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      高品質蝦夷扇貝精液的采集方法

      文檔序號:251403閱讀:374來源:國知局
      高品質蝦夷扇貝精液的采集方法
      【專利摘要】一種高品質蝦夷扇貝精液的采集方法,屬于海洋生物【技術領域】,它包括:1)優(yōu)質雄貝的挑選、暫養(yǎng)和促熟;2)雄性蝦夷扇貝精液的多次誘導排放與采集;3)檢測收集精子的品質;本發(fā)明收集方法簡單,易于操作,不會對親貝造成傷害,可重復多次采集精液,所采集的精液可長期保存。只需了解扇貝的生殖腺及排泄器官的解剖結構,精確辨別出腎管和腎孔便可進行精液的采集。一般雄性蝦夷扇貝通過該方法一次可收集精液0.5~1.5ml/只。在控溫和保證充足營養(yǎng)的條件下,能促進性腺多次成熟排放,每個扇貝能重復采集2-4次直至三四月份。
      【專利說明】高品質蝦夷扇貝精液的采集方法
      【技術領域】
      [0001]本發(fā)明屬于海洋生物【技術領域】,系貝類遺傳育種研究中的技術改進,具體地涉及一種高品質蝦夷扇貝精液的采集方法。
      【背景技術】
      [0002]水產(chǎn)動物精液的采集一般是指良種培育和人工育苗時人工授精研究或在生殖隔離研究中以獲取精液為研究對象的技術方法。[0003]雄性蝦夷扇貝的生殖器官是位于腹面的一只半彎月形的性腺,排泄器官為一對腎臟,腎臟各由一海綿狀腺體及一具纖毛的薄壁短管狀體構成,前者的腎口開口于圍心腔;后者的腎孔(泄殖孔)開口于外套腔中,附于閉殼肌的前方,界于性腺及左右兩鰓之間,呈長囊形。代謝廢物和生殖產(chǎn)物都由腎孔排出。腎孔位于腎臟的末端腹面。性腺的前端內側與貝柱靠近部位的上下兩側各有一個約I毫米長的裂孔,與腎臟相通,稱腎生殖孔。在繁殖季節(jié),成熟個體的性腺極為飽滿,成熟的精子或卵子通過左右兩側的腎生殖孔進入腎臟,扇貝靜置陰干后精液從左右腎孔流出到外套腔中;扇貝在海水中,通過雙殼的開啟和閉合運動,把排放在腎管中的精液從腎孔處噴射到海水中。
      [0004]目前收集貝類精液大多采用解剖法和自然排放法,前者不能保證所得到的精子完全成熟,后者不能避免精子過早被海水激活。如鮑魚精液的收集通常采用陰干和升溫相結合誘導親鮑排精,再離心濃縮產(chǎn)至海水中的精子[Liliana Salinas-Flores等,Journalof shellfish,2005,24(2):415-420 ;Gwo Jin-Chywan 等,Theriogenology,2002,58:1563-1578],所得到精子因長時間與海水接觸,能量損失相對較多;Hughes (Cryobiology,1973,10:342-344)和 Zell 等(Cryobiology, 1979,16:448-460)研究表明這種海水一精子混合物用于牡蠣精子冷凍效果并不理想,盡管采用解剖性腺組織的方法獲得精液濃度較高,但不能保證所獲得的精子完全成熟,且精液中殘留不少其它的組織細胞,親貝只能取精一次。

      【發(fā)明內容】

      [0005]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種高品質蝦夷扇貝精液的采集方法,利用本發(fā)明方法能夠多批次收集到高濃度、高成熟率和低激活率的蝦夷扇貝精子,以適用于精子冷凍保存和雜交授精試驗的研究,能克服扇貝育種過程中遠緣雜交生殖隔離以及不同地域不同時間開展品種改良的難題。在培育出生長快、抗逆能力強的優(yōu)質親貝的基礎上,多批次收集濃度高且品質佳的扇貝精液,用于培育優(yōu)質苗種,可有效遏制目前存在的品質下降,大面積死亡問題,確保扇貝養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。
