一株大豆慢生根瘤菌SCAUs36及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株大豆慢生根瘤菌SCAUs36及其應(yīng)用。該菌株是從新鮮的大豆根瘤中分離純化得到的。該菌株已于2014年3月14日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC?NO:M2014082，分類命名為大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobiumjaponicum）。該菌株應(yīng)用于四川大豆的生產(chǎn)。本發(fā)明所述的大豆慢生根瘤菌SCAUs36是一株共生固氮能力強(qiáng)，對(duì)四川大豆品種適應(yīng)范圍廣，兼具有分泌IAA能力、具有溶無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷能力、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良廣譜大豆根瘤菌菌株。并且與四川的主栽豆品種匹配親和性好，在不同生態(tài)區(qū)不施氮肥、接種SCAUs36使大豆增產(chǎn)31%以上，與不接種對(duì)照的差異達(dá)極顯著水平。
【專利說(shuō)明】—株大豆慢生根瘤菌SCAUs36及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤其涉及的是一株大豆慢生根瘤菌SCAUs36及其應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]化學(xué)氮肥為提高農(nóng)作物產(chǎn)量作出了巨大貢獻(xiàn)，但生產(chǎn)成本高、利用率低、污染生態(tài)環(huán)境。生物固氮?jiǎng)t成本低、固氮量大、固氮過(guò)程持續(xù)、無(wú)污染，有利于生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)本增效的有效手段。在糧食生產(chǎn)中需要下大力氣開(kāi)發(fā)對(duì)環(huán)境有益的生物固氮技術(shù)。根瘤菌-豆科植物固氮體系是生物固氮中效率最高的。豆科植物人工接種根瘤菌是提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)，改善生態(tài)環(huán)境的一項(xiàng)重要農(nóng)業(yè)措施。接種根瘤菌是國(guó)際上公認(rèn)的生物固氮技術(shù)。大豆與大豆根瘤菌的共生體系是生物固氮中的典型代表。大豆與大豆根瘤菌之間的共生作用，是在長(zhǎng)期進(jìn)化中相互作用、互相選擇的結(jié)果，也是與環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果。世界其他種植大豆的國(guó)家在應(yīng)用大豆根瘤菌的技術(shù)上有很大的優(yōu)勢(shì)。然而，我國(guó)是大豆的起源地，種植大豆的歷史悠久，根瘤菌與大豆協(xié)同進(jìn)化，使土壤中固氮效率低的土著根瘤菌與大豆品種具有較強(qiáng)的匹配親和性，從而大大降低了高效固氮根瘤菌接種劑的作用效果。因此研究和掌握根瘤菌和大豆品種匹配性具有重要的實(shí)踐價(jià)值。
[0003]要提高共生固氮作用，可見(jiàn)菌株和大豆品種應(yīng)是兩個(gè)根本因素。而根瘤菌的群體分布具有地理局限性，在根瘤菌的篩選中，需要注意其對(duì)應(yīng)用地區(qū)環(huán)境的適應(yīng)能力。一般來(lái)說(shuō)，在某個(gè)區(qū)域內(nèi)最為有效的根瘤菌往往來(lái)自本地區(qū)或者與本地區(qū)條件相似地區(qū)的菌株。因此在根瘤菌選種時(shí)，不僅要開(kāi)展根瘤菌與大豆品種的匹配性組合研究，還必須重視菌劑應(yīng)用的地域性。
