一種哺乳動物睪丸組織冷凍保存的抗凍劑及冷凍-解凍方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種哺乳動物睪丸組織冷凍保存的抗凍劑，該抗凍劑是BSA冷凍保護劑或者是海藻糖冷凍保護劑，BSA冷凍保護劑的配方為：BSA：15mg/mL，DMEM-F12：0.65mL/mL，青鏈霉素雙抗：0.05mL/mL，緩沖液：0.05mL/mL，胎牛血清FBS：0.1mL/mL；海藻糖冷凍保護劑的配方為：海藻糖：40mg/mL，DMEM-F12：0.6mL/mL，青鏈霉素雙抗：0.05mL/mL，緩沖液：0.05mL/mL，胎牛血清FBS：0.1mL/mL。采用該抗凍劑能夠在冷凍-解凍過程中很好地保護哺乳動物睪丸組織的生理活性。
【專利說明】一種晡乳動物睪丸組織冷凍保存的抗凍劑及冷凍-解凍方

法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于哺乳動物睪丸組織冷凍保存的抗凍劑及其冷凍-解凍的技術(shù)體系，可使哺乳動物睪丸組織冷凍-解凍后保持良好的生理活性。
【背景技術(shù)】
[0002]哺乳動物 睪丸組織低損傷冷凍保存技術(shù)為優(yōu)良家畜品種生殖細胞保存、珍稀瀕危物種的保護等提供了新的途徑，為未成年男性生育能力的恢復(fù)、組織器官的冷凍保存等提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)，有利于體外獲得精子細胞并促進人工授精技術(shù)的發(fā)展，為以睪丸組織為實驗材料的相關(guān)研究提供樣本保存方案。由于睪丸組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜且包含不同類型的細胞，而不同細胞的冷凍耐受性差異較大，因而睪丸組織的冷凍保存要求更完善的冷凍-解凍技術(shù)體系；冷凍保護劑正是在整個睪丸組織冷凍保存過程中影響其效果的關(guān)鍵因素，其成份配伍直接且明顯地影響凍后睪丸組織的生理活性。
[0003]酶是生物體內(nèi)新陳代謝的催化劑，是生物體實現(xiàn)自我更新、組織細胞發(fā)揮其生理機能的關(guān)鍵因素，因而組織中酶的活性可以作為判定組織生理活性的依據(jù)。堿性磷酸酶(AKP)是一種含鋅的胞漿結(jié)合酶，AKP的活性在精原細胞和早期發(fā)育時期的初級精母細胞內(nèi)較強；酸性磷酸酶(ACP)是睪丸支持細胞溶酶體的特異酶，可使己糖磷酸酯脫磷酸而成為果糖作為精子游動的能源，可作為衡量是否有生精障礙的指標；乳酸脫氫酶(LDH)主要存在于精母細胞、精子細胞質(zhì)及精子尾中段線粒體中，催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸進行無氧代謝，是生精細胞代謝產(chǎn)生能量的主要酶；葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase)在睪丸組織內(nèi)主要位于支持細胞的溶酶體和線粒體中，參與各種葡萄糖苷酸的水解以及細胞器的降解和細胞更新。因此，以上4種酶可作為睪丸組織的標志性酶，酶活力可作為判定睪丸組織生理活性的依據(jù)。
