一種將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或近緣種進行瞬時表達的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種通過農(nóng)桿菌注射滲透法將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或近緣種進行瞬時表達的方法，該外源基因為GUS基因，由攜帶35s啟動子及終止子，小于10kb的過量表達載體質(zhì)粒攜帶。主要步驟包括（1）植株的獲得（2）植物表達載體pORER1-2×35s:gus的構(gòu)建（3）侵染液制備（4）菊花葉片的制備（5）葉片轉(zhuǎn)化（6）葉片轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)（7）陽性轉(zhuǎn)化葉片檢測。本發(fā)明通過選擇合適的外植體、以農(nóng)桿菌菌株作為易感菌株，通過利福平和卡那霉素選擇侵染菌體；同時，以P19與農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)制成侵染液，P19能有效抑制植物對外源導(dǎo)入載體表達的沉默效應(yīng)，提高表達量，并且合理優(yōu)化共培養(yǎng)條件，使該方法轉(zhuǎn)化時間縮短至45天左右，轉(zhuǎn)化效率達到60%以上。本發(fā)明方法為更有效地篩選和分析菊花基因功能、蛋白質(zhì)定位及進一步獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子提供了可能。
【專利說明】一種將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或近緣種進行瞬時表達的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種通過農(nóng)桿菌注射滲透法將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或近緣種進行瞬時表達的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.),原產(chǎn)中國，屬于菊科菊屬宿根性多年生草本花卉，在我國已有3000多年的栽培歷史，是中國十大名花之一，同時它也是世界四大切花之首，占全球切花數(shù)量的30%(洪波等，2009)。菊花觀賞價值高，近年來在綠化美化中的應(yīng)用越來越多，是一種大眾消費型花卉，急需加大菊花品種選育及創(chuàng)新工作的進度(朱明濤等，2011)，從而提供良好的經(jīng)濟效益和社會效益。但是，受到物種自身基因的限制，傳統(tǒng)育種方法難以獲得成功，雖然遠源雜交取得了一些成果，但也不可能隨意引入需要的基因。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為菊花育種提供了全新的思路和途徑。
[0003]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因是研究菊花基因功能和獲得遺傳修飾有機體的最常用手段之一。隨著研究的進行，發(fā)現(xiàn)由于菊花遺傳背景的復(fù)雜性，大量的外源基因在菊花中沒有獲得預(yù)期表達，該傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法在菊花中的應(yīng)用受到較大的限制(于鑫等，2009)。
[0004]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達方法是近年來發(fā)展形成的一種快速有效的分析蛋白質(zhì)表達的方法，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因過程相比較，具有周期短、安全高效、操作簡易、費用相對較低、轉(zhuǎn)化效率高、能同時感染多個品種的優(yōu)點。目前該方法已經(jīng)在許多植物組織中取得了成功，如煙草葉片、擬南芥葉片、月季花瓣、半夏無菌葉片、番茄葉片和果實、葡萄葉片等。但是在菊花中進行表達存在轉(zhuǎn)化效率低、外源基因表達量低、嵌合體株率高及再生過程中基因沉默等問題；外植體的選擇、抗生素的確定、易感菌株的選用、共培養(yǎng)條件等對轉(zhuǎn)化效率起著決定性作用，且存在操作繁瑣、周期長的問題，通常需要4-6個月，綜合菊花轉(zhuǎn)基因的成功案例中不同菌株的使用情況，遺傳轉(zhuǎn)化率低下，一般在5-40% (Teixeiraetal.