[0004]大豆是中國(guó)第四大農(nóng)作物，深受中國(guó)人民的喜愛(ài)，食用方式多種多樣，用途廣泛，是我國(guó)重要的糧食作物和油料作物。因此在我國(guó)開(kāi)展優(yōu)良大豆根瘤菌株篩選和應(yīng)用技術(shù)研究工作非常有意義。東北大豆產(chǎn)區(qū)為我國(guó)最大大豆產(chǎn)區(qū)，黃淮海地區(qū)是我國(guó)大豆第二大產(chǎn)區(qū)，與這最大的兩大產(chǎn)區(qū)的主栽大豆品種和生態(tài)環(huán)境匹配的優(yōu)良菌株的研究相對(duì)較多。針對(duì)干旱的西北大豆產(chǎn)區(qū)，優(yōu)良大豆根瘤菌的篩選也有報(bào)道。針對(duì)我國(guó)大豆的第一產(chǎn)區(qū):東北產(chǎn)區(qū)，杜迎輝等人從黑龍江分離獲得一株與東北大豆品種匹配性好且適合東北地區(qū)的優(yōu)良菌株，于2012年6月獲準(zhǔn)發(fā)明專利。針對(duì)我國(guó)華南酸性土壤，曹桂芹等人為華南缺磷酸性紅壤選育了耐酸、耐鋁的3個(gè)根瘤菌株系，于2007年12月申請(qǐng)了 3個(gè)發(fā)明專利。但針對(duì)南方大豆產(chǎn)區(qū)的四川大豆產(chǎn)區(qū)的大豆品種和生態(tài)環(huán)境相匹配的優(yōu)良根瘤菌研究鮮見(jiàn)報(bào)道。
[0005]四川大豆以前一直屬小宗作物，種植零散，產(chǎn)量較低，種植面積較小。近年來(lái)，四川大豆生產(chǎn)發(fā)展迅猛，出現(xiàn)規(guī)?；?、大面積連片種植，產(chǎn)量水平大幅度提高，已經(jīng)成為四川省主要糧食作物之一，播種面積在全國(guó)排名第6位。農(nóng)業(yè)部在《種植業(yè)發(fā)展第十二五規(guī)劃》(2011— 2015 )中將四川及西南間套食用大豆列入全國(guó)三大優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)之一，國(guó)家發(fā)改委又將川渝大豆納入國(guó)家十二五主要糧食作物，四川大豆引起了國(guó)家及四川省各級(jí)政府的重視。四川大豆栽培方式主要是與玉米間、套作種植，占全省大豆種植面積的90%以上。因此，在四川大豆生產(chǎn)中接種匹配的優(yōu)良根瘤菌，四川大豆的間套作體系對(duì)根瘤菌固氮酶活性的“氨阻遏”還能起緩解作用。四川套作大豆主導(dǎo)品種是“南豆12”和“貢選I號(hào)”。又四川間套作的大豆主要種植在四川丘陵區(qū)，光熱資源豐富的攀西地區(qū)主要以春大豆或鮮食大豆為主。目前還沒(méi)有篩選出與四川主栽大豆品種匹配，適合四川不同生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良大豆根瘤菌。為此，針對(duì)四川的主栽品種和種植大豆的主要生態(tài)環(huán)境進(jìn)行大豆優(yōu)良菌株的篩選，充分發(fā)揮生物固氮作用，提高生物固氮在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用效果，從而減少化肥的施用，這對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，節(jié)約能源資源，推動(dòng)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要實(shí)踐價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一株大豆慢生根瘤菌SCAUs36及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]一株大豆慢生根瘤菌SCAUs36,其分類命名為大豆慢生根瘤菌SCAUs36BradyrhizobiumjaponicumSCAUs36，已于2014年3月14日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2014082。
[0009]所述的大豆慢生根瘤菌SCAUs36應(yīng)用于四川大豆的生產(chǎn)。
