一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）HS5B5，該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCC?No.6088。本發(fā)明枯草芽孢桿菌HS5B5對(duì)牡丹褐斑病的病原菌牡丹枝孢霉具有很強(qiáng)的抑制作用，能夠有效的預(yù)防和治療牡丹褐斑病。本發(fā)明枯草芽孢桿菌HS5B5對(duì)生態(tài)環(huán)境無(wú)害，不會(huì)引起病原的抗藥性。本發(fā)明枯草芽孢桿菌HS5B5的培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 牡丹蟲害較少，但病害發(fā)生種類多且危害嚴(yán)重。病害是牡丹在其生長(zhǎng)發(fā)育和越 冬過(guò)程中，受到病原微生物的浸染或不良環(huán)境條件的影響，使其從生理機(jī)制到形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā) 生一系列病變。已鑒定出來(lái)的20余種牡丹病害中，大多數(shù)是真菌性病害，如褐斑病、灰霉 病、銹病、白絹病和紫紋羽病等。它們引起葉局部壞死或整葉枯死，危害牡丹的葉、枝條和 根莖部，使牡丹提前落葉，影響生機(jī)。牡丹褐斑病是最為嚴(yán)重的病害之一，此病主要危害 葉片，也可侵染莖和花，多在開(kāi)花前后發(fā)生，一直延續(xù)到枯葉期。病原真菌為牡丹枝孢霉 (QWiosporiw? paeofliae)，屬半知菌亞門，絲孢菌綱，叢梗孢目，枝孢菌屬。病原以菌絲體 或分生孢子在枯葉或土壤里越冬，借助風(fēng)雨傳播夏初開(kāi)始發(fā)生，秋季、危害嚴(yán)重，高溫高濕、 光照不足、通風(fēng)不良、連作等均有利于病害發(fā)生。
[0003] 牡丹褐斑病的防治目前主要依賴化學(xué)藥物的使用，這不僅對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境 安全有害，而且易引起病原抗藥性。生物防治是利用生物或其產(chǎn)物控制農(nóng)林病蟲發(fā)生危害 的防治方法，由于其具有對(duì)人畜安全，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，不易產(chǎn)生抗藥性，高效廣譜，能夠促進(jìn) 作物生長(zhǎng)等特點(diǎn)，日益受到人們的重視，然而生物防治在牡丹病害防御上的研究和應(yīng)用還 很少。為了加快我國(guó)牡丹產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，研制對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境安全無(wú)害、不易引起 病原抗藥性、高效廣譜的生物防治劑迫在眉睫。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠抑制牡丹褐斑病病原菌牡丹枝孢霉的枯草芽孢桿 菌。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢 桿菌UaciBm 該菌株于2012年5月9日保藏在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCC No. 6088。
[0006] 所述枯草芽孢桿菌HS5B5菌株在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 上菌落呈白色，桿狀，表面干燥有皺褶，鞭毛中生，菌落直徑0. 8-2. 3 μ m，革蘭氏染色陽(yáng)性。
[0007] 所述枯草芽抱桿菌(ifeciBws HS5B5菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO :1所示。
[0008] 所述枯草芽孢桿菌) HS5B5菌株通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)法篩選獲得。 [0009] 所述枯草芽孢桿菌) HS5B5菌株對(duì)牡丹褐斑病病原菌牡丹枝 孢霉的拮抗抑菌作用。
[0010] 所述枯草芽孢桿菌HS5B5菌株制劑在防治牡丹褐斑病中的 應(yīng)用。
[0011] 所述枯草芽孢桿菌 sMiihdHSSBS菌株對(duì)菊花黃萎病、蘋果白粉病、 油茶葉枯病菌、月季黑斑病中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是： 1、本發(fā)明枯草芽孢桿菌HS5B5對(duì)牡丹褐斑病的病原菌牡丹枝孢 霉具有很強(qiáng)的抑制作用，能夠有效的預(yù)防和治療牡丹褐斑病。
[0013] 2、本發(fā)明枯草芽孢桿菌UaciBm sMiiBWHSSBS對(duì)生態(tài)環(huán)境無(wú)害，不會(huì)引起病 原的抗藥性。
