為6.00-9.00 ng/g ;老化6天種子基本死亡,8-OHdG含量大于10.0O ng/g。此范圍適用于大多數(shù)玉米品種活力的檢測分析。整個實驗過程8 h即可完成。
[0019]實施例2
一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，它由以下步驟組成:
a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA；
Cl)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.14"?.16 g ；
(2)將(I)中所得胚乳和0.95~1.05 ml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0，20 mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl，20mmol/LDTT 組成；
(3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次；
(4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ； (5)向(4)中所得的胚乳中加入0.95~1.05 ml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(6)將(5)所得胚乳以5800^6200g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(7)向(6)中所得上清液中加入0.95~1.05 ml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(8)將(7)所得物以5800^6200g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次；
(10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時；
(11)將(10)所得物以5800~6200g離心力離心5 min，離心后收集沉淀;
(12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇0.95~1.05 ml,輕輕上下顛倒3 min ；
(13)將(12)中所得物以5800~6200g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ；
(14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 49~5?μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中；
b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量。
[0020]胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8_0HdG特異抗體、通過ELISA檢測；8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買；
(1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml, 80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各49~5?μL，分別加第一抗體溶液49~5?μL，搖晃酶標(biāo)板使其充分混合，封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h ；
(2)反應(yīng)結(jié)束后，倒掉反應(yīng)液，分別加入洗凈液240-260PL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次；
(3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液98~102PL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ；
(4)將所述酶標(biāo)板各孔板洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液98~102μL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min ;反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合；
(5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液98~102μL，使反應(yīng)停止，在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值；
(6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程，將各樣品檢測OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)值再乘以稀釋倍數(shù)即為各樣品實際濃度；
C、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力；
(1)種子老化模型的建立。
[0021]種子于45 °C、100%濕度條件下分別處理0d，2d，4d，6d，其發(fā)芽率分別為96.7%、83.3%,36.7%、0%，種子活力隨老化天數(shù)增加而劇烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
[0022]根據(jù)測定結(jié)果,8-OHdG含量在當(dāng)年玉米種子中低于1.00 ng/g ;老化2天的種子為1.00-6.00 ng/g ;老化4天的種子為6.00-9.00 ng/g ;老化6天種子基本死亡,8-OHdG含量大于10.00 ng/g。此 范圍適用于大多數(shù)玉米品種活力的檢測分析。整個實驗過程8 h即可完成。
[0023]實施例3
一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，它由以下步驟組成:
a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA；
Cl)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.13 g ；
(2)將(I)中所得胚乳和0.9 ml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 20mmol/LDTT 組成；
(3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次；
(4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ；
(5)向(4)中所得的胚乳中加入0.9 ml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(6)將(5)所得胚乳以5600g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(7)向(6)中所得上清液中加入0.9ml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(8)將(7)所得物以5600g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次；
(10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時；
(11)將(10)所得物以5600g離心力離心5min，離心后收集沉淀；
(12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇0.9ml,輕輕上下顛倒3 min;
(13)將(12)中所得物以5600g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ；
(14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 48μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中；
b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量。
[0024]胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8_0HdG特異抗體、通過ELISA檢測。8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買；
(I)在 96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml, 80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各48μL，分別加第一抗體溶液48μL，搖晃酶標(biāo)板使其充分混合，封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h;(2)反應(yīng)結(jié)束后,倒掉反應(yīng)液,分別加入洗凈液230μL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次；
(3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液96PL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ；
(4)將所述酶標(biāo)板各孔板用洗凈液洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液96PL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min。反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合；
(5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液96μL,使反應(yīng)停止,在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值；各濃度標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的OD值分別為1.511，1.328，1.186,0.903,0.557,0.281 ;老化 0d，2d，4d，6d 玉米胚乳樣品對應(yīng)的 OD 值為:1.347，0.8598，0.6296，0.1292 ；