      [0006]本發(fā)明是按照以下操作方法完成的:
      [0007]一種高品質蝦夷扇貝精液的采集方法,它包括:1)優(yōu)質雄貝的挑選、暫養(yǎng)和促熟;2)雄性蝦夷扇貝精液的多次誘導排放與采集;3)檢測收集精子的品質;
      [0008]所述的雄性蝦夷扇貝精液的多次誘導排放與采集:待雄貝性腺第一次充分發(fā)育成熟、個別出現(xiàn)排精現(xiàn)象時,將雄貝從水體中取出,控干外套腔中的水分,置于空氣溫度8-16°C通風陰涼處陰干30min~Ihr,當雄貝雙殼開啟時,在不傷害親貝的情況下,維持雙殼開啟狀態(tài),用脫脂棉吸盡外套腔中殘留的海水和外套腔液,靜置片刻,有些雄貝的腎孔處會有白色精液自然流出,能夠直接采集;有些雄貝性腺雖然充分發(fā)育成熟但對陰干刺激不敏感,將陰干Ihr后仍不排放精液者重新放入10-12°C海水中使用水槽流水催產(chǎn),當雄貝出現(xiàn)排精狀態(tài)時,立即從海水中取出,置于空氣溫度8-16°C通風陰涼處陰干30min~lhr,等待親貝自然張開雙殼,維持蝦夷扇貝雙殼自然開啟狀態(tài),然后迅速將其外套腔中殘余的海水及外套腔液吸盡,等待精液從腎孔處自動流出,從而采集精液;采集好的精液放入冰上預冷的Eppendorf管中備用;采集完精液后的親貝移養(yǎng)至6~8°C低溫海水中開始下一輪的促熟、誘導排精和精液采集,根據(jù)蝦夷扇貝雄貝狀態(tài)和研究需要安排親貝促熟、誘導排精和精液采集的次數(shù)。
      [0009]所述的檢測所收集精子的品質是指用海水稀釋精液40倍,置于顯微鏡下觀察精子活動情況。[0010]本發(fā)明與已有技術相比的有益效果:
      [0011]1.本發(fā)明收集方法簡單,易于操作,不會對親貝造成傷害,可重復多次采集精液。只需了解扇貝的生殖腺及排泄器官的解剖結構,精確辨別出腎管和腎孔便可進行精液的采集。一般雄性蝦夷扇貝通過該方法一次可收集精液0.5~1.5ml/只。在控溫和保證充足營養(yǎng)的條件下,能促進性腺多次成熟排放,每個扇貝能重復采集2-4次直至三四月份。
      [0012]2.采用本方法獲得的精液品質好、濃度高,為0.2-1.6X IO9個/ml ;成熟度也高,高達100%,因為精子只有充分成熟以后才能連同精液一起自然排放到腎管中,再從腎孔排出至體外,所收集的精子幾乎沒有接觸到海水,處于未激活狀態(tài),因而便于保存。
      【具體實施方式】
      [0013]下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明:
      [0014]最佳實施例具體操作工藝過程:
      [0015]2012年1-4月份,選擇殼高9~llcm、2~3齡、健康活潑的雄性奸夷扇貝暫養(yǎng),建立優(yōu)質親貝群體;從此群體中挑選性腺充分成熟的個體,通過陰干和升溫流水方式誘導雄貝排精,用質量好的一次性吸管在腎孔附近吸取自動排出的精液。通過精子活力檢測、超低溫冷凍保存及授精試驗,證明本方法所獲得的精液具有濃度高、成熟度高和激活率低的品質。
      [0016]完成上述操作過程具體操作如下:
      [0017]一種高品質蝦夷扇貝精液的采集方法,其步驟包括:1)優(yōu)質親貝的挑選、暫養(yǎng)和促熟;2)雄性蝦夷扇貝精液的多次誘導排放與采集;3)檢測收集精子的品質;
