促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞粘附的藥劑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】提供的是能夠有效地生長(zhǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的方法和穩(wěn)定地供應(yīng)角膜內(nèi)皮制劑的方法。促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的含有Rho激酶抑制劑的藥劑，含有Rho激酶抑制劑的用于角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)，用于保存角膜的含有Rho激酶抑制劑的溶液，以及生產(chǎn)角膜內(nèi)皮制劑的方法，該方法包括使用以上培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的步驟。
【專(zhuān)利說(shuō)明】促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞粘附的藥劑
[0001]本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)日為2008年8月28日、國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/JP2008/065459、進(jìn)入國(guó)家階段的申請(qǐng)?zhí)枮?00880112897.X、發(fā)明名稱(chēng)為“促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞粘附的藥劑”的PCT申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞粘附的藥劑(agent)，它用于角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、維護(hù)或保護(hù)。 【背景技術(shù)】
[0003]當(dāng)從角膜(在眼球的最前部的透明組織)進(jìn)入的光線到達(dá)視網(wǎng)膜激發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，認(rèn)識(shí)到視覺(jué)信息，并且所產(chǎn)生的電信號(hào)經(jīng)由視神經(jīng)被傳輸?shù)侥X視覺(jué)皮層。為了具有良好的視力，該角膜需要是透明的。當(dāng)利用角膜內(nèi)皮細(xì)胞的泵吸功能和阻隔功能將水含量保持在恒定水平時(shí)，維持角膜的透明度。
[0004]人的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的密度在出生時(shí)是約3000個(gè)細(xì)胞/1mm2。一旦損傷，該細(xì)胞喪失再生的能力。在由于各種原因引起的角膜內(nèi)皮的功能性障礙所造成的內(nèi)皮角膜營(yíng)養(yǎng)不良和大皰角膜病中，角膜會(huì)發(fā)生水腫和變得不透明，并且該視力明顯下降。目前，大皰角膜病是通過(guò)其中角膜的上皮、主質(zhì)和內(nèi)皮的整個(gè)三層結(jié)構(gòu)被移植的穿透性角膜成形術(shù)來(lái)治療的。然而，角膜的捐獻(xiàn)在日本是不夠的，并且雖然有大約5500名的角膜移植術(shù)等待患者，但是每年在日本進(jìn)行約2700例角膜移植。
[0005]近年來(lái)，僅僅移植損傷組織的“部分移植”的想法已經(jīng)引起人們的注意以減少排異反應(yīng)和手術(shù)后并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，因此獲得更好的視覺(jué)功能。在角膜移植中，已經(jīng)進(jìn)行了僅僅移植角膜上皮的上皮移植，移植口腔粘膜而不是移植角膜上皮的已培養(yǎng)的口腔粘膜上皮移植，移植主質(zhì)組織的深層式板層角膜移植術(shù)等等。也考慮了僅僅移植角膜內(nèi)皮的方法。對(duì)于角膜內(nèi)皮的移植，由在膠原層培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮層組成的角膜內(nèi)皮狀片是已知的(參見(jiàn)專(zhuān)利文件I和2)。然而，至于角膜內(nèi)皮細(xì)胞，特別地從人衍生的那些，因?yàn)榻悄ぞ璜I(xiàn)者的數(shù)量是有限的并且離體培養(yǎng)是困難的，因此以移植所需的數(shù)量生產(chǎn)培養(yǎng)細(xì)胞需要花費(fèi)時(shí)間和成本。
[0006]人胚胎莖(ES)細(xì)胞顯示出高自復(fù)制性和多潛能性，并且從藥物應(yīng)用方面引起人們的注意。然而，它具有急劇減少的細(xì)胞數(shù)的實(shí)際問(wèn)題，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)步驟中分散細(xì)胞的手術(shù)容易引起細(xì)胞死亡。最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人ES細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生的細(xì)胞死亡是由Rho激酶(ROCK)的活化所引起，并且ROCK的抑制顯著地抑制細(xì)胞死亡，和報(bào)道說(shuō)，通過(guò)使用ROCK抑制劑如Y-27632等，人ES細(xì)胞的大量培養(yǎng)和腦細(xì)胞的產(chǎn)生能夠可行(非專(zhuān)利文件I)。
[0007]Rho激酶(ROCK)抑制劑已知具有各種作用。例如，專(zhuān)利文件3公開(kāi)了 Rho激酶抑制劑促進(jìn)角膜軸索形成并且Rho激酶抑制劑用作恢復(fù)角膜感知的藥劑。另外，專(zhuān)利文件4公開(kāi)了 Rho激酶抑制劑對(duì)于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有軸突長(zhǎng)出促進(jìn)作用，并且用于視覺(jué)功能紊亂的醫(yī)治。[0008]專(zhuān)利文件I JP-A-2004-24852
[0009]專(zhuān)利文件2 JP-A-2005-229869
[0010]專(zhuān)利文件3:W02005/118582
[0011]專(zhuān)利文件4:W02002/083175
[0012]非專(zhuān)利文獻(xiàn)I:Nat Biotechnol.2007，25，681

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明解決的問(wèn)題
[0014]本發(fā)明的目的是提供能夠有效地粘 附角膜內(nèi)皮細(xì)胞的方式和穩(wěn)定地供應(yīng)角膜內(nèi)皮制劑的方式。
[0015]解決問(wèn)題的手段
[0016]鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究并且發(fā)現(xiàn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)底物上的粘附能夠通過(guò)在Rho激酶抑制劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞而引人注目地得到促進(jìn)，這導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。因此，本發(fā)明提供下列這些。
[0017][I]促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的藥劑，它包括Rho激酶抑制劑。
[0018][2]上述[I]的藥劑，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡唳基氨基甲酰基)環(huán)己燒，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪(homopiperazine)和其可藥用鹽中的至少一種。
[0019][3]上述[I]的藥劑，其中該角膜內(nèi)皮細(xì)胞源自于人。
[0020][4]上述[I]到[3]中任何一項(xiàng)的藥劑，它是用于角膜內(nèi)皮功能紊亂的預(yù)防或治療的制劑。
[0021][5]上述[4]的藥劑,它是前房?jī)?nèi)(intracameral)注射或眼內(nèi)灌注流體的形式。
[0022][6]角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)，它包括Rho激酶抑制劑。
[0023][7]上述[6]的培養(yǎng)介質(zhì)，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)-反式_4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲酰基)環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0024][8]上述[6]的培養(yǎng)介質(zhì)，其中該角膜內(nèi)皮細(xì)胞源自于人。
[0025][9]角膜保存溶液，它包括Rho激酶抑制劑。
