煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，包括抑菌劑的配制、培養(yǎng)容器消毒、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)基配制、共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和抗性苗檢測(cè)。采用本發(fā)明的煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基都無(wú)需進(jìn)行高溫高壓滅菌，減少了工作量和能源消耗，簡(jiǎn)化了煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)環(huán)節(jié)，降低了煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)成本；本發(fā)明的煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，操作簡(jiǎn)單，只要按不同的培養(yǎng)基配方配制后，再加上抑菌劑即可，實(shí)用性強(qiáng)，推廣性好；本發(fā)明的煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法與常規(guī)方法比較，可以降低成本10％以上。
【專利說(shuō)明】煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物組培方法，具體涉及一種煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生物技術(shù)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，煙草轉(zhuǎn)基因的研究越來(lái)越深入和完善。目前，轉(zhuǎn)基因煙草的研究提高了煙草抵抗病害、蟲害、逆境、除草劑、重金屬污染的能力，在提高煙草品質(zhì)和安全上也發(fā)揮了重要作用。由于煙草易于進(jìn)行組織培養(yǎng)、容易得到再生轉(zhuǎn)化煙株，作為模式植物，煙草在生物功能基因組研究中，占有舉足輕重的地位。
[0003]植物組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化后需進(jìn)行篩選，將轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子區(qū)分開來(lái)，并將非轉(zhuǎn)化子淘汰。目前對(duì)煙草轉(zhuǎn)化子的篩選主要采用抗生素篩選法。即在目的基因旁邊融合一個(gè)編碼轉(zhuǎn)化或分解某種抗生素酶的報(bào)告基因。這種報(bào)告基因表達(dá)的產(chǎn)物(Enzyme)可使被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或植株能抵抗某一特定的抗生素.而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞團(tuán)不具有抗性基因而在篩選培養(yǎng)基中死亡。
[0004]在煙草遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，大量的工作都集中在培養(yǎng)基的配制和接種上，尤其是培養(yǎng)基的配制。在常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，需要添加一些能抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素，這些抗生素不耐高溫高壓，只能通過(guò)過(guò)濾滅菌后才能加入培養(yǎng)基中。常規(guī)情況下是，培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌后，冷卻到40°C -50°C，再加入經(jīng)過(guò)濾滅菌后的抗生素，然后分裝到培養(yǎng)容器中，冷卻凝固后備用。以上工作程序繁鎖、工作量大。如果能找到一種無(wú)需高溫高壓、又能抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)、同時(shí)還不影響煙草正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，就可以解決以上問(wèn)題。因此，本發(fā)明將簡(jiǎn)化煙草由農(nóng)桿菌介導(dǎo)后的篩選培養(yǎng)環(huán)節(jié)，人工操作的效率將大幅度提高，從而大幅度降低人工成本。不僅如此，由于培養(yǎng)基自身具有殺菌、抗菌或抑菌作用，后期的組織培養(yǎng)過(guò)程的污染問(wèn)題還能得到有效控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的。
[0007]本發(fā)明的一種煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，包括抑菌劑的配制、培養(yǎng)容器消毒、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)基配制、共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、抗性苗檢測(cè)，其特征在于:
[0008]1、抑菌劑的配制:稱2.4g的富馬酸二甲酯用20ml無(wú)水乙醇溶解后，加20%的次氯酸鈉溶液100ml，加20g山梨酸鉀，再加2g乳酸鏈球菌素，用蒸餾水定容到200ml，即為抑菌劑；
[0009]2.培養(yǎng)容器消毒:將培養(yǎng)瓶及瓶蓋在抑菌劑與水的體積比為1%。~2%。( V / V )的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?br> [0010]3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:選擇攜帶hyg基因的植物表達(dá)載體，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中，制成轉(zhuǎn)化菌液,用轉(zhuǎn)化菌液侵染煙草葉片；[0011 ] 4.培養(yǎng)基配制:共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L ΒΑ+100 μ mol/L乙酰丁香酮+0.4~
0.5ml/L抑菌劑+20.0g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂粉，pH5.8 ;篩選培養(yǎng)基為MS+0.1~0.5mg/L6-BA+30mg/L 潮霉素 +0.4 ~0.5ml/L 抑菌劑 +300mg/L Timentin+30.0g/L 蔗糖 +3.5g/L瓊脂粉，pH5.8 ;生根培養(yǎng)基為 1/2MS+0.4 ~0.5ml/L 抑菌劑 +300mg/L Timentin+30g/L 蔗糖+3.5g/L瓊脂粉，ρΗ5.8 ;所述MS培養(yǎng)基為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述6-ΒΑ，指6-芐氨基嘌吟；配制培養(yǎng)基時(shí)，先不加抑菌劑，按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容、加熱至瓊脂粉完全溶解，等溫度降到40~50°C時(shí)，再按各培養(yǎng)基配方添加抑菌劑，用lmol/L的NaOH或lmol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒處理的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固后備用；