，2013)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種將外源基因轉(zhuǎn)入菊花及近緣種中進行瞬時表達的方法，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)，通過構(gòu)建植物表達載體p0RERl-2X35s:gus，使外源基因⑶S在菊花及近緣種進行瞬時表達，解決了目前農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菊花遺傳轉(zhuǎn)化周期長、效率低的問題，為更有效地篩選和分析菊花基因功能、蛋白質(zhì)定位及進一步獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子提供了可能。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段:
[0007]一種將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或菊花近緣種進行瞬時表達的方法，通過農(nóng)桿菌注射滲透法將含有⑶S基因的瞬時表達載體轉(zhuǎn)入菊花及菊花近緣種葉肉細胞中，經(jīng)培養(yǎng)，使⑶S基因在葉片中表達。
[0008]一種將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或菊花近緣種進行瞬時表達的方法，作為優(yōu)選，瞬時表達載體為攜帶35s啟動子及終止子,小于IOkb的過量表達載體質(zhì)粒。
[0009]一種將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或菊花近緣種進行瞬時表達的方法，包括如下步驟:[0010](I)植株的獲得:采用生根后30d-50d，有完全展開葉10-14片的菊花扦插苗；選取扦插苗中上部完全展開葉進行標記，以備注射；
[0011](2)植物表達載體p0RERl-2X35s:gus的構(gòu)建:設(shè)計引物分別為上游引物2X35S-Sac-F:SEQIDN0.2，下游引物 2 X 35S_Nhe_R: SEQIDN0.3，以 pCAMBIA1301 質(zhì)粒DNA 為模板，用高保真酶進行PCR擴增反應(yīng)，在PCAMBIA1301質(zhì)粒DNA上游和下游分別引入Sac II和NheI酶切位點，PCR產(chǎn)物回收；PCR產(chǎn)物與Sac II和NheI雙酶切后的pORERl載體連接，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細胞，提取陽性質(zhì)粒，植物表達載體p0RERl-2X35s:gus構(gòu)建成功；
[0012](3)侵染液制備:將p0RERl-2X35s:gus轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中；挑取單克隆，PCR電泳檢測，選取正確構(gòu)建質(zhì)粒的單克隆陽性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入YEB液體培養(yǎng)基中，過夜輕搖培養(yǎng)16~20h，同時搖菌P19 ;把搖好的兩種菌液進行常溫離心，去上清，收集菌體，分別用侵染緩沖液重懸；將含有正確構(gòu)建質(zhì)粒的陽性農(nóng)桿菌菌液與P19等體積混合，然后將混合菌液常溫輕搖培養(yǎng)至少3小時；[0013](4)菊花葉片的制備:于葉片近軸端主葉脈中部兩側(cè)無葉脈處點刻傷或十字刻傷，傷口只需透過葉表皮，不可穿透葉片；
[0014](5)葉片轉(zhuǎn)化:以去除針頭的注射器優(yōu)選的為2ml注射器吸取步驟3)制備的侵染液，出水口對準刻傷處，緩?fù)谱⑸淦骰钊?，同時手指輕壓刻傷處對應(yīng)的葉片遠軸端位置，以使侵染液滲透入葉片背面，重復(fù)數(shù)次以使侵染液盡可能蔓延至整個葉片，標記下注射的葉片對應(yīng)區(qū)域；
[0015](6)葉片轉(zhuǎn)化后培養(yǎng):將轉(zhuǎn)化后的扦插苗用保鮮膜封閉保濕，置于黑暗中培養(yǎng)
1.5-2d，然后再轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)2-3d，獲得轉(zhuǎn)化后的活體植株；
[0016](7)陽性轉(zhuǎn)化葉片檢測:以X-Gluc染色反應(yīng)液浸沒標記葉，過夜染色后脫色至透明狀后，觀察葉片GUS染色狀況；設(shè)計⑶S基因引物:上游引物⑶S-RT-F: SEQIDN0.4，下游引物⑶S-RT-R: SEQIDN0.5，選取標記葉片提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板PCR擴增檢測陽性轉(zhuǎn)化葉片中⑶S的表達。