[0026][10]上述[9]的保存溶液，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0027][11]上述[9]的保存溶液，其中該角膜源自于人。
[0028][12]生產(chǎn)角膜內(nèi)皮制劑的方法，它包括使用上述[6]到[8]中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的步驟。
[0029][13]上述[12]的方法，其中角膜內(nèi)皮細(xì)胞源自于人。
[0030][14]Rho激酶抑制劑用于生產(chǎn)促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的藥劑的用途。
[0031][15]上述[14]的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲酰基)環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。[0032][16]上述[14]的用途，其中角膜內(nèi)皮細(xì)胞源自于人。
[0033][17]上述[14]到[16]中任何一項(xiàng)的用途，其中促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的藥劑是用于角膜內(nèi)皮功能紊亂的預(yù)防或治療的制劑。
[0034][18]上述[17]的用途，其中促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的藥劑是前房?jī)?nèi)注射或眼內(nèi)灌注流體的形式。
[0035][19]Rho激酶抑制劑用于生產(chǎn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)的用途。
[0036][20]上述[19]的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0037][21]上述[19]的用途，其中角膜內(nèi)皮細(xì)胞源自于人。
[0038][22]Rho激酶抑制劑用于生產(chǎn)角膜保存溶液的用途。
[0039][23]上述[22]的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式_4_(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0040][24]上述[22]的用途，其中角膜源自于人。
[0041][25]促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的方法，它包括讓有效量的Rho激酶抑制劑與需要促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的靶或角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行接觸。
[0042][26]上述[25]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式_4_(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0043][27]上述[25]的方法，其中角膜內(nèi)皮細(xì)胞源自于人。
[0044][28]上述[25]的方法，它為了防止或治療角膜內(nèi)皮功能紊亂。
[0045][29]上述[25]的方法，包括施用有效量的前房?jī)?nèi)注射或眼內(nèi)灌注流體形式的Rho激酶抑制劑。
[0046][30]培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的方法，它包括使用包括Rho激酶抑制劑的培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的步驟。
[0047][31]上述[30]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0048][32]上述[30]的方法，其中角膜內(nèi)皮細(xì)胞源自于人。
[0049][33]保護(hù)角膜的方法，它包括在包括Rho激酶抑制劑的角膜保護(hù)溶液中保留角膜移植物或角膜內(nèi)皮細(xì)胞的步驟。
[0050][34]上述[33]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式_4_(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲酰基)環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0051][35]上述[33]的方法，其中角膜源自于人。
[0052][36]生產(chǎn)角膜內(nèi)皮制劑的方法，它包括使用包括Rho激酶抑制劑的培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的步驟。
[0053][37]上述[36]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式_4_(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0054] [38]上述[36]的方法，其中角膜內(nèi)皮細(xì)胞源自于人。
[0055][39]治療大皰角膜病,角膜水腫或角膜白斑的方法,包括
[0056]使用包含Rho激酶抑制劑的培養(yǎng)介質(zhì)來(lái)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的步驟，和
[0057]將在上述培養(yǎng)步驟中獲得的角膜內(nèi)皮制劑移植到需要角膜內(nèi)皮移植的患者中的步驟。
[0058][40]上述[39]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式_4_(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0059][41]上述[39]的方法，其中角膜內(nèi)皮細(xì)胞源自于人。
[0060]本發(fā)明的效果
[0061]促進(jìn)本發(fā)明的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的藥劑含有Rho激酶抑制劑作為活性成分。促進(jìn)本發(fā)明的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的藥劑促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和使得形成具有良好細(xì)胞形態(tài)和高細(xì)胞密度的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層。因此，它可用作伴有角膜內(nèi)皮功能紊亂的疾病如大皰角膜病和角膜內(nèi)皮炎的治療劑或預(yù)防劑。本發(fā)明的促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的藥劑可用作在伴有角膜內(nèi)皮功能紊亂的疾病的治療或預(yù)防中保護(hù)角膜內(nèi)皮的藥劑。此外，本發(fā)明的促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的藥劑可用作在與眼內(nèi)手術(shù)如白內(nèi)障手術(shù)、玻璃體手術(shù)等等相關(guān)的角膜內(nèi)皮功能紊亂，由增大的眼內(nèi)壓引起的角膜內(nèi)皮功能紊亂(特別地青光眼侵襲)，或由接觸透鏡引起的不充足的氧氣所引起的角膜內(nèi)皮功能紊亂的治療或預(yù)防中保護(hù)角膜內(nèi)皮的藥劑。因?yàn)楸景l(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)或角膜保存溶液含有Rho激酶抑制劑，所以角膜內(nèi)皮細(xì)胞能夠很好地培養(yǎng)、維持或保存，并確保了角膜內(nèi)皮制劑的穩(wěn)定的供應(yīng)、維持或保存。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0062]圖1是兔子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)物的相差顯微照片(在培養(yǎng)起始后的24小時(shí)之后，放大倍數(shù):100倍)。
[0063]圖2是顯示了由MTS分析法測(cè)試的兔子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)物的生長(zhǎng)的圖，其中縱軸顯示在第一天相對(duì)于Rock抑制劑(-)組的吸收率的值。
[0064]圖3是顯示了在培養(yǎng)起始后的24小時(shí)之后兔子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)物的粘附的圖，其中該縱軸顯示了在培養(yǎng)起始后的24小時(shí)之后相對(duì)于Rock抑制劑(-)組的吸收率的值。
[0065]圖4是在培養(yǎng)起始后的第3天猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)物的相差顯微照片，其中放大倍數(shù)是100倍。