[0004]在傳統(tǒng)的細胞和組織冷凍保存過程中，通常使用滲透性的甘油和DMSO作為冷凍保護劑，由于二者具有一定的生物毒性，因而對細胞和組織的冷凍保存效果并不理想。牛血清白蛋白(BSA)是一種從牛血清中提取的、含有580多個氨基酸組成的單肽鏈，具有復(fù)雜的三維分子形狀，能結(jié)合多種代謝產(chǎn)物。BSA作為蛋白質(zhì)類膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑，在冷凍保存過程中可以去除細胞核組織膜中的部分膽固醇和鋅，從而調(diào)整膜的脂肪水平并改變膜的穩(wěn)定性(Dow and Bavisterl989);可以克服冷凍過程中產(chǎn)生的溶血磷脂和自由脂肪酸引起的Ca2+易進入細胞內(nèi)的性質(zhì)(Buhr 1990);可以中和細菌與組織代謝的副產(chǎn)物，起到一定抗氧化作用和緩沖作用(Maxwel11996)。另外，Watson(1981)研究認為，低密度蛋白質(zhì)可使膜磷脂處于溶解狀態(tài)，BSA能通過溶解磷脂使膜具有一定的流動性，從而發(fā)揮對細胞和組織膜結(jié)構(gòu)的保護作用。海藻糖是一種典型的應(yīng)激代謝產(chǎn)物，能夠在高寒、高滲透壓等惡劣條件下于細胞和組織的表面形成獨特的保護膜，有效地保護生物大分子的結(jié)構(gòu)不被破壞，從而維持生物體的正常生命過程和生理特征。海藻糖的冷凍保護機理與其晶體結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性緊密相關(guān)。Sussich等認為，海藻糖作為一種穩(wěn)定的非還原性雙糖，在冷凍過程中可以在細胞和組織膜外產(chǎn)生一種玻璃狀的防護層，提高了細胞對高滲透壓和低溫環(huán)境的耐受性；海藻糖作為一種水分替代物，在冷凍過程中避免了細胞膜在固相-液相轉(zhuǎn)變中受到傷害，在細胞內(nèi)主要作為一種親和性溶質(zhì)來抗衡細胞外的滲透壓變化。另外，海藻糖在冷凍過程中可以強力地束縛水分子，與膜脂質(zhì)共同擁有結(jié)合水或者本身起到代替膜結(jié)合水的功能，防止細胞和組織因失水而造成養(yǎng)分損失和細胞損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，提供一種哺乳動物睪丸組織低損傷冷凍保存的抗凍劑及其采用該抗凍劑用于哺乳動物睪丸組織的冷凍-解凍的方法，本發(fā)明以牛血清白蛋白(BSA)或海藻糖作為冷凍保護劑的主要成份，以冷凍保存前后犢牛睪丸組織AKP、ACP、LDH和β -D-Glucosidase的酶活性為評定指標,探索最佳的冷凍保護劑配伍與冷凍_解凍技術(shù)體系，以保持哺乳動物睪丸組織在冷凍-解凍后具有良好的生理活性。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:
[0007]—種哺乳動物睪丸組織的冷凍保存的抗凍劑，其特征在于，所述的抗凍劑是BSA冷凍保護劑或者是海藻糖冷凍保護劑，其中:
[0008]BSA冷凍保護劑 的配方為:BSA:15mg/mL, DMEM-F12:0.65mL/mL,青鏈霉素雙抗:0.05mL/mL，緩沖液:0.05mL/mL，胎牛血清 FBS:0.lmL/mL ；
[0009]海藻糖冷凍保護劑的配方為:海藻糖:40mg/mL，DMEM-F12:0.6mL/mL,青鏈霉素雙抗:0.05mL/mL，緩沖液:0.05mL/mL，胎牛血清 FBS:0.lmL/mL。
[0010]所述的緩沖液采用pH = 7的Na2HPO4-檸檬酸鈉緩沖液。
[0011]上述哺乳動物睪丸組織的冷凍保存的抗凍劑用于哺乳動物睪丸組織的冷凍-解凍的方法，其特征在于，按下列步驟實施:
[0012]I)在5ml可立式冷凍管中加入2ml經(jīng)過剪碎的無菌睪丸組織，然后加入BSA冷凍保護劑2ml作為抗凍劑，或者加入海藻糖冷凍保護劑2ml作為抗凍劑；
[0013]2)于4 V冰箱中平衡2h，-20 V冰箱中平衡2h，-80 V超低溫冰箱中凍存12h，最后投入液氣te中冷凍保存；
