雜合抗菌抗病毒多肽、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型的雜合抗菌抗病毒多肽，所述多肽的氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQ?ID?No.1和2所示。通過將編碼所述多肽的基因克隆至表達(dá)載體pETSUMO，得到重組表達(dá)載體，然后通過熱應(yīng)激法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SUMO蛋白酶酶切后經(jīng)Ni-NTA?Sepharose色譜柱純化，分離獲得目標(biāo)多肽。所述多肽在體外對多種細(xì)菌、病毒均具有抑殺作用，且不易產(chǎn)生抗性，可作為理想的抗生素替代品和人畜生物性藥物、飼料添加劑、防腐劑或消殺劑等。
【專利說明】雜合抗菌抗病毒多肽、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程及生物制藥領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新型的雜合抗菌抗病毒多肽、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]抗生素對于控制、預(yù)防和治療各種感染性疾病具有重要作用。由于抗生素的使用，到20世紀(jì)80年代，人類幾乎可以征服所有的感染類疾病，然而，隨著時間的推移以及抗生素的濫用，耐藥菌株愈來愈多。有監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，最具代表性的耐藥菌株當(dāng)中，耐藥的葡萄球菌已上升至40% ;耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌則超過77%?，F(xiàn)在，已經(jīng)出現(xiàn)了能對抗所有抗生素的耐藥菌，抗生素耐藥問題已嚴(yán)重威脅到人類的健康。解除耐藥菌對人類健康日益嚴(yán)重的威脅成為亟待解決的問題，因此新一類抗微生物物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和研制已經(jīng)成為國際上研究的熱點。
[0003]抗菌肽(Antimicrobial Peptides, AMPs)是由生物細(xì)胞特定基因編碼,經(jīng)特定外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類分子量較小的活性多肽，一般由20~60個氨基酸殘基組成，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒、腫瘤、內(nèi)毒素和原生動物的作用，并且具有刺激單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的趨化，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等生物學(xué)活性。自上世紀(jì)70年代末Boman等首次從惜古比天蠶中發(fā)現(xiàn)天蠶素以來，抗菌肽因其獨特的殺菌機(jī)制和優(yōu)良的理化性質(zhì)吸引了越來越多專家學(xué)者的關(guān)注，并已成為安全綠色抗生素添加劑替代品的理想選擇，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]蜂毒素(又稱蜂毒溶血肽，Melittin,縮寫ME)由26個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量2984道爾頓，不含二硫鍵，是蜂毒中的主要活性物質(zhì)，具有抗菌、抗輻射和非常顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用。蜂毒素能夠抑制20~30種革蘭氏陰性及革蘭氏陽性病原微生物的繁育，并能對抗對青霉素有耐藥性的金黃色葡萄球菌。蜂毒素是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的抗炎活性最強的物質(zhì)之一，其抗炎活性是氫化可的松的100倍。但溶血性嚴(yán)重，不能單獨作為藥物使用，因此需要將它與其他抗菌肽組合成新雜合肽使用。LL-37，相對分子質(zhì)量約5000道爾頓，是迄今在人體中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽(cathelicidin)家族中的唯一成員，也是人體內(nèi)唯一具有雙親性α螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽。其廣泛分布在人體的血液細(xì)胞和上皮細(xì)胞中，具有廣譜抗菌作用?？咕钚砸蕾嚻渎菪龢?gòu)象的形成，通過“地毯樣”機(jī)制殺滅細(xì)菌。此外，LL-37還具有中和內(nèi)毒素的作用，能與LPS和CD14結(jié)合，中和LPS的生物活性；利用FPRLl作為受體介導(dǎo)趨化作用，招募免疫細(xì)胞到感染部位，清除病原物；促進(jìn)血管生成等作用。
[0005]隨著對抗菌肽結(jié)構(gòu)、功能與殺菌機(jī)理研究的深入，研究人員開始嘗試?yán)蒙飳W(xué)方法設(shè)計殺菌活力更強、抗菌譜更廣的新型抗菌肽。很多研究報道，將不同抗菌肽分子雜合是獲得高抗菌活性低溶血性的新型抗菌肽分子的有效方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種新型的雜合抗菌抗病毒多肽、其制備方法及應(yīng)用。[0007]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明人在對蜂毒素和LL-37的序列、結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行雜合優(yōu)化，獲得一種新型的雜合抗菌抗病毒多肽，與母源肽(蜂毒素和LL-37)相比，除了具有更強抗菌作用外，還有抗病毒作用。所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0008]例如，將第6位的Leu替換為He，或者在其末端缺失Leu Arg Asn三個氨基酸。因此，本發(fā)明的雜合抗菌抗病毒多肽還包括SEQ ID N0.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有同等功能的由SEQ ID N0.1衍生的多肽。為便于表述，將該多妝命名為M-L。
[0009]本發(fā)明還提供編碼所述雜合抗菌抗病毒多肽的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
[0010]此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏好性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。
[0011]本發(fā)明還提供含有編碼多肽M-L基因的載體。
[0012]本發(fā)明還提供含有編碼多肽M-L基因、或上述載體的宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及工程菌。