[0012]5.共培養(yǎng):將侵染后的材料從轉(zhuǎn)化菌液中取出，用滅菌濾紙吸干表面的轉(zhuǎn)化菌液，然后轉(zhuǎn)至共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在22°C黑暗條件下共培養(yǎng)3d ；
[0013]6.篩選培養(yǎng):將共培養(yǎng)后的材料移至篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室溫度為28°C,光照12h，光照強(qiáng)度為12001x ;15d后部分愈傷組織分化出小芽并形成小苗；選取高于2cm的小苗轉(zhuǎn)生根培養(yǎng)；
[0014]7.生根培養(yǎng):將篩選培養(yǎng)獲得高于2cm的小苗，分成單株接種至生根培養(yǎng)基中，20~30d可形 成完整植株，即抑菌培養(yǎng)苗；培養(yǎng)室溫度為28°C，光照12h，光照強(qiáng)度為15001x ；
[0015]8.抗性苗檢測(cè):取移栽成活的抑菌培養(yǎng)苗的葉片材料，進(jìn)行DNA提取、PCR檢測(cè)，呈現(xiàn)陽(yáng)性的植株為成功導(dǎo)入HYG基因的轉(zhuǎn)基因植株。
[0016]本發(fā)明的應(yīng)用效果:
[0017]1、本發(fā)明培養(yǎng)基中不同抑菌劑濃度對(duì)農(nóng)桿菌侵染后愈傷組織污染的影響:我們?cè)O(shè)計(jì)了 7種抑菌劑濃度的對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，以抑菌劑濃度0.4~
1.0ml/L為佳，當(dāng)抑菌劑濃度為0.4ml/L以上時(shí)，農(nóng)桿菌污染率均為O ;抑菌劑濃度大于
1.0ml/L時(shí)，愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?，部分愈傷組織出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。
[0018]表1本發(fā)明篩選培養(yǎng)基中不同抑菌劑濃度對(duì)農(nóng)桿菌侵染后愈傷組織污染的影響
[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，包括抑菌劑的配制、培養(yǎng)容器消毒、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)基配制、共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、抗性苗檢測(cè)，其特征在于: (1)抑菌劑的配制:稱2.4g的富馬酸二甲酯用20ml無(wú)水乙醇溶解后，加20%的次氯酸鈉溶液100ml，加20g山梨酸鉀，再加2g乳酸鏈球菌素，用蒸餾水定容到200ml ； (2)培養(yǎng)容器消毒:將培養(yǎng)瓶及瓶蓋在抑菌劑與水的體積比為1%。~2%。的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫? (3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:選擇攜帶hyg基因的植物表達(dá)載體,導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105中，制成轉(zhuǎn)化菌液，用轉(zhuǎn)化菌液侵染煙草葉片； (4)培養(yǎng)基配制:共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L ΒΑ+100 μ mol/L乙酰丁香酮+0.4~ 0.5ml/L抑菌劑+20.0g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂粉，pH5.8 ;篩選培養(yǎng)基為MS+0.1~0.5mg/L6-BA+30mg/L 潮霉素 +0.4 ~0.5ml/L 抑菌劑 +300mg/L Timentin+30.0g/L 蔗糖 +3.5g/L瓊脂粉，pH5.8 ;生根培養(yǎng)基為 1/2MS+0.4 ~0.5ml/L 抑菌劑 +300mg/L Timentin+30g/L 蔗糖+3.5g/L瓊脂粉，ρΗ5.8 ;所述MS培養(yǎng)基為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述6-ΒΑ，指6-芐氨基嘌吟；配制培養(yǎng)基時(shí)，先不加抑菌劑，按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容、加熱至瓊脂粉完全溶解，等溫度降到40~50°C時(shí)，再按各培養(yǎng)基配方添加抑菌劑，用lmol/L的NaOH或lmol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒處理的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固后備用； (5)共培養(yǎng):將侵染后的材料從轉(zhuǎn)化菌液中取出，用滅菌濾紙吸干表面的轉(zhuǎn)化菌液，然后轉(zhuǎn)至共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在22°C黑暗條件下共培養(yǎng)3d ； (6)篩選培養(yǎng):將共培養(yǎng)后的材料移至篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室溫度為28°C,光照12h,光照強(qiáng)度為12001x ;15d后部分愈傷組織分化出小芽并形成小苗；選取高于2cm的小苗轉(zhuǎn)生根培養(yǎng)； (7)生根培養(yǎng):將篩選培養(yǎng)獲得高于2cm的小苗，分成單株接種至生根培養(yǎng)基中，20~30d可形成完整植株，即抑菌培養(yǎng)苗；培養(yǎng)室溫度為28°C，光照12h，光照強(qiáng)度為15001x ； (8)抗性苗檢測(cè):取移栽成活的抑菌培養(yǎng)苗的葉片材料，進(jìn)行DNA提取、PCR檢測(cè)，呈現(xiàn)陽(yáng)性的植株為成功導(dǎo)入HYG基因的轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，其特征在于共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為 MS+0.5mg/L ΒΑ+100 μ mol/L 乙酰丁香酮 +0.5ml/L 抑菌劑 +20.0g/L 蔗糖 +3.5g/L瓊脂粉，ρΗ5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，其特征在于篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基為 MS+0.2mg/L6-BA+30mg/L 潮霉素 +0.5ml/L 抑菌劑 +300mg/L Timentin+30.0g/L鹿糖+3.5g/L瓊脂粉，pH5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種煙草遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，其特征在于生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為 1/2MS+0.5ml/L抑菌劑+300mg/L Timentin+30g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂粉，ρΗ5.8。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103952438SQ201410184021
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】許莉萍, 林慶良, 高世武, 陳曉英 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)