轉基因抗蟲水稻對寄生性天敵稻虱纓小蜂安全性評價方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種轉基因抗蟲水稻對寄生性天敵稻虱纓小蜂安全性評價方法，有3個部分，Tier-1毒性測定試驗：評價轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對非靶標生物稻虱纓小蜂的潛在毒性；連續(xù)世代三級營養(yǎng)試驗：通過水稻—褐飛虱—稻虱纓小蜂的食物鏈評價轉Bt基因抗蟲水稻通過寄主介導對稻虱纓小蜂的安全性影響；蛋白傳遞規(guī)律：通過ELISA檢測手段鑒定稻虱纓小蜂暴露于轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的途徑和程度；最終，根據(jù)3方面數(shù)據(jù)綜合評價所述轉基因作物的種植對該非靶標生物產(chǎn)生的生態(tài)后果。本發(fā)明建立了一套系統(tǒng)、科學的評價方法，對完善轉基因作物對非靶標生物的影響研究以及確定轉基因作物種植的生態(tài)安全性具有重要意義。
【專利說明】轉基因抗蟲水稻對寄生性天敵稻虱纓小蜂安全性評價方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于轉基因作物生態(tài)風險評價【技術領域】，具體涉及一種轉基因抗蟲水稻對寄生性天敵稻虱纓小蜂安全性評價方法。
【背景技術】
[0002]水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界有30多億人口以稻米為食。同時水稻又是蟲害最多的糧食作物之一，每年由于稻縱卷葉螟、鉆蛀性螟蟲等鱗翅目昆蟲的為害，造成重大的產(chǎn)量損失(Cheng，1996 ;Nathan，2006)。在生產(chǎn)實際中，鱗翅目害蟲的防治長期依賴于化學農(nóng)藥，化學農(nóng)藥的濫用不但增加了水稻的生產(chǎn)成本，而且污染環(huán)境，還容易使害蟲產(chǎn)生抗性，降低農(nóng)藥的藥效(Su et al，2003)。因此，高抗鱗翅目的抗性品種是一種經(jīng)濟、有效、環(huán)保的防治手段。然而，在水稻及野生稻中，難以找到高抗鱗翅目昆蟲的抗源。要培育高抗鱗翅目害蟲的水稻品種，需借助于外源抗蟲基因。Bacillus thuringiensis (Bt)殺蟲蛋白被用作生物源殺蟲劑已經(jīng)有五十多年的歷史，對鱗翅目害蟲有穩(wěn)定的防治效果。目前轉Bt基因抗蟲水稻是控制鱗翅目害蟲的主要抗蟲水稻。[0003]然而，抗蟲轉基因植物的利用給人類帶來利益的同時，也存在一定潛在的生態(tài)風險。轉基因抗蟲植物的生態(tài)安全性評價集中在:對靶標害蟲的抗性治理、對非靶標生物和生物多樣性的影響、基因漂移問題和對土壤微生物的影響等。轉基因抗蟲植物對非靶標生物的潛在影響是有關轉基因作物環(huán)境風險評價的重要部分。目前，國際上的風險評價工作者以及轉基因植物相關管理部門廣泛采用“分層次評價體系”開展轉基因植物對非靶標生物影響方面的研究工作(Romeis et al., 2008 ;王圓圓等,2011)。該評價體系就是選擇合適的受試生物，然后依次開展從實驗室試驗到半田間試驗，再到田間試驗分層次分階段進行的系統(tǒng)評價。
[0004]褐飛風Nilaparvata lugens (SuU)是溫帶和熱帶水稻田間最主要的害蟲之一，是轉Bt基因水稻種植過程中重要的非靶標植食性昆蟲。稻虱纓小蜂是稻飛虱主要的卵寄生性天敵，能明顯降低稻飛虱的種群數(shù)量(Lou et al.，2013)，在稻田中，卵寄生蜂有可能通過半翅目昆蟲的蜜露，花粉，花蜜或者其它植物液體暴露于Bt蛋白，有存在生態(tài)風險的可能性，研究轉基因水稻對稻虱纓小蜂的影響是轉基因作物環(huán)境安全性評價的一個重要部分，那么，建立一套系統(tǒng)評價轉Bt基因抗蟲水稻對稻虱纓小蜂是否安全的方法尤為重要。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)狀，旨在提供一種安全有效、操作簡便、成本低廉的轉基因抗蟲水稻對寄生性天敵稻虱纓小蜂安全性評價方法。