[0066]圖5是人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)物的相差顯微照片(第7天，放大倍數(shù):100倍)。
[0067]圖6顯示了猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)物的照片(A =ROCK抑制劑㈠，B =ROCK抑制劑(+)，放大倍數(shù):20倍)和圖(C)顯示培養(yǎng)的細(xì)胞的總面積。
[0068]圖7是顯示了猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)物的活細(xì)胞數(shù)的圖。
[0069]圖8是顯示Y-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)物的影響的圖。[0070]圖9是顯示了在猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)過(guò)程中Y-27632對(duì)于細(xì)胞形態(tài)的影響的相差顯微照片(放大倍數(shù):100倍)。
[0071]圖10是顯示了在猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)過(guò)程中Y-27632對(duì)于細(xì)胞形態(tài)的影響的相差顯微照片(毒傘素?zé)晒馊旧?，放大倍?shù):200倍)。
[0072]圖11是顯示了 Y-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響的顯微照片(抗_Ki67抗體染色，放大倍數(shù):200倍)。
[0073]圖12顯示了考察Y-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響的流式細(xì)胞光度術(shù)的結(jié)果。圖12A顯示ROCK抑制劑(-)組的傳代培養(yǎng)的第I天，B顯示ROCK抑制劑(-)組的傳代培養(yǎng)的第2天，C顯示ROCK抑制劑⑴組的傳代培養(yǎng)的第I天，和D顯示ROCK抑制劑⑴組的傳代培養(yǎng)的第2天。
[0074]圖13是通過(guò)抗_Ki67抗體陽(yáng)性細(xì)胞比率顯示了圖12的流式細(xì)胞光度術(shù)的結(jié)果的圖。[0075]圖14是顯示Y-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡的影響的圖。
[0076]圖15是由死細(xì)胞的數(shù)量顯示Y-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡的影響的圖。
[0077]圖16是顯示Y-27632對(duì)于培養(yǎng)的猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的密度的影響的圖。
[0078]圖17是顯示了在傳代培養(yǎng)后的24小時(shí)之后所培養(yǎng)的猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的圖，其中該縱軸顯示了在傳代培養(yǎng)起始后的24小時(shí)之后相對(duì)于對(duì)照組的熒光度而言的fasudil組的值。
【具體實(shí)施方式】
[0079]本發(fā)明的促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的藥劑(以下有時(shí)簡(jiǎn)寫(xiě)為“本發(fā)明的粘附促進(jìn)劑”)含有Rho激酶抑制劑作為活性成分。
[0080]在本發(fā)明中，Rho激酶指與Rho的活化一起活化的絲氨酸/蘇氨酸激酶。例子包括 ROKa (R0CKI1:Leung，T.et al.，J.Biol.Chem.，270，29051-29054，1995)，pl60R0CK(R0KP，ROCK-1:1shizaki，Τ.et al.,The EMBO J.，15 (8)，1885-1893，1996)和具
有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的其它蛋白質(zhì)。
[0081]在本發(fā)明中，一種類(lèi)型的Rho激酶抑制劑可以單獨(dú)被含有，或幾種類(lèi)型可以根據(jù)需要而相結(jié)合被含有。
[0082]Rho激酶抑制劑的例子包括公開(kāi)在下面文獻(xiàn)中的化合物:
[0083]US4678783, Patent34212 17，W099/20620, W099/61403, W002/076976,W002/076977, W002/100833, W003/059913, W003/062227, W02004/009555, W02004/022541,W02004/108724, W02005/003101, W02005/039564, W02005/034866, W02005/037197,W02005/037198, W02005/035501, W02005/035503, W02005/035506, W02005/080394,W02005/103050,W02006/057270,ff02007/026664等等。此類(lèi)化合物能夠根據(jù)在所公開(kāi)的每一篇文獻(xiàn)中描述的方法來(lái)生產(chǎn)。特定的例子包括1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪(fasudil)，(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷(Y-27632)等等。作為這些化合物，可優(yōu)選使用商購(gòu)的產(chǎn)品。
[0084]這些當(dāng)中，(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪和其可藥用鹽是優(yōu)選使用的，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮悄?nèi)皮細(xì)胞的粘附的促進(jìn)上是特別優(yōu)異的。作為化合物的鹽，藥物學(xué)上可接受的酸加合鹽是優(yōu)選的。該酸的例子包括無(wú)機(jī)酸，如鹽酸，氫溴酸，硫酸等等，有機(jī)酸，如甲磺酸，富馬酸，馬來(lái)酸，苦杏仁酸，檸檬酸，酒石酸，水楊酸等等。更優(yōu)選的是(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷2鹽酸鹽和1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪鹽酸鹽。
[0085]在本發(fā)明中，“角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的促進(jìn)”的例子包括在角膜內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附的促進(jìn)和角膜內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)底物的粘附的促進(jìn)兩者。
[0086]本發(fā)明的粘附促進(jìn)劑提供對(duì)于從哺乳動(dòng)物(例如，人，小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，兔子，貓，狗，牛，綿羊，猴子等等)的角膜組織中所分離的角膜內(nèi)皮細(xì)胞或?qū)τ趶钠浞蛛x的并且傳代(passaged)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附促進(jìn)作用。因?yàn)楸景l(fā)明的粘附促進(jìn)劑在來(lái)源于人的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附促進(jìn)作用上是優(yōu)異的，來(lái)源于人的角膜內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為特別難以培養(yǎng)和傳代(passage),人來(lái)源的角膜內(nèi)皮細(xì)胞是優(yōu)選的革巴。 [0087]角膜內(nèi)皮細(xì)胞在維持角膜的透明度上起著作用。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞的密度在某個(gè)范圍下降時(shí)，該角膜產(chǎn)生溶脹并且變得無(wú)法維持透明度，據(jù)此產(chǎn)生了角膜內(nèi)皮功能紊亂。本發(fā)明的粘附促進(jìn)劑促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，使得具有良好細(xì)胞形態(tài)和高細(xì)胞密度的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層能夠形成，并且進(jìn)一步顯示出對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡抑制作用。因此，它可用作伴有角膜內(nèi)皮功能紊亂的疾病如大皰角膜病和角膜內(nèi)皮炎的治療劑或預(yù)防劑。另外，本發(fā)明的粘附促進(jìn)劑可用作與眼內(nèi)手術(shù)如白內(nèi)障手術(shù)、玻璃體手術(shù)等等相關(guān)的角膜內(nèi)皮功能紊亂，由增大的眼內(nèi)壓引起的角膜內(nèi)皮功能紊亂(特別地青光眼侵襲)，或由因?yàn)榻佑|透鏡導(dǎo)致的不充足的氧氣所引起的角膜內(nèi)皮功能紊亂的治療劑或預(yù)防劑。