[0014] 3、本發(fā)明枯草芽孢桿菌 sMiiBWHSSBS的培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易保存， 易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為枯草芽孢桿菌UaciBm sMii/is) HS5B5的抑菌圈； 圖2為枯草芽孢桿菌 sMiiBWHSSBS的菌落特征。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明篩選分離了枯草芽孢桿菌(ifeciBm 5·?6?27Υ5·)Η55Β5,該菌株保藏于中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCC No. 6088。該菌株對(duì)牡丹褐 斑病的病原菌牡丹枝孢霉具有很強(qiáng)的抑制作用，可用于制備防治牡丹褐斑病的生物制劑。
[0017] 一、菌株的篩選分離方法 1、樣品中芽孢桿菌的分離 (1)在洛陽(yáng)國(guó)際牡丹園牡丹栽培區(qū)，采集牡丹根部表層土壤，在不同地點(diǎn)采集100個(gè)樣 本，裝袋帶回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干。風(fēng)干后的各樣品經(jīng)研磨后，從每個(gè)樣品中稱取l〇g分別加入到裝 有90mL無(wú)菌水和5顆玻璃珠的三角瓶中，充分搖動(dòng)20?30min，使得樣品與無(wú)菌水混合均 勻，制得樣品懸液。
[0018] (2)將制得的樣品懸液置于溫度為80°C的水浴中加熱lOmin，以殺死不產(chǎn)芽孢的 細(xì)菌和其他微生物，然后在無(wú)菌條件下吸取lmL的樣品懸液加入到裝有9mL無(wú)菌水的試管 中，振蕩混勻，制得1〇_ 2樣品稀釋液。
[0019] 按上述方法依次制得10_3、10_4、10_5、10_ 6、10_7的稀釋液，分別吸取10_5、10_6、10_ 7濃 度梯度的各樣品稀釋液〇. lmL涂布相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨平板上，30°C倒置培養(yǎng)48h。根據(jù)菌 落特征挑取形態(tài)等性狀差異比較明顯的菌落，反復(fù)平板劃線純化，編號(hào)后保存?zhèn)溆谩?br> [0020] 2、牡丹褐斑病拮抗菌的篩選 拮抗芽孢桿菌的篩選采用牡丹褐斑病的病原菌牡丹枝孢霉（C/at/iosporiw? paeofliae) 為靶標(biāo)，方法采用對(duì)峙培養(yǎng)篩選法。
[0021] 用于篩選的牡丹枝孢霉paeofliae)購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏 管理中心，菌株保藏號(hào)為ACCC 36063。
[0022] 將牡丹枝孢霉接種于PDA平板中央，28°C培養(yǎng)8d后，接入初篩得到的芽孢桿菌菌 株，28°C恒溫培養(yǎng)3d后觀察抑菌情況，測(cè)量抑菌圈直徑，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)抑菌直徑 的大小選取抑菌效果較為明顯的菌株，轉(zhuǎn)移至牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?br> [0023] 3、細(xì)菌鑒定方法 (1)形態(tài)特征觀察 形態(tài)特征觀察包括對(duì)菌落形態(tài)的觀察和細(xì)菌個(gè)體形態(tài)的觀察兩方面，主要采用《常見(jiàn) 細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0024] ①菌落形態(tài)的觀察 將菌種于平板上劃線培養(yǎng)24h，對(duì)其菌落形態(tài)、菌落質(zhì)地、菌落的顏色、菌落邊緣、光學(xué) 特性及是否分泌可溶性色素等進(jìn)行觀察記錄。
[0025] ②個(gè)體形態(tài)的觀察 革蘭氏染色：采用菌齡為10?14h的菌種。涂片后先用結(jié)晶紫初染，再用碘液媒染，經(jīng) 95%乙醇脫色后再用番紅復(fù)染，水洗，吸干。鏡檢菌體為紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體為紅色 的是革蘭氏陰性菌。
[0026] 芽孢染色：涂片后，先用孔雀綠染15min,經(jīng)水沖洗，風(fēng)干后用番紅復(fù)染2min,水 洗，吸干。鏡檢為芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。
[0027] 菌體大小的測(cè)量：用顯微測(cè)微尺對(duì)革蘭氏染色涂片進(jìn)行菌體大小的測(cè)量，每個(gè)菌 株測(cè)量10個(gè)以上菌體的寬度和長(zhǎng)度，平均值即為菌體一般大小。