[0017]一種將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或菊花近緣種進行瞬時表達的方法，作為優(yōu)選，上述反應(yīng)步驟2)中高保真酶采用TaKaRa的PrimeSTAR?HSDNAPolymerase ；PCR產(chǎn)物以凝膠回收試劑盒回收，采用熱激法轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細胞；PCR反應(yīng)體系，50 μ L含有:10XHSRCRBuffer5.0μ L,2X35S-Sac-F,20μmol.L- 的 2X35S_Nhe_R 引物各 1.0 μ L，
2.5mmol.L-1 的 dNTPmix4.0yL, PrimeSTAR?HSDNAPolymerase0.4 μ L，DNA 模板 I μ L,ddH2037.6 μ L ;反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性 4min，然后 94°C解鏈 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸lmin30sec,反應(yīng)30個循環(huán)，72°C延伸IOmin0
[0018]一種將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或菊花近緣種進行瞬時表達的方法，作為優(yōu)選，步驟3)中植物表達載體p0RERl-2X35s:gus以凍融法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的農(nóng)桿菌，所用農(nóng)桿菌菌株為EHA105，在YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，YEB培養(yǎng)基均添加有利福平和卡那霉素；農(nóng)桿菌在YEB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)使0D600達到1.0-1.8，搖菌P19也使0D600達到1.0-1.8 ;菌體收集進行離心時設(shè)置離心機轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心10min ;侵染緩沖液的配方為IOmMMES, 100 μ MAS,50mMMgCl2水溶液，pH=5.6 ;侵染緩沖液調(diào)整菌液濃度使0D600在0.4或0.6或0.8或1.0 ;加入P19后以200rpm轉(zhuǎn)速28°C培養(yǎng)。
[0019]一種將外源基因轉(zhuǎn)入菊花進行瞬時表達的方法，作為優(yōu)選，采用的菊花品種為優(yōu)香或神馬或近緣種菊花腦。
[0020]本發(fā)明通過選擇合適的外植體、以農(nóng)桿菌菌株作為易感菌株，通過利福平和卡那霉素選擇易感菌株；同時，以P19與農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)制成侵染液，能有效抑制植物對外源導(dǎo)入載體表達的沉默效應(yīng)，提高表達量，并且合理優(yōu)化以共培養(yǎng)條件，使該方法轉(zhuǎn)化時間縮短至45天左右，轉(zhuǎn)化效率達到60%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是p0RERl-2X35s:gus載體雙酶切驗證電泳檢測。
[0022]M:DL15000Marker, DL2000Markero 1、2:p0RERl_2X35s:gus 載體雙酶切。
[0023]圖2是含pORERl-2 X 35s: gus的農(nóng)桿菌菌液PCR擴增檢測電泳。
[0024]M:DL2000Marker ; 1-6:農(nóng)桿菌菌液；7:p0RERl_2 X 35s: gus 載體陽性對照；8:pORERl空載體陰性對照。
[0025]圖3是近緣種菊花腦、‘優(yōu)香’、‘神馬’扦插苗。a:近緣種菊花腦；b: ‘優(yōu)香’ 神馬，。
[0026]圖4是p0RERl_2X35s:gus轉(zhuǎn)化葉片的⑶S染色狀況。
[0027]yl-y5: ‘優(yōu)香’從形態(tài)學(xué)上端至形態(tài)學(xué)下端數(shù)第1_5片完全展開；
[0028]sl-s5: ‘神馬’從形態(tài)學(xué)上端至形態(tài)學(xué)下端數(shù)第1-5片完全展開葉；
[0029]jl-j5:近緣種菊花腦從形態(tài)學(xué)上端至形態(tài)學(xué)下端數(shù)第1-5片完全展開葉。
[0030]圖5是RT-PCR檢測pORERl-2 X 35s: gus陽性轉(zhuǎn)化葉片中⑶S的表達。
[0031]A:近緣種菊花腦；B: ‘優(yōu)香’ ；C: ‘神馬’ ο M:DL2000Markero
[0032]1-4:pORERl轉(zhuǎn)化第2_5片完全展開葉陰性對照；5:p0RERl-2 X 35s: gus載體陽性對照；6-9:p0RERl-2X35s:gus陽性轉(zhuǎn)化第2_5片完全展開葉。