[0006]本發(fā)明目的的實現(xiàn)方式為，轉基因抗蟲水稻對寄生性天敵稻虱纓小蜂安全性評價方法，包括如下3個部分:
[0007](I)Tier-1毒性測定試驗:評價轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對非靶標生物稻虱纓小蜂的潛在毒性；[0008]①對試驗批次轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白進行生物活性測定
[0009]以印度谷螟作為試驗昆蟲，將轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白加入印度谷螟人工飼料中配制不同濃度梯度的飼料，飼料配好后，ELISA法檢測不同濃度梯度該Bt蛋白的真實含量，并以純飼料作為對照，在每份飼料中接入40頭印度谷螟初孵幼蟲，重復5次，7天后記錄幼蟲存活情況，計算LC5tl,以此判斷轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的活性；
[0010]②高劑量轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對稻虱纓小蜂存活率與生殖力的影響，評價稻虱纓小蜂對該Bt蛋白的敏感性；
[0011]用10%蜂蜜水作為稻虱纓小蜂食物，配制三種蜂蜜水用于試驗，即:純10%蜂蜜水(w/v)作為陰性對照、含有10倍含量以上于轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的10%蜂蜜水、含有10 μ g/ml PA的10%蜂蜜水作為陽性對照；
[0012]對稻虱纓小蜂存活率的影響:取4小時內羽化且已交配的稻虱纓小蜂雌蜂30頭，每10頭接入一個玻璃管中，用尼龍網(wǎng)封口，分別用以上三種蜂蜜水飼養(yǎng)，早晚各更換一次食物，每天分別于早、中、晚記錄其死亡情況，考察高劑量轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對稻虱纓小蜂存活率的影響；
[0013]對稻虱纓小蜂生殖力的影響:用以上三種蜂蜜水分別飼養(yǎng)20頭初羽化且已交配的稻虱纓小蜂雌蜂24小時，然后單頭接入玻璃管中，玻璃管中含有褐飛虱產(chǎn)卵2~3天、15日齡稻苗；接蟲后用尼龍網(wǎng)封口，6小時后移出寄生蜂，每天記錄下一代稻虱纓小蜂羽化數(shù)量及性別，考察高劑量轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對稻虱纓小蜂生殖力的影響；
[0014]③蜂蜜水中的轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白穩(wěn)定性以及生物活性；
[0015]對飼喂前后含有轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的蜂蜜水分別進行取樣，重復3次，ELISA檢測該Bt蛋白含量，同時，將飼喂前后含有轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的蜂蜜水稀釋至80± 10%致死率的濃度，涂在印度谷螟人工飼料表面，通風廚風干2小時后，接入30頭印度谷螟初孵幼蟲，重復3次，7天后記錄其死亡情況；
[0016](2)連續(xù)世代三級營養(yǎng)試驗:通過水稻一褐飛風一稻虱纓小蜂的食物鏈評價轉Bt基因抗蟲水稻通過寄主介導對稻虱纓小蜂的安全性影響；
[0017]①轉Bt基因抗蟲水稻對稻虱纓小蜂發(fā)育歷期和壽命的影響
[0018]將新羽化稻虱纓小蜂單對接入玻璃管中，并用尼龍網(wǎng)封口。玻璃管中分別裝有15日齡已被褐飛虱產(chǎn)卵2~3天的不同水稻材料的稻苗。待稻虱纓小蜂寄生2小時后，移出寄生蜂，觀察下一代稻虱纓小蜂的羽化情況，每2小時記錄一次下一代稻虱纓小蜂羽化的時間、數(shù)量及性別，相應的水稻材料不同世代間重復以上寄生過程。每個水稻材料設40次重復；
[0019]將羽化的稻虱纓小蜂成蟲分雌雄于玻璃管中飼養(yǎng)，每管4頭，用脫脂棉飼喂10%蜂蜜水(W/V)，早晚各更換一次食物，每天分別于早、中、晚記錄其死亡情況；