[0028] (2)生理生化鑒定 生理生化鑒定按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《芽抱桿菌屬》中的方法，對(duì)各菌株進(jìn) 行包括接觸酶反應(yīng)、好氧性試驗(yàn)、甲基紅反應(yīng)、V. P反應(yīng)試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、糖醇發(fā)酵試 驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)及耐 鹽性試驗(yàn)等生理生化特征的鑒定。
[0029] (3) 1防rDNA序列分析 用細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取，作為PCR反應(yīng)的模板。引物用16S rDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增通用引物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系30μ L :PCR預(yù)混料15μ L、模板DNA 1 μ L、引物 各 0.5yL、雙蒸水 nyLoPCR 反應(yīng)條件：95°C 3min;95°C 50s，52°C 50s，72°C 2min，30 個(gè) 循環(huán)；72°C延伸lOmin。用PCR膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)1. 5%的凝膠電泳檢測(cè)后，與 克隆載體pGM-Τ在T4連接酶作用下于16°C過(guò)夜連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì) 胞。引物及陽(yáng)性克隆菌測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。利用Blast將菌株的 16S rDNA的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的序列進(jìn)行比較，分析其同源性。
[0030] 二、篩選分離結(jié)果 1、樣品中芽孢桿菌的分離純化 從樣品中，經(jīng)稀釋分離、純化共獲得79株細(xì)菌，分別編號(hào)、保存，用于拮抗菌的篩選。用 顯微鏡初步鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)其中有68株為芽孢桿菌，占獲得細(xì)菌總數(shù)的86. 1%，這說(shuō)明試驗(yàn) 中采用的在稀釋分離前，將樣品懸液先在80°C水浴中加熱lOmin的處理方法，能夠有效殺 死樣品中的微生物細(xì)胞，從而最大限度的獲得芽孢桿菌，適于芽孢桿菌的分離。
[0031] 2、牡丹褐斑病病原菌拮抗菌的篩選 以牡丹褐斑病病原菌牡丹枝孢霉(CVat/iosporiw? paeofliae)作為祀標(biāo)，采用對(duì)峙培養(yǎng) 法，以抑菌效果即抑菌圈大小為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行拮抗芽孢桿菌的篩選。結(jié)果表明，從樣品中分離 得到的68株芽孢桿菌中，對(duì)牡丹褐斑病有抑制作用的有11株，約占總數(shù)的16. 2%，其中抑菌 圈直徑在6mm以上的有1株，抑菌圈直徑為6. 18mm，見(jiàn)圖1，命名為HS5B5,進(jìn)行微生物菌株 鑒定。
[0032] 3、個(gè)體及菌落形態(tài)觀察結(jié)果 可以看出，菌株HS5B5的菌體形態(tài)為桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，中生芽孢，周生鞭毛，同時(shí) 從菌落所顯示的不規(guī)則、干燥、不透明等特征可以初步推斷菌株HS5B5可能屬于芽孢桿菌 雇i (Bacillus')。
[0033] 表1菌株HS5B5的形態(tài)特征

【權(quán)利要求】
1. 一種枯草芽孢桿菌，其特征在于：所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌 sMii/is) HS5B5,該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào) 為：CGMCC No. 6088。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌在抑制牡丹褐斑病病原菌牡丹枝孢霉中的 應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌在制備用于防治牡丹褐斑病制劑中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌在抑制菊花黃萎病、蘋果白粉病、油茶葉枯 病菌、月季黑斑病中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK104195061SQ201410163640
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】宋鵬, 劉領(lǐng), 馬占強(qiáng), 趙杏利, 劉曉亮, 劉晨洲, 楊敏 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)