[0033]圖6是植物表達載體p0RERl-2X35s:gus圖譜。
【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，實施例均在以本發(fā)明的技術(shù)方案為前提下進行實施的。
[0035]1、植株的獲得:采用生根后30d-50d，有完全展開葉10-14片的‘神馬’、‘優(yōu)香’、近緣種菊花腦扦插苗(圖3);選取長勢健壯苗，較嫩的、生長狀況良好的中上部完全展開葉4-5片進行標記，以備注射。
[0036]2.植物表達載體pORERl-2 X 35s: gus的構(gòu)建
[0037]設(shè)計引物:上游引物為2X35S-Sac-F:SEQIDN0.2，下游引物2X35S-Nhe-R:SEQIDN0.3,以 pCAMBIA1301 質(zhì)粒 DNA 為模板，用 TaKaRa 的PrimeSTARTMHSDNAPolymerase (一種高保真酶)進行PCR擴增反應(yīng)；其中，PCR過程中50 μ L反應(yīng)體系:10 X HSRCRBuf fer5.0 μ L, 20 μ mo I.L-1 的 2 X 35S_Sac_F、2 X 35S_Nhe_R 引物各
1.0 μ L，2.5mmol.L-1 的 dNTPmix4.0yL, PrimeSTARTMHSDNAPolymerase0.4 μ L，DNA 模板1 μ L，ddH2037.6 μ L ;反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性 4min，然后 94°C解鏈 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸lmin30sec，反應(yīng)30個循環(huán)，72°C延伸IOmin ;PCR產(chǎn)物用美國AXYGEN生產(chǎn)的凝膠回收試劑盒回收2 X 35S片段,送Invitrogen公司測序驗證。PCR產(chǎn)物與Sac II和NheI雙酶切的pORERl載體用TaKaRa的T4DNA連接酶于16°C、過夜連接16h。熱激法轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細胞，具體步驟為:(I) 10 μ L連接產(chǎn)物加入200 μ L感受態(tài)，冰浴30min ; (2)42°C熱激90s 后，立即冰浴 2min ; (3)加入 500 μ LLB 液體培養(yǎng)基，37°C 220rpm 搖菌 Ih ；(4) 6000rpm常溫離心5min，留40-60 μ L上清液，涂LB或Amp或Χ-gal或IPTG板，挑取陽性單克隆擴大培養(yǎng)；用Fermentas的Sac II和NheI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)并測序驗證。以AxyPrep質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取重組質(zhì)粒,植物表達載體pORERl-2X 35s: gus (圖6)構(gòu)建完成。
[0038]3.表達載體p0RERl_2X35s:gus轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0039]將上述構(gòu)建的植物表達載體p0RERl-2X35S:guS凍融法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的農(nóng)桿菌中，所用農(nóng)桿菌菌株為EHA105，挑取單克隆PCR電泳檢測，結(jié)果如圖3，選取陽性克隆于28V、220rpm搖菌培養(yǎng)后，將菌液分別加入終濃度為15%的無菌甘油后保存于_80°C冰箱中備用，用于轉(zhuǎn)化菊花葉片。同時以相同方法使空載PORERl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，作為轉(zhuǎn)化葉片的陰性對照。
[0040]以上步驟中，感受態(tài)農(nóng)桿菌制備過程，包括如下步驟:(I)從含有50μ g/ml利福平的YEB平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種于5ml含50 μ g/ml利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，200rpm，28°C過夜培養(yǎng)，I~2d ; (2)取2ml過夜培養(yǎng)液接種于50ml含相同抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，200rpm，28°C培養(yǎng)至0D600達0.5~0.6。(3)菌液冰浴30min，轉(zhuǎn)至50ml預(yù)冷的離心管中。(4) 4°C, 5000rpm, IOmin,收集菌體，將菌體重懸于冰預(yù)冷的2ml20mM無菌CaC12溶液中。以200μ1 /管將菌液分裝，置液氮中速凍lmin，_80°C保存。