      [0018]I)優(yōu)質親貝的挑選、暫養(yǎng)和促熟:
      [0019]一月份,從養(yǎng)殖海區(qū)挑選殼高9~llcm、2~3齡、健康活力強的蝦夷扇貝雄貝40只,移入室內進行暫養(yǎng),暫養(yǎng)密度每立方米水體20只,暫養(yǎng)水溫由開始的3-4°C,每天升溫
      0.5°C至6°C恒溫培育。暫養(yǎng)過程中每天倒池一次,投喂培育的單細胞藻硅藻3~4萬個/ml或金藻5~6萬個/ml或扁藻I~2萬個/ml,三種單細胞藻混合投喂效果更好,餌料不足時補充鮮酵母、食母生及螺旋藻等人工餌料;待個別扇貝出現(xiàn)少量精液排放現(xiàn)象時,恒溫在6°C暫養(yǎng),等待誘導排精,此時換水投餌動作要輕,防止誘發(fā)親貝直接排放精液到海水中。
      [0020]2)雄性蝦夷扇貝精液的多次誘導排放與采集
      [0021]從暫養(yǎng)的雄貝群體中,挑選生殖腺飽滿、已出現(xiàn)少量排精的雄貝10只,控干外套腔中海水后放置室溫10°c陰涼干燥處陰干約30min,當扇貝雙殼自然開啟時,在不損傷扇貝閉殼肌的情況下,維持扇貝殼的開啟狀態(tài),用脫脂棉迅速吸干外套腔中的海水及外套腔液,靜置片刻,有些扇貝腎孔處有白色精液流出,能夠直接采集。有些雄貝性腺雖然充分發(fā)育成熟但對陰干刺激不敏感,在陰干Ihr后,仍不排放精液,便把所述的雄性蝦夷扇貝放入到12 V流動海水中誘導其排放精液。當觀察到流水中雄性蝦夷扇貝出現(xiàn)排精時,立刻從海水中取出,置于空氣溫度10°C通風陰涼處陰干30min~Ihr等待親貝自然張開雙殼,在不傷害親貝的情況下,維持雙殼開啟狀態(tài),用脫脂棉迅速吸干外套腔中的海水及外套腔液,靜置片刻,蝦夷扇貝腎孔處有白色精液流出,用一次性吸管在腎孔附近吸取精液。采集后的精液放入冰上預冷的Eppendorf管中備用。一次性吸管和Eppendorf管是經(jīng)密閉高溫高壓消毒的。已排放精液的雄貝移養(yǎng)至6~8°C低溫海水中,通過加強親貝營養(yǎng)來促使整個性腺再發(fā)育,達到再次成熟排放精液的目的。本實施例中的蝦夷扇貝共采精3次,采集精液24ml。[0022]3)檢測收集精子的品質:取5 μ L精液,用195 μ L海水稀釋40倍,將擦洗干凈的計數(shù)板放于顯微鏡的載物臺上,蓋上蓋玻片。迅速取一滴稀釋的精液于血球計數(shù)板蓋玻片的邊緣使精液自動滲進計數(shù)室。置于200倍或400倍暗視野顯微鏡下觀察精子活動情況,借助計數(shù)板上的標準網(wǎng)格進行目測計數(shù),估計精子濃度,觀察活動與不活動的精子數(shù)目。數(shù)出計數(shù)室的四角及中央共五個大方格即80個小方格內的精子數(shù)。計數(shù)每小格內的精子,只數(shù)格內及壓在左線和上線者。前進運動精子數(shù)占全部精子數(shù)的百分比為精子活力,所測精子的活力各批次有不同,但都大于80 %。
      [0023]實施例2
      [0024]在使用本發(fā)明方法進行采集蝦夷扇貝雄貝精子的同時,另外采用2種不同的方法收集精液:Α.解剖法:將性腺剪切成碎塊放于500目篩絹上,海水沖洗濾出精液至冰上預冷的小燒杯中;Β.離心濃縮法:用離心管收集排入海水中的精液,經(jīng)冷凍離心,濃縮的精液存于IOml離心管內冰上預冷備用。為消除蝦夷扇貝個體間的差異,本實施例的2種方法與實施例I收集的精液均來源于同一批蝦夷扇貝的多個個體。
      [0025]使用與實施例1步驟3)同樣的方法檢測所述解剖法和離心濃縮法所采集的精子活力,結果表明兩種方法的精子的活力均大于80%。