[0088]盡管本發(fā)明的粘附促進(jìn)劑沒(méi)有特別限制，只要它具有適合于局部給藥于眼睛的劑型就行，但是它優(yōu)選以前房?jī)?nèi)注射或眼內(nèi)灌注流體形式配制。它們能夠通過(guò)在本領(lǐng)域中廣泛使用的普通方法來(lái)制備。當(dāng)它以前房?jī)?nèi)注射或眼內(nèi)灌注流體形式被局部施用于眼睛時(shí)，Rho激酶抑制劑和角膜內(nèi)皮細(xì)胞在身體內(nèi)接觸，并且促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。
[0089]例如，當(dāng)本發(fā)明的粘附促進(jìn)劑用作前房?jī)?nèi)注射或眼內(nèi)灌注流體時(shí)，穩(wěn)定劑(例如，亞硫酸氫鈉，硫代硫酸鈉，依地酸鈉，檸檬酸鈉，抗壞血酸，二丁基羥基苯等等)，增溶劑(例如，甘油，丙二醇，聚乙二醇，聚氧化乙烯氫化蓖麻油等等)，懸浮劑(例如，聚乙烯基吡咯烷酮，羥丙基甲基纖維素，羥甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉等等)，乳化劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮，大豆磷脂，蛋黃卵磷脂，聚氧化乙烯氫化蓖麻油，聚山梨酸酯80等等)，緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖劑，乙酸鹽緩沖劑，硼酸鹽緩沖劑，碳酸鹽緩沖劑，檸檬酸鹽緩沖劑，三羥甲基氨基甲烷緩沖液，谷氨酸，ε-氨基己酸等等)，增稠劑(例如，水溶性纖維素衍生物比如甲基纖維素，羥乙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素等等，硫酸軟骨素鈉，透明質(zhì)酸鈉，聚羧乙烯，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇等等)，防腐劑(例如，苯扎氯銨，氯化芐乙氧銨，雙氯苯雙胍己烷葡糖酸鹽，氯丁醇，芐醇，脫氫醋酸鈉，對(duì)-羥基苯甲酸酯，依地酸鈉，硼酸等等)，等滲劑(例如，氯化鈉，氯化鉀，甘油，甘露糖醇，山梨糖醇，硼酸，葡萄糖，丙二醇等等)，pH調(diào)節(jié)劑(例如，鹽酸，氫氧化鈉，磷酸，乙酸等等)，清涼劑(例如，L-薄荷醇，d-莰酮，d-2-莰醇，薄荷油等等)等等能夠作為添加劑添加進(jìn)去。這些添加劑的添加量取決于添加劑的種類(lèi)和用途以及其它因素來(lái)改變，并且以能夠?qū)崿F(xiàn)添加劑的目的的濃度添加。
[0090]活性成分在本發(fā)明的粘附促進(jìn)劑中的量通常是0.00001-lw/v %，優(yōu)選0.00001-0.lw/v %，更優(yōu)選0.000 l-0.0 lw/v %。盡管劑量和給藥頻率將取決于癥狀，年齡，體重和給藥形式而變化，但是，當(dāng)它用作成年人的前房?jī)?nèi)注射劑時(shí)，例如，含有
0.0001-0.lw/v %、優(yōu)選0.0001-0.01w/v%的活性成分的制劑通常能夠通過(guò)0.01-0.1mL/每次給藥的方式每天給藥幾次，優(yōu)選1-2次，更優(yōu)選I次。
[0091]當(dāng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞在試管中培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明的粘附促進(jìn)劑也能夠被添加到培養(yǎng)介質(zhì)中。當(dāng)通過(guò)向培養(yǎng)介質(zhì)中添加Rho激酶抑制劑來(lái)繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，Rho激酶抑制劑和角膜內(nèi)皮細(xì)胞在活體外接觸，并促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。
[0092]本發(fā)明提供角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)，該介質(zhì)含有Rho激酶抑制劑。在本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)中所含的Rho激酶抑制劑是如上所述。
[0093]本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)能夠含有一般用于內(nèi)皮細(xì)胞(例如，DMEM(GIBC0 BRL)，血清(例如，胎牛血清(FBS))，生長(zhǎng)因子(例如，b-FGF)，抗生素(例如，青霉素，鏈霉素)等等的培養(yǎng)的介質(zhì)。
[0094]在本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)中Rho激酶抑制劑的濃度通常是1-100 μ Μ，優(yōu)選5-20 μ Μ，更優(yōu)選10 μ Mo
[0095]本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)通過(guò)增大角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附來(lái)防止細(xì)胞的脫落，并且使得形成具有良好細(xì)胞形態(tài)和高細(xì)胞密度的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層。因此，它能夠優(yōu)選用于本發(fā)明的角膜內(nèi)皮制劑的下 述生產(chǎn)方法中。另外，本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)也用于維持角膜內(nèi)皮細(xì)胞。
[0096]本發(fā)明提供含有Rho激酶抑制劑的角膜保存溶液。在本發(fā)明的角膜保存溶液中所含的Rho激酶抑制劑是如上所述。角膜保存溶液是用于保存從捐獻(xiàn)者所分離的角膜移植物直至移植給接受者為止的液體。
[0097]本發(fā)明的角膜保存溶液的例子包括通常用于角膜移植術(shù)的保存溶液(角膜鞏膜的外植體保存溶液(Optisol GS:注冊(cè)商標(biāo))，角膜移植術(shù)的眼球的保存溶液(EPI1:注冊(cè)商標(biāo)))，鹽水，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)等等，它們中的每一種含有Rho激酶抑制劑。
[0098]在本發(fā)明的角膜保存溶液中Rho激酶抑制劑的濃度通常是l-100μΜ，優(yōu)選5-20 μ Μ,更優(yōu)選 10 μ Mo
[0099]本發(fā)明的角膜保存溶液通過(guò)增大角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附來(lái)防止細(xì)胞的脫落，并且使得形成具有良好細(xì)胞形態(tài)和高細(xì)胞密度的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層。因此，它能夠用作用于器官移植等等的角膜保存溶液。另外，本發(fā)明的保存溶液也用作角膜內(nèi)皮細(xì)胞的低溫保藏的保存溶液。為了低溫保藏，甘油，二甲亞砜，丙二醇，乙酰胺等等可以進(jìn)一步被添加加到本發(fā)明的保存溶液中。
[0100]本發(fā)明提供生產(chǎn)角膜內(nèi)皮制劑的方法，它包括使用本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的步驟。
[0101]該角膜內(nèi)皮制劑特征性地含有底物和在底物上的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層，該層已經(jīng)在試
管中培養(yǎng)。
[0102]在本發(fā)明中，底物沒(méi)有特別限制，只要它能夠承載所培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層并且能夠在移植之后在體內(nèi)維持它的形狀至少3天。另外，當(dāng)在試管中培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)底物可具有支架(scaffold)的作用，或在培養(yǎng)之后可僅僅起著承載角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的作用。優(yōu)選地，底物用于培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞，并且作為支架，在培養(yǎng)完成之后直接用于移植。
[0103]上述底物的例子包括從天然物質(zhì)如膠原、明膠、纖維素等等衍生的聚合物材料，合成聚合物材料如聚苯乙烯，聚酯，聚碳酸酯，聚(N-異丙基丙烯酰胺)等等，可生物降解的聚合物材料如聚乳酸，聚乙醇酸等等，氫氧磷灰石，羊膜等等。