[0041]植物表達載體p0RERl-2X35s:gus凍融法轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌EHA105，包括如下步驟:(1)將1 μl含量約為Ing的pORERl-2 X 35s: gus質(zhì)粒加于100 μ l感受態(tài)細胞中，冰浴30min ；(2)液氮速凍5min，37°C水浴融化5min。(3)加入1mlYEB液體培養(yǎng)基(添加50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)，280C，200rpm培養(yǎng)4~5h。(4)室溫6000rpm離心lmin,棄900 μ I上清液。(5)重懸沉淀，涂抹于含利福平50 μ g/ml和卡那霉素50 μ g/ml的YEB固體平板上，28°C倒置培養(yǎng)2~3d。
[0042]4.含pORERl-2 X 35s: gus的農(nóng)桿菌菌液PCR擴增檢測
[0043]挑選單菌落接種于50ml含利福平50 μ g/ml和卡那霉素50 μ g/ml的YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C、200rpm搖菌，以菌液為模板進行PCR檢測，25ul反應(yīng)體系如下:10XPCRBuffer2.5 μ I ；Mg2+l.5 μ I ；2.5mM 的 dNTPmixture2.0 μ I ; 10 μ M 的2X35S-Sac-Fl.0μ I ; 10 μ M 的 2 X 35S_Nhe-Rl.0 μ I ;農(nóng)桿菌菌液 1.0 μ I ；5U/y I 的 Taq 酶0.2μ I ；ddH2015.8μ I。
[0044]反應(yīng)條件為:95 °C預(yù)變性5min ;94 °C變性45s，55 °C退火45s，72 °C延伸45s，35個循環(huán)；72°C延伸lOmin，然后取5 μ IPCR反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時以空載pORERl轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌EHA105作為陰性對照檢測(見圖2)。PCR檢測陽性的農(nóng)桿菌單克隆即為 pORERl-2X 35s: gus 菌株。
[0045]5.侵染液制備
[0046]從含有50 μ g/mL的利福平和50 μ g/mL卡那霉素的YEB培養(yǎng)基挑取含有正確構(gòu)建質(zhì)粒p0RERl-2X35s:gus的陽性農(nóng)桿菌單克隆，同時也挑取含有空載的pORERl的陽性農(nóng)桿菌單克隆各在6mL含50 μ g/mL的利福平和50 μ g/mL的卡那霉素YEB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)16~20h ;同時等體積搖6mLP192份，P19能有效抑制植物對外源導(dǎo)入載體表達的沉默效應(yīng)，提高表達量。然后將四份菌液各轉(zhuǎn)入IOOmLYEB,含50μ g/mL的Rif5mg，50 μ g/mL的Kan5mg液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)16~20h搖至0D600約為1.0-1.8。轉(zhuǎn)搖利于防止產(chǎn)生死菌，利于保持菌活力，可以提高轉(zhuǎn)化率。然后把搖好的菌液4000rpml0min常溫離心，去上清，收集菌體，分別用10-16mL侵染緩沖液，其中緩沖液組分:10mMMES，100 μ MAS, 50mMMgC12水溶液50mL，pH=5.6重懸，用紫外分光光度儀測定0D600值，調(diào)整每種菌液的0D600均在0.8±0.02。再在含有不同表達載體的各菌液中，即含有正確構(gòu)建質(zhì)粒pORERl-2X35S:guS的陽性農(nóng)桿菌和含有空載的pORERl的陽性農(nóng)桿菌分別加入等體積的P19，然后將混合的菌液在28°C下以200rpm的轉(zhuǎn)速下再培養(yǎng)不少于3h后，備以注射合適大小的菊花葉片。
[0047]6.農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的滲透法瞬時轉(zhuǎn)化菊花葉片及轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)