[0020]②轉Bt基因抗蟲水稻對稻虱纓小蜂生殖力、雌性率及存活率的影響
[0021]將新羽化稻虱纓小蜂單對接入玻璃管中，處理方法同(2)①，將脫脂棉中加入10%蜂蜜水(《/V)，并將脫脂棉貼在玻璃管壁上飼喂稻虱纓小蜂，早晚飼喂一次；每天觀察下一代稻虱纓小蜂羽化數(shù)量及性別，直到羽化完全；7天后，于體視鏡下解剖稻莖，記錄已寄生但未羽化的稻虱纓小蜂卵粒數(shù)，被寄生的卵變?yōu)榧t色；
[0022]選擇稻虱纓小蜂連續(xù)多代的發(fā)育歷期、壽命、生殖力、雌性率以及存活率作為評價參數(shù)指標，并進行統(tǒng)計分析，評價由褐飛虱卵介導的轉Bt基因抗蟲水稻對稻虱纓小蜂的安全性影響；
[0023](3)蛋白傳遞規(guī)律:通過ELISA檢測手段鑒定稻虱纓小蜂暴露于轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的途徑和程度；
[0024]對于不同的水稻材料，分別對15日齡水稻葉鞘，產(chǎn)于水稻葉鞘的褐飛虱卵粒以及以褐飛虱卵作為寄主的稻虱纓小蜂進行取樣，葉鞘30±lmg，褐飛虱卵200粒以及所有世代收集的稻虱纓小蜂成蟲，每個處理重復3~5次；
[0025]采用ELISA技術，分別對以上樣品中轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的含量進行檢測，確定稻虱纓小蜂是否通過褐飛虱卵途徑暴露于轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白以及其暴露的程度。
[0026]本發(fā)明通過Tier-1毒性測定試驗評價轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對非靶標生物稻虱纓小蜂的潛在毒性；通過水稻一褐飛虱一稻虱纓小蜂的食物鏈評價轉Bt基因抗蟲水稻通過寄主介導對稻虱纓小蜂的影響；采用ELISA檢測手段鑒定稻虱纓小蜂暴露于轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的途徑和程度。最終，根據(jù)3個方面的研究數(shù)據(jù)綜合分析轉Bt基因抗蟲水稻的種植對該非靶標生物產(chǎn)生的生態(tài)后果。
[0027]本發(fā)明于實驗室內建立了一套系統(tǒng)、科學的評價方法，對完善轉Bt基因抗蟲水稻對非靶標生物的影響研究具有重要意義，對確定轉Bt基因抗蟲水稻種植的生態(tài)安全性具 有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為取食純蜂蜜水以及加入Cry2Aa蛋白與PA蜂蜜水的稻虱纓小蜂生存曲線圖。
【具體實施方式】
[0029]本發(fā)明的轉Bt基因抗蟲水稻選擇轉cry2Aa基因水稻T2A-1，表達Cry2Aa蛋白系Bt蛋白的一種，其對鱗翅目害蟲有很高的抗性，非轉基因親本選擇對照明恢63水稻，轉cry2Aa基因水稻T2A-1種子均由華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室提供。明恢63水稻、轉cry2Aa基因水稻T2A-1于長X寬X高=25cmX 20cmX 3cm的栽培盤中以Yoshida營養(yǎng)液培育至大約15cm高后，用于評價試驗。稻苗培育條件為溫度(26±2°C)，相對濕度
(80%)ο
[0030]由于轉Bt基因水稻表達的Cry2Aa蛋白含量有限，鑒于要使稻虱纓小蜂暴露于較高劑量的Cry2Aa蛋白，本 申請人:購買了北京樂士寧科技有限公司生產(chǎn)的Cry2Aa蛋白，所購買的Cry2Aa蛋白與轉Bt基因水稻T2A-1表達的Cry2Aa蛋白系同一種Bt蛋白，故本 申請人:以此代替轉Bt基因水稻表達的Cry2Aa蛋白作為試驗品。
[0031]本發(fā)明的供試褐飛虱采自湖北武漢稻田，并在室內分別于轉cry2Aa基因水稻T2A-1與明恢63的稻苗建立種群，飼養(yǎng)10代以上。稻虱纓小蜂由浙江大學昆蟲科學研究所提供，在室內用帶有褐飛虱卵的TNl稻苗飼養(yǎng)10代以上用于試驗。飼養(yǎng)條件為溫度(28± I°C )，相對濕度(70±5%)，光暗比(L14h:DIOh)。印度谷螟敏感品系用于Cry2Aa蛋白活性測定。[0032]本發(fā)明的評價方法由Tier-1毒性測定試驗，連續(xù)世代三級營養(yǎng)試驗以及蛋白傳遞規(guī)律3個關鍵部分組成。下面分別進行詳細說明。