[0010]本發(fā)明所述的大豆慢生根瘤菌SCAUs36是一株共生固氮能力強(qiáng)，對(duì)四川大豆品種適應(yīng)范圍廣，兼具有分泌IAA能力、具有溶無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷能力、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良廣譜大豆根瘤菌菌株。并且與四川的主栽大豆品種匹配親和性好，在不同生態(tài)區(qū)不施氮肥、接種SCAUs36使大豆增產(chǎn)31%以上，與不接種對(duì)照的差異達(dá)極顯著水平。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為大豆慢生根瘤菌SCAUs36在YMA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。
[0012]圖2為大豆慢生根瘤菌SCAUs36的16rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育圖。
[0013]圖3為大豆慢生根瘤菌SCAUs36的glnI1、atpD、recA三個(gè)持家基因聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0015]實(shí)施例1大豆慢生根瘤菌SCAUs36的分離、純化和保存
[0016]從四川省瀘州市瀘縣丘陵區(qū)紫色土上種植的大豆中，選擇健壯植株主根上大且飽滿紅色的根瘤，將根瘤擦洗干凈，帶部分根皮采下，用紙吸干并將其放在裝有無(wú)水氯化鈣并覆有脫脂棉的小管中。在實(shí)驗(yàn)室將采集的根瘤用無(wú)菌水浸泡吸脹后，用95%的乙醇浸泡30s以消除表面張力，接著用0.1% (m/v)的升萊表面消毒5min,再用無(wú)菌水沖洗6次,在無(wú)菌操作的情況下，將單個(gè)根瘤夾破后在加有剛果紅的YAM培養(yǎng)基(甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH2PO40.25g,MgSO4.7Η200.2g, CaCl2.6Η200.lg，NaC10.lg, 1% (m/v)鑰酸鈉 2ml, 1% (m/v)硼酸 2ml, 1% (m/v)剛果紅 2.5ml, pH6.8-7.0，瓊脂 18 ~20g，水 1000ml)上劃線，在 28°C 的恒溫箱中培養(yǎng)。
[0017]待長(zhǎng)出菌落后，從平板上挑選不吸紅、形態(tài)上像根瘤菌的菌落在平板上稀釋劃線培養(yǎng)。3d左右觀察菌落形態(tài)，一直觀察到15d左右，因慢生根瘤菌需6~15d出現(xiàn)菌落。重復(fù)稀釋劃線反復(fù)分離，直到純化為止。根據(jù)以下兩方面進(jìn)行初步判定是否為根瘤菌:(I)加剛果紅的YMA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài):不吸紅，菌落圓形、乳白色、隆起、邊緣整齊不蔓延、表面光滑、較粘稠、較濕潤(rùn)。培養(yǎng)3~5d就長(zhǎng)出菌落的為快生根瘤菌,培養(yǎng)6~IOd長(zhǎng)出菌落的為慢生根瘤菌。(2)細(xì)胞形態(tài):對(duì)確認(rèn)的根瘤菌菌落作標(biāo)記，制片進(jìn)行革蘭氏染色，根瘤菌的鏡檢結(jié)果為細(xì)胞呈小桿狀且形態(tài)一致，無(wú)芽孢，細(xì)胞內(nèi)常含羥基丁酸而呈環(huán)節(jié)狀，革蘭氏陰性(G-)。如果上述標(biāo)記菌落具有上述兩方面特征，則將該菌落接入YMA培養(yǎng)基的試管斜面培養(yǎng)保存。
[0018]本實(shí)施例的分離純化得到的菌株SCAUs36為慢生根瘤菌，在加剛果紅的YMA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌體不吸紅，菌落較小、圓形、乳白色、粘稠、隆起度較高、稍透明，6~7d長(zhǎng)出菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為G-,呈小桿狀。
[0019]實(shí)施例2根瘤菌的回接及匹配性試驗(yàn)