[0048]‘優(yōu)香’、‘神馬’、近緣種菊花腦葉片注射前，先于葉片近軸端主葉脈中部兩側(cè)無葉脈處點刻傷，大小為0.1cmX0.1cm，傷口只需透過葉表皮，不可穿透葉片；葉片現(xiàn)刻現(xiàn)注射，以防汁液堵塞傷口，不利滲透。以去除針頭的2mL注射器吸取侵染液，出水口對準刻傷處，緩?fù)谱⑸淦骰钊?，同時手指輕壓刻傷處對應(yīng)的葉片遠軸端位置，以使侵染液滲透入葉片背面，可能需要多次操作才能滲透使整個葉片濕潤，每個葉位各注射8-12個葉片，并標記下注射的葉片對應(yīng)區(qū)域。將轉(zhuǎn)化后的扦插苗用保鮮膜封閉保濕，置于黑暗中培養(yǎng)2d，然后再轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)2d，獲得轉(zhuǎn)化后的活體植株。
[0049]7.陽性轉(zhuǎn)化葉片檢測
[0050]I)⑶S染色
[0051]選取標記葉片，清洗擦干后按葉位分別放于X-GlUC染色反應(yīng)液中浸沒，X-GlUC染色反應(yīng)液包括:50mMNaH2P04, ρΗ7.0 ；0.5mMK4[Fe (CN) 6] ；0.l%TritonX-100 ；20% 甲醇；
0.5mg/mlX-Gluc，真空抽氣lOmin，37°C避光過夜染色后，用70%乙醇過夜脫色，再換用95%乙醇脫色，葉片脫色至透明狀后，觀察葉片⑶S染色狀況(如圖4)。
[0052]由圖4可以看出切花菊‘優(yōu)香’的瞬時表達轉(zhuǎn)化效果最佳，‘神馬’表達效率最低；總體來說，同種植物，從形態(tài)學(xué)上端至形態(tài)學(xué)下端數(shù)第1-5片完全展開葉的表達效率先增后減，注射轉(zhuǎn)化葉片選擇第4片全部展開葉為宜。從葉片GUS染色情況可以看出同種植物同一葉位葉片的染色深淺不一致，表明植株自身狀況、侵染液滲透狀況對瞬時轉(zhuǎn)化有影響。由表1、圖4可以看出轉(zhuǎn)化后的葉片狀況及轉(zhuǎn)化率均為:‘優(yōu)香’最佳，近緣種菊花腦最差，反映植物種類、品種的轉(zhuǎn)化率存在差異性；由于其轉(zhuǎn)化后葉片GUS染色狀況，同種植物較嫩葉片受損較重，三種植物中近緣種菊花腦受損葉片較多，表明葉片的成熟度、葉片自身生長狀態(tài)、葉片厚薄、葉表皮光滑度等都對瞬時轉(zhuǎn)化效率存在一定影響。
[0053]表1瞬時轉(zhuǎn)化‘優(yōu)香’、‘神馬’、菊花腦葉片情況
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或菊花近緣種進行瞬時表達的方法，其特征在于:通過農(nóng)桿菌注射滲透法將含有GUS基因的瞬時表達載體轉(zhuǎn)入菊花及菊花近緣種葉肉細胞中，經(jīng)培養(yǎng)，使⑶S基因在葉片中瞬時表達。
2.權(quán)利要求1所述的將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或菊花近緣種進行瞬時表達的方法，其特征在于:瞬時表達載體為攜帶35s啟動子及終止子,小于IOkb的過量表達載體質(zhì)粒。
3.權(quán)利要求2所述的將外源基因轉(zhuǎn)入菊花進行瞬時表達的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)植株的獲得:采用生根后30d-50d，有完全展開葉10-14片的菊花扦插苗；選取扦插苗中上部完全展開葉進行標記，以備注射； (2)植物表達載體pORERl-2X35S:guS的構(gòu)建:設(shè)計引物分別為上游引物2X35S-Sac-F:SEQIDN0.2，下游引物 2 X 35S_Nhe_R: SEQIDN0.3，以 pCAMBIA1301 質(zhì)粒DNA 為模板，用高保真酶，進行PCR擴增反應(yīng)，在pCAMBIA1301質(zhì)粒DNA上游和下游分別引入Sac II和NheI酶切位點，PCR產(chǎn)物回收；PCR產(chǎn)物與Sac II和NheI雙酶切后的pORERl載體連接，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細胞，提取陽性質(zhì)粒，植物表達載體p0RERl-2X35S:guS構(gòu)建成功； (3)侵染液制備:將p0RERl-2X35s:gus轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中；挑取單克隆，PCR電泳檢測，選取正確構(gòu)建質(zhì)粒的單克隆陽性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入YEB液體培養(yǎng)基中，過夜輕搖培養(yǎng)16~20h，同時搖菌P19 ;把搖好的兩種菌液進行常溫離心，去上清，收集菌體，分別用侵染緩沖液重懸；將含有正確構(gòu)建質(zhì)粒的陽性農(nóng)桿菌菌液與P19等體積混合，然后將混合菌液常溫輕搖培養(yǎng)至少3小時； (4)菊花葉片的制備:于葉片近軸端主葉脈中部兩側(cè)無葉脈處點刻傷或十字刻傷，傷口只需透過葉表皮，不可穿透葉 片； (5)葉片轉(zhuǎn)化:以去除針頭的注射器優(yōu)選的為2ml注射器吸取步驟3)制備的侵染液，出水口對準刻傷處，緩?fù)谱⑸淦骰钊瑫r手指輕壓刻傷處對應(yīng)的葉片遠軸端位置，以使侵染液滲透入葉片背面，重復(fù)數(shù)次以使侵染液盡可能蔓延至整個葉片，標記下注射的葉片對應(yīng)區(qū)域； (6)葉片轉(zhuǎn)化后培養(yǎng):將轉(zhuǎn)化后的扦插苗用保鮮膜封閉保濕，置于黑暗中培養(yǎng)1.5-2d，然后再轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)2-3d，獲得轉(zhuǎn)化后的活體植株； (7)陽性轉(zhuǎn)化葉片檢測:以X-Gluc染色反應(yīng)液浸沒標記葉，過夜染色后脫色至透明狀后，觀察葉片⑶S染色狀況；設(shè)計⑶S基因引物:上游引物⑶S-RT-F: SEQIDN0.4，下游引物⑶S-RT-R: SEQIDN0.5，選取標記葉片提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板PCR擴增檢測陽性轉(zhuǎn)化葉片中⑶S的表達。
4.權(quán)利要求3所述的將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或菊花近緣種進行瞬時表達的方法，其特征在于，上述反應(yīng)步驟2)中高保真酶采用TaKaRa的PrimeSTAR?HSDNAPolymerasePCR ;產(chǎn)物以凝膠回收試劑盒回收，采用熱激法轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細胞；PCR反應(yīng)體系，50 μ L含有:10XHSRCRBuffer5.0μ L,2X35S-Sac-F,20ymol ?廠的丨2 X 35S_Nhe_R 引物各 1.0 μ L，2.5mmol.L-1 的 dNTPmix4.0 μ L，PrimeSTAR?HSDNAPolymerase0.4 μ L，DNA 模板 I μ L,ddH2037.6 μ L ;反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性 4min，然后 94°C解鏈 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸lmin30sec,反應(yīng)30個循環(huán)，72°C延伸IOmin0
5.權(quán)利要求4所述的將外源 基因轉(zhuǎn)入菊花或菊花近緣種進行瞬時表達的方法，其特征在于，步驟3)中植物表達載體pORERl-2X35s:gus以凍融法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的農(nóng)桿菌，所用農(nóng)桿菌菌株為EHA105，在50ml的YEB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；YEB培養(yǎng)基均添加有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素；農(nóng)桿菌在YEB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)使0D600達到1.0-1.8，搖菌P19使0D600也達到1.0-1.8 ;菌體收集進行離心時設(shè)置離心機轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心IOmin ;侵染緩沖液的配方為IOmMMES, 100 μ MAS, 50mMMgCl2水溶液，pH=5.6 ;侵染緩沖液調(diào)整菌液濃度使0D600在0.4或0.6或0.8或1.0 ;陽性農(nóng)桿菌菌液與P19等體積混合后以200rpm轉(zhuǎn)速28°C培養(yǎng)。
6.權(quán)利要求1-5任一項 所述的將外源基因轉(zhuǎn)入菊花或菊花近緣種進行瞬時表達的方法，其特征在于，采用的材料為菊花‘優(yōu)香’或‘神馬’或近緣種菊花腦(Chrysanthemumnankinginse)。
【文檔編號】A01H5/00GK103882054SQ201410131935
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】蔣甲福, 陽淑金, 宋愛萍, 陳發(fā)棣, 房偉民, 陳素梅, 管志勇, 滕年軍, 廖園, 趙爽 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)