[0013]可將編碼多肽M-L的基因與表達(dá)載體可操作地連接，構(gòu)建得到能夠表達(dá)多肽M-L的重組表達(dá)載體，進(jìn)而可以通過諸如熱應(yīng)激和電轉(zhuǎn)化法等轉(zhuǎn)基因方法，將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)M-L基因的轉(zhuǎn)化體，例如基因工程菌。
[0014]本發(fā)明還提 供制備所述多肽M-L的方法，將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌，篩選陽性克隆，誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)多肽，并分離純化表達(dá)產(chǎn)物。
[0015]例如，將編碼多肽M-L的基因克隆至表達(dá)載體pETSUMO，得到重組表達(dá)載體pETSUMO-M-L，通過熱應(yīng)激法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SUMO蛋白酶酶切后經(jīng)N1-NTA Sepharose色譜柱純化，分離獲得目標(biāo)多肽。
[0016]具體地，制備所述雜合抗菌抗病毒多肽的方法包括如下步驟:
[0017]1、重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)多肽M-L氨基酸序列和大腸桿菌密碼子偏好性，設(shè)計M-L基因序列，通過TA克隆與pETSUMO相連。轉(zhuǎn)化大腸桿菌MachlTM-TlK，卡那霉素篩選陽性克隆子，構(gòu)建該多肽的大腸桿菌表達(dá)載體pETSUMO-M-L。提取質(zhì)粒，用特異性引物進(jìn)行PCR驗證，驗證正確后進(jìn)行測序鑒定。證實該雜合抗菌抗病毒多肽大腸桿菌表達(dá)載體pETSUMO-M-L構(gòu)建成功。
[0018]2、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及篩選:重組質(zhì)粒2μ I與200 μ I已活化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴5-30 min,冰浴后42°C水浴熱擊30s (熱擊過程中切忌振蕩)，然后迅速將混合液置于冰上，迅速加入250 μ I室溫的LB培養(yǎng)基，37°C>200rpm振蕩培養(yǎng)Ih ;培養(yǎng)后取200 μ I培養(yǎng)液涂布含50 μ g/ml卡那霉素的LB平板，然后倒置平板于37°C過夜培養(yǎng)。
[0019]隨機(jī)挑取生長出的大腸桿菌菌落于LB培養(yǎng),按照LifeTechnologies公司質(zhì)粒提取試劑盒的操作方法提取重組質(zhì)粒，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增SUMO-M-L基因，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下可見約IlObp大小的明顯條帶，與SUMO-M-L基因的核苷酸序列大小一致，證明大腸桿菌高效表達(dá)菌株建立成功。
[0020]3、誘導(dǎo)表達(dá):挑選陽性克隆，接種于含50 μ g/ml卡那霉素和I %葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，37°C、180-200rpm搖床培養(yǎng)至OD6tltl值為0.6-0.8時，加入IPTG溶液至終濃度
1.5-2.0mM，繼續(xù)培養(yǎng)，12000rpm離心5min，棄上清后-20°C保存。以未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液作為陰性對照。
[0021]表達(dá)上清液于12000rpm離心10min收集菌體，根據(jù)菌體量加入約5倍體積的裂解緩沖液重懸細(xì)胞，吹打均勻，靜置IOmin后，冰浴條件下超聲破碎儀破碎菌體，破碎程序為:工作時長2s、間歇時長6s，共40個循環(huán)，功率240w。破碎后，12000rmp、4°C離心5min，收集上清液進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果顯示出有融合蛋白表達(dá)，經(jīng)測定融合蛋白表達(dá)量可達(dá)到165mg/L左右。
[0022]4、融合蛋白的純化:融合蛋白經(jīng)N1-NTA Sepharose色譜柱純化,收集各洗脫峰樣品，Tricine-SDS-PAGE檢測純化效果。
[0023]5、融合蛋白酶切及目的蛋白的純化:將洗脫峰樣品在4°C、150mMNaCl溶液中透析12-24h，為加快透析速度可多次更換透析液。透析完成后，進(jìn)行酶切反應(yīng)，30°C酶切3h，電泳檢測切割效果。
[0024]酶切反應(yīng)體系:
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一種雜合抗菌抗病毒多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述多肽的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因，或權(quán)利要求4所述載體的宿主細(xì)胞。
6.制備權(quán)利要求1所述多肽的方法，其特征在于，將權(quán)利要求4所述的載體轉(zhuǎn)化宿主菌，篩選陽性克隆，誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)多肽，并分離純化表達(dá)產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將權(quán)利要求3所述基因克隆至表達(dá)載體pET-SUMO，得到重組表達(dá)載體pETSUMO-M-L，通過熱應(yīng)激法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SUMO蛋白酶酶切后經(jīng)N1-NTA Sepharose色譜柱純化，分離獲得目標(biāo)多肽。
8.權(quán)利要求1所述多肽在制備抗菌藥物、抗病毒藥物、飼料添加劑、防腐劑或消殺劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多肽對包括但不限于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、八疊球菌、大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌、酵母、海洋紅酵母、米曲霉、蠟狀芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、格氏鏈球菌、嗜熱鏈球菌、牛鏈球菌、炭疽桿菌、傷寒桿菌、鼠傷寒桿菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、霍亂弧菌、肺炎桿菌在內(nèi)的微生物具有抗菌效果；對包括但不限于流感病毒、藍(lán)耳病病毒在內(nèi)的病毒具有抗病毒效果。
10.含有權(quán)利要求1所述I多肽的抗菌藥物、抗病毒藥物、飼料添加劑、防腐劑或消殺劑。
【文檔編號】A01P3/00GK104017084SQ201410191241
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】張日俊, 黃燕, 武如娟, 衛(wèi)旭彪, 趙龍妹, 鄭昭君, 商婷婷, 劉旭輝, 馬廣 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)