[0033](I)Tier-1毒性測定試驗:評價轉cry2Aa基因抗蟲水稻T2A-1表達的Cry2Aa蛋白對非靶標生物稻虱纓小蜂的潛在毒性。
[0034]①對試驗批次Cry2Aa蛋白進行生物活性測定
[0035]以印度谷螟作為試驗昆蟲，將購買的Cry2Aa蛋白加入印度谷螟人工飼料中配制5個濃度梯度，分別為2，10，20，30，40 μ g/g的飼料，并以純飼料作為對照，飼料配好后，ELISA法檢測不同濃度梯度Cry2Aa蛋白的真實含量，在每份飼料中接入40頭印度谷螟初孵幼蟲，重復5次，7天后記錄幼蟲存活情況，計算LC5tl,以此判斷Cry2Aa蛋白的活性。
[0036]通過ELISA檢測印度谷螟人工飼料中Cry2Aa蛋白含量，5個濃度梯度的真實含量分別為0.29,8.96、14.29,24.74,32.10 μ g/g, Cry2Aa蛋白對印度谷螟初孵幼蟲的LC5tl為14.89 μ g/g。說明購買的Cry2Aa蛋白具有較好的殺蟲活性。
[0037]②高劑量Cry2Aa蛋白對稻虱纓小蜂存活率與生殖力的影響，評價稻虱纓小蜂對Cry2Aa蛋白的敏感性。
[0038]用10%蜂蜜水作為稻虱纓小蜂食物，配制三種蜂蜜水用于試驗，即:純10%蜂蜜水(w/v)作為陰性對照、含有300 μ g/ml Cry2Aa的10%蜂蜜水、含有10 μ g/mlPA (砷酸二氫鉀)的10%蜂蜜水作為陽性對照。
[0039]對稻虱纓小蜂存活率的影響:取4小時內羽化且已交配的稻虱纓小蜂雌蜂30頭，每10頭接入一個直徑X高=3cmX25cm玻璃管中，用100目尼龍網(wǎng)封口，分別用以上三種蜂蜜水飼養(yǎng)，早晚各更換一次食物，每天分別于8:00，14:00，20:00記錄其死亡情況，考察高劑量Cry2Aa蛋白對稻虱纓小蜂存活率的影響；
[0040]Kaplan-Meier生存分析結果表明:取食含有300 μ g/ml Cry2Aa蛋白蜂蜜水的稻虱纓小蜂與對照之間的存活率，無顯著性差異(p=0.287);而與對照相比，取食含有IOyg/ml PA蜂蜜水的稻虱纓小蜂存活率則顯著下降(P〈0.001)(見圖1)。
[0041]對稻虱纓小蜂生殖力的影響:用以上三種蜂蜜水飼養(yǎng)20頭初羽化且已交配的稻虱纓小蜂雌蜂24小時，然后單頭接入直徑X高=3cmX 25cm玻璃管中，玻璃管中含有褐飛虱產(chǎn)卵2~3天、15日齡稻苗；接蟲后用100目尼龍網(wǎng)封口，6小時后移出寄生蜂，每天記錄下一代稻虱纓小蜂羽化數(shù)量及性別，考察高劑量Cry2Aa蛋白對稻虱纓小蜂生殖力的影響；。
[0042]觀察結果:取食純10%蜂蜜水、含300 μ g/ml Cry2Aa蛋白的蜂蜜水以及含10 μ g/ml PA的蜂蜜水的稻虱纓小蜂產(chǎn)卵量分別為14.5±1.84粒，16.1±1.68粒，3.7±0.63粒，Dunnett test分析結果表明:與對照相比,取食含有300 μ g/ml Cry2Aa蛋白蜂蜜水的稻風纓小蜂產(chǎn)卵量無顯著性差異(P=0.650)，而取食含有10 μ g/ml PA蜂蜜水的稻虱纓小蜂產(chǎn)卵量則顯著下降(P〈0.001)。
[0043]③蜂蜜水中的Cry2Aa蛋白穩(wěn)定性以及生物活性；
[0044] 為了確保稻虱纓小蜂在12小時內取食的蜂蜜水中Cry2Aa蛋白的穩(wěn)定性及生物活性，對飼喂前后含有Cry2Aa蛋白的蜂蜜水分別進行取樣，重復3次，ELISA檢測其Cry2Aa蛋白含量，同時，將飼喂前后含有Cry2Aa蛋白的蜂蜜水稀釋10倍，涂在印度谷螟人工飼料表面，通風廚風干2小時后，接入30頭印度谷螟初孵幼蟲，重復3次，7天后記錄其死亡情況。[0045]未被稻虱纓小蜂取食的蜂蜜水中Cry2Aa蛋白的提取效率約為94.5%，其含量為283.5±7.4μg/ml ;纓小蜂取食12小時后，蜂蜜水中Cry2Aa蛋白含量下降了 24.9%，為212.9±26.6μ g/ml。雖然取食前后，蜂蜜水中Cry2Aa蛋白含量有所下降，但其含量遠超出轉cry2Aa基因水稻T2A-1表達的Cry2Aa蛋白含量的10倍以上。