[0104]盡管上述底物的形狀沒(méi)有特別限制，只要它支持角膜內(nèi)皮細(xì)胞層并且適合于移植就行，但是它優(yōu)選是片。，當(dāng)本發(fā)明的制劑是片時(shí)，它能夠在移植過(guò)程中被切成適合于應(yīng)用位點(diǎn)的尺寸之后使用。還有可能將小片卷起，然后將它從傷口的口緣插入。優(yōu)選的特定例子包括覆蓋病變角膜內(nèi)皮區(qū)域的約80%的圓形。也優(yōu)選的是在上述圓的鄰近部分中形成狹縫，這樣它能夠緊密地粘附于應(yīng)用位點(diǎn)。
[0105]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述底物是膠原。作為膠原，可優(yōu)選使用描述在JP-A-2004-24852中的膠原片。該膠原片能夠根據(jù)描述在上述JP-A-2004-24852中的方法從例如羊膜制備。
[0106]上述角膜內(nèi)皮細(xì)胞層優(yōu)選顯示出下列特性中的至少一種。更優(yōu)選，它顯示出下列特性中的兩種或多種，更優(yōu)選全部。
[0107](I)該細(xì)胞層具有單個(gè)層狀結(jié)構(gòu)。這是在身體內(nèi)角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的諸多特性中的一種。
[0108](2)該細(xì)胞層具有約1，000-約4，000個(gè)細(xì)胞/mm2的細(xì)胞密度。特別地，當(dāng)成年人是接受者(移植接受者)時(shí)，它優(yōu)選是約2，000-約3，000個(gè)細(xì)胞/mm2。
[0109](3)構(gòu)成細(xì)胞層的細(xì)胞具有基本上六邊形的平面圖。這是構(gòu)成在身體內(nèi)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的細(xì)胞的諸多特性中的一種。本發(fā)明的制劑類(lèi)似于在身體內(nèi)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層，顯示出與先天的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的功能類(lèi)似的功能，并且也能夠顯示出活體內(nèi)增殖能力。
[0110](4)細(xì)胞在細(xì)胞層中規(guī)則地排列。在身體內(nèi)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層中，構(gòu)成該層的細(xì)胞規(guī)則排列，鑒于此原因，角膜內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為維持正常功能和高透明度并且該角膜被認(rèn)為適當(dāng)?shù)仫@示出水控制功能。因此，具有該形態(tài)特征的本發(fā)明制劑預(yù)計(jì)顯示出與在身體內(nèi)角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的功能類(lèi)似的功能。
[0111]本發(fā)明的生產(chǎn)方法包括使用本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的步驟并且例如能夠通過(guò)下列方法來(lái)進(jìn)行。
[0112]〈1>角膜內(nèi)皮細(xì)胞的采集和在試管中的培養(yǎng)
[0113]角膜內(nèi)皮細(xì)胞是通過(guò)普通方法從接受者他自己/她自己或合適捐獻(xiàn)者的角膜中采集的?？紤]到在本發(fā)明中的移植條件，可以制備外源的角膜內(nèi)皮細(xì)胞。例如，Descemet膜和角膜組織的內(nèi)皮細(xì)胞層是從角膜基質(zhì)上剝離，放入到培養(yǎng)皿中，然后用中性蛋白酶(dispase)等等處理。通過(guò)這一方法,從Descemet膜上分出角膜內(nèi)皮細(xì)胞。保留在Descemet膜上的角膜內(nèi)皮細(xì)胞能夠通過(guò)移液管移取和類(lèi)似方式被取出。在Descemet膜的取出后，角膜內(nèi)皮細(xì)胞在本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。培養(yǎng)介質(zhì)能夠例如通過(guò)適當(dāng)?shù)靥砑覨BS(胎牛血清)，b-FGF (basic-fibloblast生長(zhǎng)因子)，和抗生素如青霉素、鏈霉素和類(lèi)似物到商購(gòu)DMEM (Dulbecco，s Modified Eagle’s Medium)中，和進(jìn)一步添加 Y-27632 或 fasudil 到其中而獲得。優(yōu)選使用在表面上具有I型膠原，IV型膠原，粘連蛋白，層粘連蛋白或牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)等等的涂層的培養(yǎng)容器(培養(yǎng)皿)?；蛘?，可以使用用商購(gòu)?fù)繉觿┤鏔NC涂覆混合物(注冊(cè)商標(biāo))等等處理的一般培養(yǎng)容器。通過(guò)該涂層和本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)的結(jié)合使用，促進(jìn)了角膜內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)容器的表面上的粘附，并且實(shí)現(xiàn)了良好生長(zhǎng)。
[0114]盡管角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)的溫度條件沒(méi)有特別限制，只要角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)就行，但是考慮到生長(zhǎng)效率，例如，溫度是約25-約45°C，優(yōu)選約30-約40°C，和進(jìn)一步優(yōu)選是約37°C。該培養(yǎng)是在約5-10% CO2濃度的環(huán)境中在濕潤(rùn)條件下在普通細(xì)胞培養(yǎng)器中進(jìn)行。
[0115]〈2>傳代培養(yǎng)
[0116]傳代培養(yǎng)能夠在經(jīng)受培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)之后進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到亞融合或融合時(shí)優(yōu)選進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)能夠如下進(jìn)行。該細(xì)胞能夠通過(guò)用胰蛋白酶-EDTA等處理從培養(yǎng)容器的表面上分離，并且回收。本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)被添加到回收的細(xì)胞中得到細(xì)胞懸液。在細(xì)胞的回收過(guò)程中或在回收之后優(yōu)選進(jìn)行離心處理。該離心處理獲得具有高細(xì)胞密度的細(xì)胞懸液。優(yōu)選的細(xì)胞密度是大約1-2 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL。作為這里的離心處理的條件，例如能夠提及500rpm(30g)-1OOOrpm(70g), 1-10分鐘。
[0117]按照與在上述初始培養(yǎng)中相同的方式將細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)容器上，然后培養(yǎng)。盡管在傳代過(guò)程中的稀釋比率取決于細(xì)胞的條件，但是它是大約1: 2-1: 4，優(yōu)選約I: 3。該傳代培養(yǎng)能夠在與上述初始培養(yǎng)的培養(yǎng)條件類(lèi)似的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。盡管培養(yǎng)時(shí)間取決于所使用的細(xì)胞的條件來(lái)改變，但是它例如是7-30天。以上傳代培養(yǎng)能夠根據(jù)需要進(jìn)行多次。通過(guò)使用本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)，在培養(yǎng)的最初階段中細(xì)胞粘附會(huì)增大，據(jù)此培養(yǎng)時(shí)間能夠縮短。
[0118]〈3>角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的制備
[0119]細(xì)胞懸液被接種在底物如膠原片等等上，然后培養(yǎng)。這里，接種細(xì)胞的數(shù)量被控制，使得最終生產(chǎn)的角膜內(nèi)皮制劑具有具備所需細(xì)胞密度的細(xì)胞層。確切地說(shuō)，接種細(xì)胞，使得形成具有約1，000-約4，000個(gè)細(xì)胞/mm2的細(xì)胞密度的細(xì)胞層。培養(yǎng)能夠在與上述初始培養(yǎng)的那些條件類(lèi)似的條件和其它類(lèi)似條件下進(jìn)行 。盡管培養(yǎng)時(shí)間取決于所使用的細(xì)胞的條件來(lái)改變，但是它例如是3-30天。
[0120]通過(guò)按照上述方式進(jìn)行培養(yǎng)，能夠獲得其中在底物上已形成了在試管中所培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的角膜內(nèi)皮制劑。