(6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程y=- 0.5069x +1.4237，將各樣品檢測OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)值再乘以稀釋倍數(shù)5000即為各樣品實際濃度，老化0d，2d，4d，6d的玉米胚乳樣品對應(yīng)的實際8-OHdG濃度為:0.758 ng/g,5.562 ng/g, 7.833 ng/g, 12.671 ng/g ；
c、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力；
(1)種子老化模型的建立。
[0025]種子于45 °C、100%濕度條件下分別處理0d，2d，4d，6d，其發(fā)芽率分別為96.7%、83.3%,36.7%、0%，種子活力隨老化天數(shù)增加而劇烈下降；
(2)胚乳DNA 8-OHdG氧化水平。
[0026]根據(jù)測定結(jié)果,8-OHdG含量在當(dāng)年玉米種子中低于1.00 ng/g ;老化2天的種子為1.00-6.00 ng/g ;老化4天的種子為6.00-9.00 ng/g ;老化6天種子基本死亡,8-OHdG含量大于10.00 ng/g。此范圍適用于大多數(shù)玉米品種活力的檢測分析。整個實驗過程8 h即可完成。
[0027]實施例4
一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，它由以下步驟組成:
a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA ；
Cl)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.14 g ；
(2)將(I)中所得胚乳和0.95 ml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 20mmol/LDTT 組成；
(3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次；
(4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ；
(5)向(4)中所得的胚乳中加入0.95 ml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(6)將(5)所得胚乳以5800g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(7)向(6)中所得上清液中加入0.95 ml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(8)將(7)所得物以5800g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次；(10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時；
(11)將(10)所得物以5800g離心力離心5min，離心后收集沉淀；
(12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇0.95ml,輕輕上下顛倒3 min;
(13)將(12)中所得物以5800g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ；
(14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 49PL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中；
b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量。
[0028]胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8_0HdG特異抗體、通過ELISA檢測。8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買；
(1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml, 80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各49μL，分別加第一抗體溶液49μL，搖晃酶標(biāo)板使其充分混合，封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h ；
(2)反應(yīng)結(jié)束后,倒掉反應(yīng)液,分別加入洗凈液240μL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次； (3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液98PL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ；
(4)將所述酶標(biāo)板各孔板用洗凈液洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液98PL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min。反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合；
(5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液98μL,使反應(yīng)停止,在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值；各濃度標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的OD值分別為1.511，1.328，1.186,0.903,0.557,0.281 ;老化 0d，2d，4d，6d 玉米胚乳樣品對應(yīng)的 OD 值為:1.3601，1.1003,0.7611,0.3099 ；
(6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程y=- 0.5069x +1.4237，將各樣品檢測OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)值再乘以稀釋倍數(shù)5000即為各樣品實際濃度，老化0d，2d，4d，6d的玉米胚乳樣品對應(yīng)的實際8-OHdG濃度為:0.627 ng/g,3.191 ng/g, 6.536 ng/g, 10.986 ng/g ；
c、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力；
(1)種子老化模型的建立。
[0029]種子于45 °C、100%濕度條件下分別處理0d，2d，4d，6d，其發(fā)芽率分別為96.7%、83.3%,36.7%、0%，種子活力隨老化天數(shù)增加而劇烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
[0030]根據(jù)測定結(jié)果,8-OHdG含量在當(dāng)年玉米種子中低于1.00 ng/g ;老化2天的種子為1.00-6.00 ng/g ;老化4天的種子為6.00-9.00 ng/g ;老化6天種子基本死亡,8-OHdG含量大于10.00 ng/g。此范圍適用于大多數(shù)玉米品種活力的檢測分析。整個實驗過程8 h即可完成。
[0031]實施例5
一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，它由以下步驟組成:
a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA ；
Cl)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.15 g ；(2)將(I)中所得胚乳和Iml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中；CTAB 溶液由 3%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,20 mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 20mmol/LDTT 組成；
(3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次；
(4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ；
(5)向(4)中所得的胚乳中加入Iml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(6)將(5)所得胚乳以6000g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(7)向(6)中所得上清液中加入Iml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(8)將(7)所得物以6000g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次；
(10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時；
(11)將(10)所得物以6000g離心力離心5min,離心后收集沉淀；
(12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇Iml,輕輕上下顛倒3 min;
(13)將(12)中所得物以6000g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ；
(14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 50μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中；
b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量。
[0032]胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8_0HdG特異抗體、通過ELISA檢測。8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買；
