生防菌qn-1123及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生防菌QN-1123，屬于木霉菌，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC?N0：M2013694。本發(fā)明的菌株對花生的葉腐病具有良好的抑制和防治效果。
【專利說明】生防菌QN-1123及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及防治花生葉腐病的生防菌株及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]花生葉腐病是由絲核菌引起的一種病害，在花生上危害極為嚴重，具有很高的死株率，嚴重影響花生這一主要油料作物的產(chǎn)量。花生葉腐病發(fā)病時會導(dǎo)致花生葉片生滿蛛網(wǎng)狀菌絲體，然后形成塊狀褐色或黑褐色病斑，導(dǎo)致葉片變黑褐色，枯干卷縮，下雨后明顯霉?fàn)€，最后枯干死亡。
[0003]當(dāng)前，針對花生葉腐病的防治主要是化學(xué)方法，常用的農(nóng)藥有百菌清、葉扶力、惡霜靈、多菌靈等，但這些農(nóng)藥噴灑以后的殘留物會污染環(huán)境，在噴灑時對施用者自身也有一定的毒害作用，大規(guī)模長期使用會破壞生態(tài)系統(tǒng)。
[0004]因此本領(lǐng)域亟需一種能夠保持傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的防效，但又不會造成生態(tài)環(huán)境負擔(dān)的廣品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的需要，本發(fā)明 申請人:通過大量的篩選實驗從木霉菌中獲得了能夠有效抑制花生葉腐病的菌株，該菌株對花生葉腐病菌具有良好的殺滅作用。
[0006]基于上述發(fā)現(xiàn)， 申請人:完成了本發(fā)明。
[0007]首先，本發(fā)明公開了一種采用土壤懸浮液法，利用孟加拉紅培養(yǎng)基篩選的菌株，對其鑒定結(jié)果表明該菌株屬于木霉菌，該菌株命名為康氏木霉(Trichoderm koningii)QN-1123。該菌株已經(jīng)保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2013年12月
23H，保藏號為 CCTCC NO:M2013694o
[0008]生物學(xué)培養(yǎng)表明，該菌株具有如下特征:菌落白色、淺黃色或深綠色，輕度毛發(fā)狀。孢子梗叢束狀長出，排成環(huán)狀帶。分枝多，主分枝上又以2~3個為一組長出次級分枝，分枝角度大。瓶?；勘戎虚g窄，瓶梗上部變細。終極瓶梗下5個以內(nèi)的瓶梗排成假輪狀。分生孢子橢圓形或近圓柱形，單個孢子青綠色或無色，大小為3~4.8 X 1.9~2.8 μ m。
[0009]進一步的， 申請人:研究了最適合本發(fā)明菌株的培養(yǎng)條件，在不同的狀態(tài)下最適宜的培養(yǎng)基略有不同。下述所米用的培養(yǎng)條件為最優(yōu)的，稍微改變培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間不會影響菌株的活性。
[0010]生防菌固體培養(yǎng)條件:PDA培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)7d。
[0011]生防菌液體培養(yǎng)條件:ro培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)7d。
[0012]生防菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基:采用常見發(fā)酵用培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)7d。
[0013]最后，本發(fā)明公開了所述生防菌QN-1123在抑制和防治花生葉腐病中的應(yīng)用。 申請人:進行的實驗顯示，采用本發(fā)明QN-1123菌株懸浮液處理已經(jīng)患有葉腐病的花生植株后，花生葉腐病明顯減輕；將本發(fā)明QN-1123菌株與花生葉腐病菌對峙培養(yǎng)，花生葉腐病菌生長受到明顯抑制；由此可以看出，本發(fā)明的菌株對花生葉腐病防治作用明顯。[0014]生物材料樣品保藏
[0015]康氏木霉(Trichoderm koningii) QN-1123，中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)Ji址位于中國武漢大學(xué)，保藏日期為2013年12月23日，保藏號為CCTCC NO:M2013694。
【具體實施方式】
[0016]在下述實施例中所用的培養(yǎng)基如其培養(yǎng)基名稱所示，均可從試劑公司購買，也可自行配制，盡管不同公司銷售的培養(yǎng)基組成可能略有不同，但均可用于本發(fā)明。典型的培養(yǎng)基組成如下所示:
[0017]PDA 培養(yǎng)基，馬鈴薯 200g.L-1，葡萄糖 20g.L-1，瓊脂 17g.L-1 ；
[0018]PD培養(yǎng)基，馬鈴薯200g.L-1，葡萄糖20g.L-1 ；
[0019]發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯200g*L_l，蔗糖10g*L_l，葡萄糖1g.L-1，無水乙酸鈉1.66g.L-1，MgS04.7H205.29g.L-1，蛋白胨 0.5g.L-1,氯化錳 0.15g.L-1,消泡劑0.045g.L-1，25°C培養(yǎng) 7d。
[0020]實施例1:QN_1123菌株的篩選和培養(yǎng)
[0021]拮抗花生葉腐病菌木霉菌的分離篩選過程如下:
[0022](I) 土壤懸浮液制備:稱取選用的土壤樣品，稀釋成懸浮液至10' 10' 10-4 ；
[0023](2)木霉菌選擇 培養(yǎng)基配置:即孟加拉紅培養(yǎng)基；
[0024](3)平板涂布:將土壤稀釋懸浮液在振蕩器上振蕩40-50S，吸取100 μ L溶液至培養(yǎng)皿中央，用涂布棒涂勻，并做好濃度標(biāo)記，涂好的平板正放靜置5min，使溶液滲透平板中，重復(fù)3次，之后，將涂布好的平板倒置于25°C人工氣候箱中培養(yǎng)3d ；
[0025](4)菌株篩選:將上述分離的木霉菌轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基中，進一步采用單孢純化培養(yǎng)獲得對應(yīng)菌株。菌株篩選以菌落均勻一致、菌絲豐富且產(chǎn)孢量大為指標(biāo)。
[0026](5)對峙培養(yǎng):將大板篩出的理想菌株與病原菌做對峙培養(yǎng)，即將木霉和葉腐病菌點接在平板內(nèi)中心點兩側(cè)，間距3cm，倒置放入25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)3次，僅接種葉腐病菌菌株為對照，定期觀察木霉菌對其抑制作用，并記錄菌落生長半徑及互作情況。
[0027](6)在對峙培養(yǎng)12h時，挑取兩菌落交界面菌絲制片，用顯微鏡觀察木霉菌與葉腐病菌交集處菌絲生長情況，并作連續(xù)跟蹤觀察。
[0028]實施例2 =QN-1123菌株對花生葉腐病菌的抑制實驗
[0029]在實驗室內(nèi)，將生防菌QN-1123與花生葉腐病菌(相同用量)在25°C、無菌條件下，進行對峙培養(yǎng)，培養(yǎng)基質(zhì)采用PDA培養(yǎng)基，7d后測定花生葉腐病菌的生長量和菌落直徑，以對照(不接種生防菌，其他條件與實驗組相同)為100%生長量測算生防菌對花生葉腐病菌的抑制率。
[0030]實驗結(jié)果顯示，與對照組相比較，本發(fā)明菌株在與花生葉腐病菌對峙培養(yǎng)實驗中的抑菌效果為78.5%。
[0031]實施例3 =QN-1123菌株在花生植株活體上對花生葉腐病菌的防治實驗
[0032]I)在室內(nèi)環(huán)境下，盆栽花生植株至下針期，然后在花生植株上接菌QN-1123孢子懸浮液15個孢子/L)，Id后挑戰(zhàn)接菌花生葉腐病菌(W/V= 1%菌懸浮液)，接種后將處理植株和對照植株置于溫室內(nèi)培養(yǎng)(25°C，開始24h內(nèi)保持葉面有水滴或處于濕潤狀態(tài))；[0033]2)在室內(nèi)環(huán)境下，盆栽花生植株至下針期，然后在花生植株上先接種花生葉腐病菌(W/V= I %菌懸浮液)，Id后再接種生防菌QN-1123 15個孢子/L)，然后將試驗花生植株和對照植株置于溫室內(nèi)進行培養(yǎng)(25°C，開始24h內(nèi)保持葉面有水滴或處于濕潤狀態(tài))。
[0034]15d時測定發(fā)病率和病情指數(shù)，計算生防菌對花生葉腐病的防治效果。
[0035]實驗結(jié)果顯示，在條件I)下，本發(fā)明菌株能顯著抑制花生的葉腐病發(fā)病率，相對于對照組，發(fā)病率降低62.2%;在條件2)下，花生的葉腐病抑制效果為59.8%。實施例4:拮抗實驗
[0036]將生防菌QN-1123于H)營養(yǎng)液中培養(yǎng)7d,濾掉菌絲，然后用生防菌濾液配置成PDA培養(yǎng)基和ro培養(yǎng)液，對照組用清水配置PDA培養(yǎng)基和ro培養(yǎng)液，將上述培養(yǎng)基和ro培養(yǎng)液接菌花生葉腐病菌，7d后測定病菌菌落直徑和菌絲生長量，并計算抑菌效果。固體發(fā)酵培養(yǎng)基接種量按17%，培養(yǎng)基含水量40%進行接種。
[0037]實驗結(jié)果顯示，與對照組相比較，本發(fā)明菌株的抑菌效果為75.3%。
[0038]實施例5:田間實驗
[0039]在山東省花生研究所國家花生種源基地進行了小區(qū)實驗，設(shè)3個處理，處理I為滅菌水對照組，處理2為生防菌QN-1123 (6 X 15個孢子/mL)，處理3為殺真菌劑多菌靈(南通潤鴻生物化學(xué)有限公司)。
[0040]每個處理設(shè)3個小區(qū)重復(fù),每個小區(qū)面積為100m2，在花生從播種生長至100天時噴灑各制劑，采用相同 的用量(每平米每株200ml，其中含制劑3g)。噴灑完成三天后調(diào)查防治效果。
[0041]實驗結(jié)果顯示，與對照組相比較，本發(fā)明菌株對花生葉腐病防治作用明顯，效果為61.2%，多菌靈對照組的效果為64.1%，說明本發(fā)明的菌株達到了與傳統(tǒng)化學(xué)藥物相當(dāng)?shù)姆佬А?br> 【權(quán)利要求】
1.生防菌QN-1123，屬于木霉菌，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC NO:M2013694o
2.權(quán)利要求1所述生防菌QN-1123的培養(yǎng)方法，其特征在于在固體培養(yǎng)條件下，25°C下采用PDA培養(yǎng)基作為基質(zhì)。
3.權(quán)利要求1所述生防菌QN-1123的培養(yǎng)方法，其特征在于在液體培養(yǎng)條件下，25°C下采用ro培養(yǎng)基作為基質(zhì)。
4.權(quán)利要求1所述生防菌Q N-1123在抑制和防治花生葉腐病中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01N63/04GK104031842SQ201410128380
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】鄢洪海, 夏淑春, 張茹琴, 遲玉成 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)