[0121]在本發(fā)明中，該角膜內(nèi)皮制劑可以含有本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)以維持角膜內(nèi)皮細(xì)胞。另外，該角膜內(nèi)皮制劑可以含有本發(fā)明的角膜保存溶液，直至它用于移植為止。本發(fā)明也提供本發(fā)明的角膜內(nèi)皮制劑和培養(yǎng)介質(zhì)或保存溶液的結(jié)合物。
[0122]由本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的角膜內(nèi)皮制劑能夠用作需要角膜內(nèi)皮的移植的疾病的治療用移植物，所述疾病例如是大皰角膜病，角膜水腫，角膜白斑，特別地，由于角膜營(yíng)養(yǎng)不良、創(chuàng)傷或眼內(nèi)手術(shù)導(dǎo)致的角膜內(nèi)皮功能紊亂所引起的大皰角膜病。
[0123]本發(fā)明的粘附促進(jìn)劑和角膜內(nèi)皮制劑的給藥患者包括，例如哺乳動(dòng)物(例如，人，小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，兔，貓，狗，牛，綿羊，猴子等等)。
[0124]實(shí)施例
[0125]本發(fā)明在下面參見(jiàn)實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地進(jìn)行解釋?zhuān)@些實(shí)施例不認(rèn)為是限制性的。根據(jù) the International Guiding Principles for Biomedical Research InvolvingAnimals 以及 Act on welfare and management of animals 和與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)、持有等相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。根據(jù)the Association for Research in Vision andOphthalmology 針對(duì) the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research 的指南來(lái)進(jìn)行這一實(shí)驗(yàn)。
[0126]實(shí)施例1[0127] ROCK抑制劑對(duì)于兔子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)的影響的研究
[0128]從安樂(lè)死之后立即分離出的兔角膜組織上分離出粘附有角膜內(nèi)皮細(xì)胞的Descemet 膜。Descemet 膜與中性蛋白酶 II (1.2U/ml, Roche Applied Science) 一起在37°C，5% CO2的條件下培養(yǎng)45分鐘，然后通過(guò)移液管移取手術(shù)以機(jī)械方式分離出角膜內(nèi)皮細(xì)胞。分離的角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行離心處理，ROCK抑制劑(+)組的細(xì)胞在添加有￥-27632(10 μ M)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中進(jìn)行攪拌以及ROCK抑制劑(-)組的細(xì)胞在沒(méi)有添加Υ-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中進(jìn)行攪拌，達(dá)到相同的濃度，并且這些細(xì)胞是以約2000個(gè)細(xì)胞/孔的密度被接種在96孔板上。作為用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)，使用添加有1%胎牛血清和 2mg/ml bFGF (Gibco Invitrogen)的培養(yǎng)介質(zhì)(DMEM, Gibco Invitrogen)。該板用FNC涂覆混合物(Athena ES)預(yù)處理10分鐘。在從培養(yǎng)起始后的72小時(shí)，該培養(yǎng)介質(zhì)被交換并且在72小時(shí)后，ROCK抑制劑(+)組和ROCK抑制劑(-)組都在不含Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的常規(guī)介質(zhì)中培養(yǎng)，直到第5天為止。在培養(yǎng)起始后的24小時(shí)之后，兔子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)物的相差顯微照片示于圖1中。從培養(yǎng)起始之后的第I天到第3天,這些細(xì)胞是每24小時(shí)通過(guò)使用CellTiter96 (注冊(cè)商標(biāo))AQueous One SolutionCell Proliferation (Promega)由 MTS ([3- (4, 5- 二甲基喔唑-2-基)~5~ (3~ 竣基甲氧基苯
基)-2- (4-磺基苯基)-2H-四唑錫])分析法來(lái)計(jì)數(shù)(圖2)。
[0129]在ROCK里抑制劑⑴組中(圖1B)，在細(xì)胞接種之后在24小時(shí)(I天)中的細(xì)胞粘附顯著地增加到ROCK抑制劑㈠組(圖1A)的約2.8倍(圖2和3)。在第3天當(dāng)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)融合時(shí)，在兩個(gè)組之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖2)。從它可以清楚地看出，在兔子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)物中傳代之后Y-27632具有在早期階段增大細(xì)胞粘附的作用。另外，在使用兔子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的研究中也獲得類(lèi)似的結(jié)果，因此，Y-27632被認(rèn)為對(duì)于在原始培養(yǎng)物和傳代培養(yǎng)中傳代之后的早期細(xì)胞粘附起作用。
[0130]實(shí)施例2
[0131]Y-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)的影響的研究
[0132]從為了其它目的被安樂(lè)死的獼猴(Macaca fascicularis)解離的角膜組織中分離出粘附有角膜內(nèi)皮細(xì)胞的Descemet膜。對(duì)于ROCK抑制劑(+)組，Descemet膜放入到添加了 Υ-27632(10μΜ)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中并在37°C，5% CO2的條件下培養(yǎng)10分鐘。對(duì)于ROCK抑制劑(-)組，該膜被放入到?jīng)]有添加Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中并且在相同的條件下培養(yǎng)10分鐘。作為用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)，使用與實(shí)施例1中相同的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。在培養(yǎng)之后獲得的Descemet膜與中性蛋白酶(Dispase) II (1.2U/ml, Roche AppliedScience) 一起在37°C，5% CO2的條件下培養(yǎng)45分鐘，然后通過(guò)移液管移取手術(shù)以機(jī)械方式分離出角膜內(nèi)皮細(xì)胞。分離的角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行離心處理并在Υ_27632(+)和Y-27632 (-)達(dá)到相同濃度的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中攪拌，然后這些細(xì)胞以約20000個(gè)細(xì)胞/孔的密度被接種在12孔板上。該板用FNC涂覆混合物(Athena ES)預(yù)處理10分鐘。在從培養(yǎng)起始后的72小時(shí)，該培養(yǎng)介質(zhì)被交換并且在72小時(shí)后，ROCK抑制劑⑴組和ROCK抑制劑(-)組都在不含Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的常規(guī)介質(zhì)中培養(yǎng)。
[0133]從圖4,在從培養(yǎng)起始后的24小時(shí)之后在稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)物中，顯然更多的細(xì)胞粘附于在ROCK抑制劑(+)中的板上(圖4b)，這是指與ROCK抑制劑(-)相比而言(圖4A)。在達(dá)到融合之前的天數(shù)對(duì)于ROCK抑制劑(+)是3，而對(duì)于ROCK抑制劑(-)是7。從其中可以表明，在培養(yǎng)起始之后的早期階段中Y-27632增加細(xì)胞粘附并且是有用的藥物，該藥物甚至在認(rèn)為與兔子相比體外培養(yǎng)比較困難的猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞中能夠進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