[0014]3)凍存7d后，在37°C水浴鍋中解凍至完全溶解，離心棄去冷凍保護劑后將睪丸組織移入培養(yǎng)皿中無菌培養(yǎng)24h，然后將睪丸組織和培養(yǎng)液制備成10%的組織勻漿液并離心取上清液；
[0015]4)測定勻漿液中堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、乳酸脫氫酶和葡萄糖苷酶的活性值。
[0016]本發(fā)明的哺乳動物睪丸組織的冷凍保存的抗凍劑，由于采用了 BSA冷凍保護劑或海藻糖冷凍保護劑作為抗凍劑，能夠在哺乳動物睪丸組織的冷凍-解凍過程中很好地保護哺乳動物睪丸組織的生理活性。
【具體實施方式】
[0017]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。
[0018]按照本發(fā)明的技術(shù)方案，本實施例給出兩種哺乳動物睪丸組織冷凍保存的抗凍劑，它們是BSA冷凍保護劑或海藻糖冷凍保護劑(表1)，其中:
[0019]BSA冷凍保護劑的配方為:BSA:15mg/mL, DMEM-F12:0.65mL/mL,青鏈霉素雙抗:0.05mL/mL，緩沖液:0.05mL/mL，胎牛血清 FBS:0.lmL/mL ；
[0020]海藻糖冷凍保護劑的配方為:海藻糖:40mg/mL，DMEM-F12:0.6mL/mL,青鏈霉素雙抗:0.05mL/mL，緩沖液:0.05mL/mL，胎牛血清 FBS:0.lmL/mL。
[0021]表1:BSA和海藻糖的冷凍保護劑配方
[0022]
【權(quán)利要求】
1.一種哺乳動物睪丸組織的冷凍保存的抗凍劑，其特征在于，所述的抗凍劑是BSA冷凍保護劑或者是海藻糖冷凍保護劑，其中: BSA冷凍保護劑的配方為:BSA:15mg/mL, DMEM-F12:0.65mL/mL,青鏈霉素雙抗:0.05mL/mL，緩沖液:0.05mL/mL，胎牛血清 FBS:0.lmL/mL ； 海藻糖冷凍保護劑的配方為:海藻糖:40mg/mL，DMEM-F12:0.6mL/mL，青鏈霉素雙抗:0.05mL/mL，緩沖液:0.05mL/mL，胎牛血清 FBS:0.lmL/mL。
2.如權(quán)利要求1所述的哺乳動物睪丸組織的冷凍保存的抗凍劑，其特征在于，所述的緩沖液采用PH = 7的Na2HPO4-檸檬酸鈉緩沖液。
3.權(quán)利要求1或2所述的哺乳動物睪丸組織的冷凍保存的抗凍劑用于哺乳動物睪丸組織的冷凍-解凍的方法，其特征在于，按下列步驟實施: 1)在5ml可立式冷凍管中加入2ml經(jīng)過剪碎的無菌睪丸組織，然后加入BSA冷凍保護劑2ml作為抗凍劑，或者加入海藻糖冷凍保護劑2ml作為抗凍劑； 2)于4°C冰箱中平衡2h，-20°C冰箱中平衡2h，-80°C超低溫冰箱中凍存12h，最后投入液氮罐中冷凍保存； 3)凍存7d后，在37°C水浴鍋中解凍至完全溶解，離心棄去冷凍保護劑后將睪丸組織移入培養(yǎng)皿中無菌培養(yǎng)24h，然后將睪丸組織和培養(yǎng)液制備成10%的組織勻漿液并離心取上清液； 4)測定勻漿液中堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、乳酸脫氫酶和葡萄糖苷酶的活性值。
【文檔編號】A01N1/02GK103999849SQ201410190831
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】胡建宏, 洪潔赟, 王春偉, 張小剛, 朱慶超, 張衛(wèi)藝, 呂妍, 郭秋平, 趙軍, 李青旺, 賈永宏 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)