[0046]印度谷螟生測結果表明:稻虱纓小蜂取食前與取食后含有Cry2Aa蛋白的蜂蜜水，涂在印度谷螟人工飼料表面后，對印度谷螟初孵幼蟲的致死率分別為87.8%與86.7%，遠遠高于純10%蜂蜜水(致死率10.0%)。
[0047]綜上所述，稻虱纓小蜂暴露于高劑量且具有殺蟲活性的Cry2Aa蛋白，表明其對Cry2Aa蛋白不敏感。
[0048](2)連續(xù)世代三級營養(yǎng)試驗:通過水稻一褐飛虱一稻虱纓小蜂的食物鏈評價轉Cry2Aa基因抗蟲水稻T2A-1通過寄主介導對稻虱纓小蜂的安全性影響。
[0049]①轉cry2Aa基因抗蟲水稻T2A-1對稻虱纓小蜂發(fā)育歷期和壽命的影響
[0050]將TNl水稻飼養(yǎng)的新羽化稻虱纓小蜂單對接入直徑X高=3cmX25cm玻璃管中，并用100目尼龍網(wǎng)封口。玻璃管中分別裝有15日齡已被褐飛虱產(chǎn)卵2~3天的T2A-1或明恢63稻苗。待稻虱纓小蜂寄生2小時后，移出寄生蜂，觀察下一代稻虱纓小蜂的羽化情況，每2小時記錄一次下一代稻虱纓小蜂羽化的時間、數(shù)量及性別，相應的水稻材料不同世代間重復以上寄生過程。每個水稻材料設40次重復；
[0051]將羽化的稻虱纓小蜂成蟲分雌雄于玻璃管中飼養(yǎng)，每管4頭，用脫脂棉飼喂10%蜂蜜水(w/v)，早晚各更換一次食物，每天分別于8:00，14:00,20:00記錄其死亡情況。
[0052]以不同水稻材料飼養(yǎng)的褐飛虱卵為寄主的稻虱纓小蜂發(fā)育歷期如表1所示，
[0053]表1
[0054]
【權利要求】
1.轉基因抗蟲水稻對寄生性天敵稻虱纓小蜂安全性評價方法，其特征在于包括如下3個部分: (1)Tier-1毒性測定試驗:評價轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對非靶標生物稻虱纓小蜂的潛在毒性； ①對試驗批次轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白進行生物活性測定 以印度谷螟作為試驗昆蟲，將轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白加入印度谷螟人工飼料中配制不同濃度梯度的飼料，飼料配好后，ELISA法檢測不同濃度梯度該Bt蛋白的真實含量，并以純飼料作為對照，在每份飼料中接入40頭印度谷螟初孵幼蟲，重復5次，7天后記錄幼蟲存活情況，計算LC50,以此判斷轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的活性； ②高劑量轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對稻虱纓小蜂存活率與生殖力的影響，評價稻虱纓小蜂對該Bt蛋白的敏感性； 用10%蜂蜜水作為稻虱纓小蜂食物，配制三種蜂蜜水用于試驗，即:純10%蜂蜜水(w/V)作為陰性對照、含有10倍含量以上于轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的10%蜂蜜水、含有10 μ g/ml PA的10%蜂蜜水作為陽性對照； 對稻虱纓小蜂存活率的影響:取4小時內羽化且已交配的稻虱纓小蜂雌蜂30頭，每10頭接入一個玻璃管中，用尼龍網(wǎng)封口，分別用以上三種蜂蜜水飼養(yǎng)，早晚各更換一次食物，每天分別于早、中、晚記錄其死亡情況，考察高劑量轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對稻虱纓小蜂存活率的影響； 對稻虱纓小蜂生殖力的影響:用以上三種蜂蜜水分別飼養(yǎng)20頭初羽化且已交配的稻虱纓小蜂雌蜂24小時，然后單頭接入玻璃管中，玻璃管中含有褐飛虱產(chǎn)卵2~3天、15日齡稻苗；接蟲后用尼龍網(wǎng)封口，6小時后移出寄生蜂，每天記錄下一代稻虱纓小蜂羽化數(shù)量及性別，考察高劑量轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對稻虱纓小蜂生殖力的影響； ③蜂蜜水中的轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白穩(wěn)定性以及生物活性； 