[0134]實(shí)施例3
[0135]Y-27632對(duì)于人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)的影響的研究
[0136]在從US眼庫(kù)獲得的人角膜組織中，中心部分(直徑7_)已經(jīng)用于角膜移植術(shù)和使用剩下的外圍角膜組織。分離已粘附有角膜內(nèi)皮細(xì)胞的Descemet膜。對(duì)于ROCK抑制劑(+)組，Descemet膜被放入到添加了 Υ_27632(10μΜ)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中并且在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)10分鐘。對(duì)于ROCK抑制劑(-)組，該膜被放入到?jīng)]有添加Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中并且在相同的條件下培養(yǎng)10分鐘。作為用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)，使用與實(shí)施例1中相同的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。在培養(yǎng)之后的Descemet膜與中性蛋白酶(Dispase) II (1.2U/ml, Roche Applied Science) 一起在 37°C, 5% CO2 的條件下培養(yǎng) 45 分鐘，然后通過(guò)移液管移取手術(shù)以機(jī)械方式分離出角膜內(nèi)皮細(xì)胞。分離的角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行離心處理并在Y-27632(+)和Υ-27632(_)達(dá)到相同濃度的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中攪拌，然后這些細(xì)胞以約10000個(gè)細(xì)胞/孔的密度被接種在已用FNC涂覆混合物(Athena ES)預(yù)處理的48孔板上。從外圍角膜組織獲得的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量是極其少的，因此，一只眼睛的捐獻(xiàn)者角膜在一個(gè)孔中培養(yǎng)。用于該研究的捐獻(xiàn)者角膜是:對(duì)于ROCK抑制劑(+)組，在捐獻(xiàn)者(年齡69歲)的死亡之后的6天開(kāi)始培養(yǎng)，和對(duì)于ROCK抑制劑(-)組，在捐獻(xiàn)者(年齡51歲)死亡之后的7天開(kāi)始培養(yǎng)。對(duì)于年齡和從捐獻(xiàn)者的死亡到細(xì)胞培養(yǎng)所消逝的時(shí)間的影響被認(rèn)為是幾乎相同的。[0137]在從培養(yǎng)起始后的72小時(shí)，該培養(yǎng)介質(zhì)被交換，并且在72小時(shí)后，ROCK抑制劑(+)組和ROCK抑制劑㈠組都在不含Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的常規(guī)介質(zhì)中培養(yǎng)。為了研究對(duì)于在培養(yǎng)起始后的早期階段中的細(xì)胞粘附以及細(xì)胞形態(tài)的影響，用相差顯微鏡觀察細(xì)胞并且在培養(yǎng)起始后用數(shù)字式照象機(jī)拍取照片(圖5)。
[0138]從圖5中，在培養(yǎng)起始后的第7天，由與正常角膜內(nèi)皮細(xì)胞類(lèi)似的細(xì)胞(均勻的多角形細(xì)胞)組成的融合和高度致密的單個(gè)細(xì)胞層是在ROCK抑制劑(+)組中形成的(圖5B)，而具有低密度的成纖維細(xì)胞狀長(zhǎng)條形內(nèi)皮細(xì)胞僅僅在ROCK里抑制劑(-)組中以小島形狀存活(圖5A)。從這些結(jié)果可以認(rèn)為，在已知極其難以培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮的原始培養(yǎng)中，具有在培養(yǎng)起始后的早期階段中增大細(xì)胞粘附的作用的Y-27632在培養(yǎng)介質(zhì)中的添加能夠?qū)崿F(xiàn)具有良好細(xì)胞形態(tài)和高細(xì)胞密度的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的形成。
[0139]配方實(shí)施例1
[0140]含有Rho激酶抑制劑的前房?jī)?nèi)注射劑
[0141]根據(jù)常規(guī)方法制備下列前房?jī)?nèi)注射劑。
[0142]Y-2763210 m§ 轉(zhuǎn)酸二氫鈉(Ug 氯化鈉0.9 g 氫氧化鈉適量 滅菌凈化水適量 總量IOOmL (pH 7)
[0143]使用由Wako Pure Chemical Industries, Ltd 制造的 Y-27632。
[0144]配方實(shí)施例2
[0145]含有Rho激酶抑制劑的眼內(nèi)灌注流體
[0146]根據(jù)常規(guī)方法制備下列眼內(nèi)灌注流體。
[0147]Y-276321.0mg
[0148]OPEGUARD MA適量
[0149]總量IOOmL
[0150]使用由Senju Pharmaceutical C0., Ltd.制造的 OPEGUARD MA 和由 Wako PureChemical Industries, Ltd 制造的 Y-27632。
[0151]配方實(shí)施例3
[0152]角膜內(nèi)皮片的制備用的含Rho激酶抑制劑的培養(yǎng)介質(zhì)
[0153]根據(jù)常規(guī)方法制備下列培養(yǎng)介質(zhì)。
[0154]
Υ-276320.5 mg
FBS10 mL
青霉素-鏈霉素溶液I mL
FGF basic200 Hg DMEM適量
總量】00 raL
[0155]使用由Invitrogen制造的FBS,由Nacalai Tesque制造的青霉素_鏈霉素溶液(含有青霉素 5000u/mL 和鏈霉素 5000 μ g/mL),由 Invitrogen 制造的 FGF basic,由 WakoPure Chemical Industries, Ltd.制造的 Y-27632,和由 Invitrogen 制造的 DMEM。
[0156]配方實(shí)施例4
[0157]含有Rho激酶抑制劑的角膜保存溶液
[0158]根據(jù)常規(guī)方法制備下列保存溶液。
[0159]Y-276320.2mg
[0160]Optisol-GS適量
[0161]總量IOOmL
[0162]使用由Bausch&Lomb, Inc.制造的 Optisol-GS,和由 Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd 制造的 Y-27632。[0163]實(shí)施例4
[0164]Y-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)的影響的研究
[0165]從安樂(lè)死的稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)解離的角膜組織中分離出粘附有角膜內(nèi)皮細(xì)胞的Descemet膜。按照與實(shí)施例2同樣的方式，對(duì)于ROCK抑制劑(+)組，Descemet膜被放入到添加了 Υ_27632(10μΜ)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中并且在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)10分鐘。對(duì)于ROCK抑制劑(-)組，該膜被放入到?jīng)]有添加Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中并且在相同的條件下培養(yǎng)10分鐘。作為用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)，使用與實(shí)施例1中相同的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。在培養(yǎng)之后的Descemet膜與中性蛋白酶(Dispase) II (1.2U/ml,Roche Applied Science) 一起在37°C, 5% CO2的條件下培養(yǎng)45分鐘,然后通過(guò)移液管移取手術(shù)以機(jī)械方式分離出角膜內(nèi)皮細(xì)胞。分離的角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行離心處理并在Υ_27632(+)和Y-27632 (-)達(dá)到相同濃度的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中攪拌，然后這些細(xì)胞以約2000個(gè)細(xì)胞/孔的密度被接種在96孔板上。在從培養(yǎng)起始后的72小時(shí)，該培養(yǎng)介質(zhì)被交換并且在72小時(shí)后，ROCK抑制劑⑴組和ROCK抑制劑㈠組都在不含Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的常規(guī)介質(zhì)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第10天，這些細(xì)胞用4%仲甲醛在室溫下固定10分鐘，然后用甲苯胺藍(lán)染色(圖6A和6B)。細(xì)胞的總面積通過(guò)使用Image J (National Institutes ofHealth)測(cè)量和分析(圖6C)。