[0020]根瘤菌的回接試驗(yàn)用水培法，試驗(yàn)中用的大豆品種是四川種植面積最大的品種“南豆12”，在光照室(控溫22~24°C，光照強(qiáng)度2700~3000勒克斯，日照時(shí)間14h)進(jìn)行，種植46d收獲。與“南豆12”回接成功后再與其他的主栽大豆品種進(jìn)行匹配性試驗(yàn)，也用水培法進(jìn)行，試驗(yàn)中用的大豆品種:間套作的另一主栽大豆品種“貢選I號(hào)”、春大豆主栽品種“南豆8號(hào)”和“川豆14”。在上述光照室培養(yǎng)I周后，放置在正常光照及溫度條件下培養(yǎng)，種植41d收獲。定期補(bǔ)充無(wú)菌微氮營(yíng)養(yǎng)液,微氮營(yíng)養(yǎng)液配方:0.46〖硫酸韓,0.075g氯化鉀，0.06g硫酸鎂，0.03g硝酸鈣，0.075g檸檬酸鐵，0.136g磷酸氫二鉀，1000ml蒸餾水，Iml微量元素(2.86g硼酸，0.02g鑰酸，0.8g硫酸銅，0.22gZnS04硫酸鋅，1.81g硫酸錳，加蒸餾水至1000ml)。將大豆慢生根瘤菌SCAUs36與上述大豆品種形成不同組合，水培器采用250ml的細(xì)頸瓶(醫(yī)院用的玻璃輸液瓶)，以不接種大豆慢生根瘤菌SCAUs36的同品種植株為對(duì)照。收獲后用大豆植株的根瘤數(shù)及植株干重來(lái)評(píng)價(jià)大豆慢生根瘤菌SCAUs36的接種效果?；亟釉囼?yàn)與匹配性試驗(yàn)的菌液培養(yǎng)、種子的催芽、水培器的制作及種植方法是一致的。
[0021 ] (I)菌液培養(yǎng):將大豆慢生根瘤菌SCAUs36接種于YMA液體培養(yǎng)基中，放置搖床上用120rpm/min轉(zhuǎn)速，28 °C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(約6d左右)。
[0022](2)種子的催芽:選擇粒大、飽滿的無(wú)損傷的大豆種子，用95%酒精浸5min，倒去酒精,加入0.1% (m/v)的升萊溶液表面消毒5min。最后用無(wú)菌水清洗4~6次,每次5min。28°C催芽，待主根長(zhǎng)到2~3cm左右，須根未長(zhǎng)出時(shí)播種。
[0023](3)水培器的制作:用250ml的細(xì)頸瓶(醫(yī)院用的玻璃輸液瓶)作水培器。先制作無(wú)菌微氮營(yíng)養(yǎng)液，將 配制好的無(wú)菌微氮營(yíng)養(yǎng)液注入清洗后的瓶?jī)?nèi)，瓶口覆蓋一層牛皮紙，在瓶口正中央開(kāi)一小孔(直徑約0.6cm)，小孔塞上棉花，外罩一層耐高溫的塑料薄膜，在121°C溫度下滅菌備用。
[0024](4)種植及測(cè)定指標(biāo):將催芽種子置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中用菌液浸泡15min，用無(wú)菌鑷子將種苗的根插入水培器小孔內(nèi)，每瓶I株，然后每棵種苗再加入菌液1ml，種子周圍用原來(lái)孔內(nèi)的棉花塞好，防止塵埃落入瓶?jī)?nèi)，造成污染。另設(shè)不接種處理的同品種植株為對(duì)照(CK)0種植時(shí)先種CK。各處理重復(fù)3次。水培試驗(yàn)結(jié)果列于表1。
[0025]表1結(jié)果表明，所述大豆慢生根瘤菌SCAUs36與4個(gè)供試大豆品種的匹配親和性均好，均表現(xiàn)出較好的結(jié)瘤能力和共生固氮能力；與不接種大豆慢生根瘤菌SCAUs36的對(duì)照相比，SCAUs36能顯著提高每個(gè)品種大豆的植株干重，比不接種根瘤菌的對(duì)照提高28.9%~41.4%?？梢?jiàn)，所述大豆慢生根瘤菌SCAUs36是與四川大豆品種匹配性好的優(yōu)良廣譜菌株。
[0026]表1大豆慢生根瘤菌SCAUs36的水培試驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一株大豆慢生根瘤菌SCAUs36，其特征是，其保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2014082。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆慢生根瘤菌SCAUs36的應(yīng)用，其特征是，應(yīng)用于四川大豆的生產(chǎn)。
【文檔編號(hào)】A01P21/00GK103952343SQ201410151811
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】徐開(kāi)未, 陳遠(yuǎn)學(xué), 陳強(qiáng), 張小平, 陳翠平, 蔣攀 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)