對飼喂前后含有轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的蜂蜜水分別進行取樣，重復3次，ELISA檢測該Bt蛋白含量，同時，將飼喂前后含有轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的蜂蜜水稀釋至80± 10%致死率的濃度，涂在印度谷螟人工飼料表面，通風廚風干2小時后，接入30頭印度谷螟初孵幼蟲，重復3次，7天后記錄其死亡情況； (2)連續(xù)世代三級營養(yǎng)試驗:通過水稻一褐飛風一稻虱纓小蜂的食物鏈評價轉Bt基因抗蟲水稻通過寄主介導對稻虱纓小蜂的安全性影響； ①轉Bt基因抗蟲水稻對稻虱纓小蜂發(fā)育歷期和壽命的影響 將新羽化稻虱纓小蜂單對接入玻璃管中，并用尼龍網(wǎng)封口。玻璃管中分別裝有15日齡已被褐飛虱產(chǎn)卵2~3天的不同水稻材料的稻苗。待稻虱纓小蜂寄生2小時后，移出寄生蜂，觀察下一代稻虱纓小蜂的羽化情況，每2小時記錄一次下一代稻虱纓小蜂羽化的時間、數(shù)量及性別，相應的水稻材料不同世代間重復以上寄生過程。每個水稻材料設40次重復； 將羽化的稻虱纓小蜂成蟲分雌雄于玻璃管中飼養(yǎng)，每管4頭，用脫脂棉飼喂10%蜂蜜水(w/v)，早晚各更換一次食物，每天分別于早、中、晚記錄其死亡情況； ②轉Bt基因抗蟲水稻對稻虱纓小蜂生殖力、雌性率及存活率的影響 將新羽化稻虱纓小蜂單對接入玻璃管中，處理方法同(2)①，將脫脂棉中加入10%蜂蜜水(《/V)，并將脫脂棉貼在玻璃管壁上飼喂稻虱纓小蜂，早晚飼喂一次；每天觀察下一代稻虱纓小蜂羽化數(shù)量及性別，直到羽化完全；7天后，于體視鏡下解剖稻莖，記錄已寄生但未羽化的稻虱纓小蜂卵粒數(shù)，被寄生的卵變?yōu)榧t色； 選擇稻虱纓小蜂連續(xù)多代的發(fā)育歷期、壽命、生殖力、雌性率以及存活率作為評價參數(shù)指標，并進行統(tǒng)計分析，評價由褐飛虱卵介導的轉Bt基因抗蟲水稻對稻虱纓小蜂的安全性影響； (3)蛋白傳遞規(guī)律:通過ELISA檢測手段鑒定稻虱纓小蜂暴露于轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的途徑和程度； 對于不同的水稻材料，分別對15日齡水稻葉鞘，產(chǎn)于水稻葉鞘的褐飛虱卵粒以及以褐飛虱卵作為寄主的稻虱纓小蜂進行取樣，葉鞘30±lmg，褐飛虱卵200粒以及所有世代收集的稻虱纓小蜂成蟲，每個處理重復3~5次； 采用ELISA技術，分別對以上樣品中轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白的含量進行檢測，確定稻虱纓小蜂是否通過褐飛虱卵途徑暴露于轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白以及其暴露的程度。
2.根據(jù)權利要求1所述的轉基因抗蟲水稻對寄生性天敵稻虱纓小蜂安全性評價方法，其特征在于轉Bt基因抗蟲水稻選擇轉cry2Aa基因水稻T2A-1。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的轉基因抗蟲水稻對寄生性天敵稻虱纓小蜂安全性評價方法，其特征在于轉cry2Aa基因水稻T2A-1于長X寬X高=25cmX 20cmX 3cm的栽培盤中以Yo shida營養(yǎng)液培育至15cm高。
4.根據(jù)權利要求1所述的轉基因抗蟲水稻對寄生性天敵稻虱纓小蜂安全性評價方法，其特征在于步驟(1)②、(2)①中所用玻璃管為直徑X高=3cmX25cm玻璃管，尼龍網(wǎng)為100目尼龍網(wǎng)。
【文檔編號】A01K67/033GK103931564SQ201410150606
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權日:2014年4月15日
【發(fā)明者】華紅霞, 韓宇, 何月平, 趙景, 蔡萬倫 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學