(1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml, 80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各50μL，分別加第一抗體溶液50μL，搖晃酶標(biāo)板使其充分混合，封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h;
(2)反應(yīng)結(jié)束后,倒掉反應(yīng)液,分別加入洗凈液250μL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次；
(3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液100μL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ；
(4)將所述酶標(biāo)板各孔板用洗凈液洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液100μL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min。反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合；
(5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液?οομL,使反應(yīng)停止,在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值；各濃度標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的OD值分別為1.511，1.328，1.186,0.903,0.557,0.281 ;老化0d，2d，4d，6d 玉米胚乳樣品對應(yīng)的 OD值為:1.3729，1.0651,0.6631,0.2349 ；
(6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程y=- 0.5069x +1.4237，將各樣品檢測OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)值再乘以稀釋倍數(shù)5000即為各樣品實際濃度，老化0d，2d，4d，6d的玉米胚乳樣品對應(yīng)的實際8-OHdG濃度為:0.501 ng/g,3.537 ng/g, 7.502 ng/g, 11.726ng/g ；
c、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力；
(I)種子老化模型的建立。[0033]種子于45 °C、100%濕度條件下分別處理0d，2d，4d，6d，其發(fā)芽率分別為96.7%、83.3%,36.7%、0%，種子活力隨老化天數(shù)增加而劇烈下降；
(2)胚乳DNA 8-OHdG氧化水平。
[0034]根據(jù)測定結(jié)果,8-OHdG含量在當(dāng)年玉米種子中低于1.00 ng/g ;老化2天的種子為1.00-6.00 ng/g ;老化4天的種子為6.00-9.00 ng/g ;老化6天種子基本死亡,8-OHdG含量大于10.00 ng/g。此范圍適用于大多數(shù)玉米品種活力的檢測分析。整個實驗過程8 h即可完成。
[0035]實施例6
一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，它由以下步驟組成:
a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA ；
Cl)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.16 g ；
(2)將(I)中所得胚乳和1.05 ml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 20mmol/LDTT 組成； (3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次；
(4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ；
(5)向(4)中所得的胚乳中加入1.05ml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(6)將(5)所得胚乳以6200g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(7)向(6)中所得上清液中加入1.05ml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(8)將(7)所得物以6200g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次；
(10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時；
(11)將(10)所得物以6200g離心力離心5min,離心后收集沉淀；
(12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇1.05ml,輕輕上下顛倒3 min;
(13)將(12)中所得物以6200g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ；
(14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 5?μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中；
b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量。
[0036]胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8_0HdG特異抗體、通過ELISA檢測。8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買；
(1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml, 80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各5WL，分別加第一抗體溶液5WL，搖晃酶標(biāo)板使其充分混合，封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h;
(2)反應(yīng)結(jié)束后,倒掉反應(yīng)液,分別加入洗凈液260μL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次；
(3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液102PL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ；(4)將所述酶標(biāo)板各孔板用洗凈液洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液102PL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min。反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合；
(5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液102μL,使反應(yīng)停止,在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值；各濃度標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的OD值分別為1.511，1.328，1.186,0.903,0.557,0.281 ;老化 0d，2d，4d，6d 玉米胚乳樣品對應(yīng)的 OD值為:1.3998，0.8693，0.7082，0.1968 ；
(6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程y=- 0.5069x +1.4237，將各樣品檢測OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)值再乘以稀釋倍數(shù)5000即為各樣品實際濃度，老化0d，2d，4d，6d的玉米胚乳樣品對應(yīng)的實際8-OHdG濃度為:0.236 ng/g,
5.469 ng/g, 7.058 ng/g, 12.102 ng/g;
C、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力；
(1)種子老化模型的建立。
[0037]種子于45 °C、100%濕度條件下分別處理0d，2d，4d，6d，其發(fā)芽率分別為96.7%、83.3%,36.7%、0%，種子活力隨老化天數(shù)增加而劇烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
[0038]根據(jù)測定結(jié)果,8-OHdG含量在當(dāng)年玉米種子中低于1.00 ng/g ;老化2天的種子為1.00-6.00 ng/g ;老化4天的種子為6.00-9.00 ng/g ;老化6天種子基本死亡,8-OHdG含量大于10.00 ng/g。此范圍適用于大多數(shù)玉米品種活力的檢測分析。整個實驗過程8 h即可完成。
[0039]實施例7
一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，它由以下步驟組成:
a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA ；
Cl)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.17g ；
(2)將(I)中所得胚乳和1.10 ml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 20mmol/LDTT 組成；
(3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次；
(4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ；
(5)向(4)中所得的胚乳中加入1.1Oml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(6)將(5)所得胚乳以6400g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(7)向(6)中所得上清液中加入1.1Oml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻；