      [0026]實施例3驗證檢測后3種方法所采集的精液品質:
      [0027]通過精子超低溫冷凍保存和授精試驗,以驗證精液收集方式與所采集精液質量的關系。結果表明,三種方法(實施例1的方法和實施例2的兩種方法)收集的精液冷凍前精子的活力差異不顯著,但冷凍后實施例1方法收集到的精液冷凍效果最好,解凍后精子活力為49.3±6.1 %,而A和B所得的凍精活力分別為25.7±4.0%、28.7±1.5%,與實施例1的結果相比差異顯著(P < 0.05)。因為腎孔處自然排放的精子其外圍環(huán)境更接近生理狀態(tài),且較高的精子密度限制了精子活動,使精子能量保存較好,適合用于精子冷凍保存。由實施例1方法收集到的精液受精能力亦強,在與同一批卵子受精時,其受精率高達95%,明顯高于A (約為80% )和B (約為90% )方法,實施例1方法收集到的精液放置在4°C冰箱中保存一周之內仍具備一定的受精能力,但A方法采集的精液只能保存24hr左右,B方法米集的精液只能保存Ihr左右,之后受:精能力喪失。
      [0028]通過我們發(fā)明的這種精液收集方法所采集的精液除了可用于精子低溫冷凍保存和受精試驗外,還可考慮用于基于精子為載體的轉基因研究或以精子為原材料的雌核發(fā)育、雄核發(fā)育等的研究。
      【權利要求】
      1.一種高品質蝦夷扇貝精液的采集方法,其特征在于它包括:1)優(yōu)質雄貝的挑選、暫養(yǎng)和促熟;2)雄性蝦夷扇貝精液的多次誘導排放與采集;3)檢測收集精子的品質; 所述的雄性蝦夷扇貝精液的多次誘導排放與采集:待雄貝性腺第一次充分發(fā)育成熟、個別出現(xiàn)排精現(xiàn)象時,將雄貝從水體中取出,控干外套腔中的水分,置于空氣溫度8-16°C通風陰涼處陰干30min~Ihr,當雄貝雙殼開啟時,在不傷害親貝的情況下,維持雙殼開啟狀態(tài),用脫脂棉吸盡外套腔中殘留的海水和外套腔液,靜置片刻,有些雄貝的腎孔處會有白色精液自然流出,能夠直接采集;有些雄貝性腺雖然充分發(fā)育成熟但對陰干刺激不敏感,將陰干Ihr后仍不排放精液者重新放入10-12°C海水中使用水槽流水催產(chǎn),當貝出現(xiàn)排精狀態(tài)時,立即從海水中取出,置于空氣溫度8-16°C通風陰涼處陰干30min~lhr,待親貝自然張開雙殼,維持蝦夷扇貝雙殼自然開啟狀態(tài),然后迅速將其外套腔中殘余的海水及外套腔液吸盡,等待精液從腎孔處自動流出,從而采集精液;采集好的精液放入冰上預冷的Eppendorf管中備用;米集完精液后的未貝移養(yǎng)至6~8 C低溫海水中開始下一輪的促熟、誘導排精和精液采集,根據(jù)蝦夷扇貝雄貝狀態(tài)和研究需要安排親貝促熟、誘導排精和精液采集的次數(shù)。
      2.根據(jù)權利要求1所述的所述的方法,其特征在于所述的檢測所收集精子的品質是指用海水稀釋精液40倍 ,置于顯微鏡下觀察精子活動情況。
      【文檔編號】A01K61/00GK103891661SQ201410164003
      【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權日:2014年4月23日
      【發(fā)明者】楊愛國, 周麗青, 楊培民, 劉志鴻, 吳彪, 孫秀俊 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所
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