(8)將(7)所得物以6400g離心力離心5 min，離心后收集上清液；
(9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次；
(10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時；
(11)將(10)所得物以6400g離心力離心5min,離心后收集沉淀；
(12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇1.1Oml,輕輕上下顛倒3 min;(13)將(12)中所得物以6400g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ；
(14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 52μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中；
b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量。
[0040]胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8_0HdG特異抗體、通過ELISA檢測。8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買；
(1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml, 80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各52μL，分別加第一抗體溶液52μL，搖晃酶標(biāo)板使其充分混合，封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h;
(2)反應(yīng)結(jié)束后,倒掉反應(yīng)液,分別加入洗凈液270μL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次；
(3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液104μL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ；
(4)將所述酶標(biāo)板各孔板用洗凈液洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液104PL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min。反 應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合；
(5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液104μL,使反應(yīng)停止,在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值；各濃度標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的OD值分別為1.511，1.328，1.186,0.903,0.557,0.281 ;老化 0d，2d，4d，6d 玉米胚乳樣品對應(yīng)的 OD值為:1.3863，0.9364，0.5983，0.2740 ；
(6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程y=- 0.5069x +1.4237，將各樣品檢測OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)值再乘以稀釋倍數(shù)5000即為各樣品實際濃度，老化0d，2d，4d，6d的玉米胚乳樣品對應(yīng)的實際8-OHdG濃度為:0.369 ng/g,4.807 ng/g, 8.142 ng/g, 11.341 ng/g ；
c、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力；
(1)種子老化模型的建立。
[0041]種子于45 °C、100%濕度條件下分別處理0d，2d，4d，6d，其發(fā)芽率分別為96.7%、83.3%,36.7%、0%，種子活力隨老化天數(shù)增加而劇烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
[0042]根據(jù)測定結(jié)果,8-OHdG含量在當(dāng)年玉米種子中低于1.00 ng/g ;老化2天的種子為
1.00-6.00 ng/g ;老化4天的種子為6.00-9.00 ng/g ;老化6天種子基本死亡,8-OHdG含量大于10.00 ng/g。此范圍適用于大多數(shù)玉米品種活力的檢測分析。整個實驗過程8 h即可完成。
[0043]以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明整體構(gòu)思前提下，還可以作出若干改變和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍，這些都不會影響本發(fā)明實施的效果和專利的實用性。
【權(quán)利要求】
1.一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，其特征在于:它由以下步驟組成:玉米胚乳核DNA的提取，玉米胚乳核DNA氧化損傷檢測，玉米胚乳核DNA活力分析。
2.如權(quán)利要求1所述的一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，其特征在于:所述玉米胚乳核DNA的提取利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB);所述玉米胚乳核DNA氧化損傷檢測利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳核DNA中8_0HdG的含量；所述玉米胚乳核DNA活力分析通過建立種子老化模型實現(xiàn)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，其特征在于:它由以下步驟組成: a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA； (1)室溫下，老化Od，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.13^0.17 g ； (2)將(1)中所得胚乳和0.9^1.1 ml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中； (3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次； (4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ； (5)向(4)中所得的胚乳中加入0.9^1.1 ml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻； (6)將(5)所得胚乳以5600^6400g離心力離心5 min，離心后收集上清液； (7)向(6)中所得上清液中加入0.擴(kuò)1.1 ml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻； (8)將(7)所得物以5600^6400g離心力離心5 min，離心后收集上清液； (9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次； (10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時； (11)將(10)所得物以5600~6400g離心力離心5 min，離心后收集沉淀; (12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇0.9^1.1 ml，輕輕上下顛倒3 min ； (13)將(12)中所得物以5600~6400g離心力離心5 min，離心后收集沉淀，室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ； (14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 48~52μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中； b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8_0HdG的含量； 胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8-OHdG特異抗體、通過ELISA檢測；8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買； (1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml,40 pg/ml,80 pg/ml的8_0HdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各48~52 μL，向各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液中分別加第一抗體溶液48、2μL,搖晃酶標(biāo)板使其充分混合,封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h ； (2)反應(yīng)結(jié)束后，倒掉反應(yīng)液，分別加入洗凈液230-270PL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次； (3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液96~104μL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴1h ； (4)將所述酶標(biāo)板各孔板用洗凈液洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液96~104μL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min ;反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合；(5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液96~104PL，使反應(yīng)停止，在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值； (6) 用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程，將各樣品檢測OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)值再乘以稀釋倍數(shù)即為各樣品中8-OHdG濃度； C、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，其特征在于:它由以下步驟組成: a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA； (1)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.14"?.16 g ； (2)將(I)中所得胚乳和0.95^1.05 ml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中； (3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次； (4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ； (5)向(4)中所得的胚乳中加入0.95~1.05 ml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻； (6)將(5)所得胚乳以5800^6200g離心力離心5 min，離心后收集上清液； (7)向(6)中所得上清液中加入0.95~1.05 ml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻； (8)將(7)所得物以5800^6200g離心力離心5 min，離心后收集上清液； (9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次； (10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時； (11)將(10)所得物以5800~6200g離心力離心5 min，離心后收集沉淀; (12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇0.95~1.05 ml,輕輕上下顛倒3 min ； (13)將(12)中所得物以5800~6200g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ； (14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 49~5?μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中； b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量； 胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8-OHdG特異抗體、通過ELISA檢測；8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買； (1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml, 80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各49~5?μL，分別加第一抗體溶液49~5?μL，搖晃酶標(biāo)板使其充分混合，封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h ； (2)反應(yīng)結(jié)束后，倒掉反應(yīng)液，分別加入洗凈液240-260PL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次； (3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液98~102PL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ； (4)將所述酶標(biāo)板各孔板用洗凈液洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液98~102μL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min ;反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合； (5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液98~102μL，使反應(yīng)停止，在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值； (6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程，將樣品溶液OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)再乘以稀釋倍數(shù)即為各樣品中8-OHdG濃度； C、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力。
5.如權(quán)利要求1或2或3或4所述的一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，其特征在于:它由以下步驟組成: a、利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取單粒玉米胚乳核DNA； Cl)室溫下，老化0d，2d，4d，6d的單粒玉米種子于蒸餾水中吸漲2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.15 g ； (2)將(I)中所得胚乳和Iml預(yù)熱的65°C的CTAB溶液加入研缽中快速研磨至胚乳呈勻漿狀，將其傾入離心管中； (3)將(2)中所得的勻漿狀的胚乳在65°C溫度下保育20min，期間輕輕上下顛倒2次； (4)保育結(jié)束后，將(3)中所得的胚乳室溫放置5min ； (5)向(4)中所得的胚乳中加入Iml苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25:24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻； (6)將(5)所得胚乳以6000g離心力離心5min，離心后收集上清液； (7)向(6)中所得上清液中加入Iml氯仿/異戊醇體積比為24:1的溶液，輕輕上下顛倒至混勻； (8)將(7)所得物以6000g離心力離心5 min，離心后收集上清液； (9)向(8)中所得上清液中加入上清液體積的0.6倍的異丙醇，輕輕上下顛倒一次； (10)將(9)所得物在4°C溫度下保育I小時； (11)將(10)所得物以6000g離心力離心5min，離心后收集沉淀； (12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇Iml，輕輕上下顛倒3 min ； (13)將(12)中所得物以6000g離心力離心5 min，離心后收集沉淀、室溫干燥，得到玉米胚乳核DNA ； (14)將(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 50μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中； b、利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測胚乳DNA中8-OHdG的含量； 胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化損傷利用8-OHdG特異抗體、通過ELISA檢測；8-OHdG檢測試劑盒可以商業(yè)購買； (1)在96 孔板的各孔加濃度分別為 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml, 80 pg/ml的8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各50μL，分別加第一抗體溶液50μL，搖晃酶標(biāo)板使其充分混合，封蓋后在37°C的環(huán)境中溫浴I h; (2)反應(yīng)結(jié)束后,倒掉反應(yīng)液,分別加入洗凈液250μL，左右搖晃，使其充分洗凈，然后倒掉洗凈液，重復(fù)操作3次； (3)向所述酶標(biāo)板各孔板中加第二抗體溶液100μL，封蓋后在37°C環(huán)境中溫浴Ih ； (4)將所述酶標(biāo)板各孔板用洗凈液洗滌3次，分別加入發(fā)光劑溶液100μL，封蓋后在常溫下反應(yīng)15 min ;反應(yīng)中用錫箔紙包住酶標(biāo)板以避光，左右搖晃，使其充分混合； (5)向所述酶標(biāo)板各孔板中加反應(yīng)終止液?οομL,使反應(yīng)停止,在酶標(biāo)儀上用450nm波長測定吸光度，得到各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液的相應(yīng)OD值；(6)用已知標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其相應(yīng)的OD值做半對數(shù)曲線，得出回歸方程，將樣品溶液OD值代入此方程中，求得其反對數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)即為樣品中8-OHdG濃度； C、通過與老化種子測定結(jié)果的比較，評價單粒種子的活力。
6.如權(quán)利要求3或4或5所述的一種單粒玉米種子活力快速檢測方法，其特征在于:所述CTAB溶液由 3%CTAB ，0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,20 mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl,20mmol/LDTT 組成。
【文檔編號】A01C1/02GK103959955SQ201410125787
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】王偉, 吳曉林, 鞏方平 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)