[0166]在培養(yǎng)起始后的第10 天的稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原始培養(yǎng)物中，通過(guò)促進(jìn)在培養(yǎng)的早期階段中的粘附，ROCK抑制劑(+)(圖6B)顯著地使培養(yǎng)的細(xì)胞的總面積增大到相當(dāng)于ROCK抑制劑㈠(圖6A)的約1.6倍(圖6C)。從它可以表明Y-27632甚至在認(rèn)為體外培養(yǎng)很困難的猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞中是可用于原始培養(yǎng)的藥物。
[0167]實(shí)施例5
[0168]對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞而言的Y-27632的最佳濃度的研究
[0169]將按照與實(shí)施例2中相同的方式采集的猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞(原始培養(yǎng)物)加入到各自以1、10、33和IOOyM添加Υ-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中，和加入到?jīng)]有添加Υ-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中，并且攪拌到相同的濃度，然后這些細(xì)胞以約2000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板上。在培養(yǎng)起始后的24小時(shí)，活細(xì)胞通過(guò)使用CellTiter-Glo (注冊(cè)商標(biāo)，Promega)(圖 7)來(lái)計(jì)數(shù)。
[0170]當(dāng)在培養(yǎng)起始后的第24小時(shí)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞在含有10 μ M Y-27632的介質(zhì)中培養(yǎng)時(shí)，粘附于板上的細(xì)胞的數(shù)量是顯著高的(圖7)，這是指與在沒(méi)有添加Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中以及含有不同濃度的Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中的細(xì)胞培養(yǎng)相比而言。從其中表明，在10 μ M的濃度下Υ-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞是最有效的。
[0171]實(shí)施例6
[0172]Υ-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的影響的研究
[0173]從安樂(lè)死的稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)解離的角膜組織中分離出粘附有角膜內(nèi)皮細(xì)胞的 Descemet 膜。Descemet 膜與中性蛋白酶 II (1.2U/ml, Roche Applied Science)一起在37°C，5% CO2的條件下培養(yǎng)45分鐘，然后通過(guò)移液管移取手術(shù)以機(jī)械方式分離出角膜內(nèi)皮細(xì)胞。分離的角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行離心處理，然后接種在用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)上。實(shí)現(xiàn)融合的角膜內(nèi)皮細(xì)胞在37°C，5% CO2的條件下用0.05%胰蛋白酶培養(yǎng)10分鐘，然后傳代培養(yǎng)。在4到6代后，該角膜內(nèi)皮細(xì)胞被加入到96孔板上達(dá)到1/2，1/6或1/8的稀釋t匕。對(duì)于ROCK抑制劑(+)組通過(guò)使用添加了 Y-27632 (10 μ Μ)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)和對(duì)于ROCK抑制劑(-)組通過(guò)使用沒(méi)有添加Υ-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)來(lái)繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在傳代后的24小時(shí),按照與實(shí)施例5中同樣的方式通過(guò)使用CellTiter-Glo (注冊(cè)商標(biāo),Promega)(圖8)來(lái)計(jì)數(shù)。
[0174]當(dāng)在傳代后的第24小時(shí)的已培養(yǎng)的稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)角膜內(nèi)皮細(xì)胞在含有Y-27632的介質(zhì)中傳代培養(yǎng)時(shí)，粘附于板上的細(xì)胞的數(shù)量是顯著高的(圖8)，這是指與在沒(méi)有添加Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)相比而言。從其可表明，除了原始培養(yǎng)外，Y-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)也是有效的。
[0175]實(shí)施例7
[0176]Y-27632對(duì)于在猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)的影響的研究
[0177]按照與實(shí)施例6中相同方式傳代培養(yǎng)的稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)角膜內(nèi)皮細(xì)胞在載片上次代培養(yǎng)至1/4的稀釋比。在傳代培養(yǎng)后的24小時(shí)，用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(圖9A和9B)。此外，在載片上的角膜內(nèi)皮細(xì)胞用4%仲甲醛在室溫下固定10分鐘，并且肌纖蛋白纖維由毒傘素?zé)晒馊旧?圖1OA和10B)來(lái)染色。
[0178]在傳代后的第24小時(shí)的已培養(yǎng)的稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)角膜內(nèi)皮細(xì)胞中，當(dāng)在含有Y-27632的介質(zhì)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)(圖9B)，細(xì)胞在載片上的粘附增加，促進(jìn)了展平成角膜內(nèi)皮細(xì)胞狀細(xì)胞，并且與不含Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)相比也增加了細(xì)胞的凝聚(圖9A)。另外，通過(guò)毒傘素?zé)晒馊旧?，?dāng)在含有Y-27632的介質(zhì)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)(圖10B)，與不含Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)相比清楚地觀察到肌纖蛋白應(yīng)力纖維(圖10A)，并且已發(fā)現(xiàn)Y-27632促進(jìn)細(xì)胞骨架的形成。
[0179]實(shí)施例8
[0180]Y-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響的研究
[0181]按照與實(shí)施例6中相同方式傳代培養(yǎng)的稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)角膜內(nèi)皮細(xì)胞在載片上次代培養(yǎng)至1/4的稀釋比。添加了 Υ-27632(10μΜ)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)是用于ROCK抑制劑(+)組以及沒(méi)有添加Υ-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)是用于ROCK抑制劑(_)組。在傳代培養(yǎng)的第1，2和14天，在載片上的角膜內(nèi)皮細(xì)胞在室溫下用4%仲甲醛固定10分鐘，然后用抗_Ki67抗體進(jìn)行免疫染色(圖11)。類(lèi)似地，另外，獼猴(Macacafascicularis)角膜內(nèi)皮細(xì)胞在ROCK抑制劑⑴組和ROCK抑制劑㈠組當(dāng)中的每一個(gè)中傳代培養(yǎng)至1/4的稀釋比。在傳代培養(yǎng)的第I和2天，這些細(xì)胞通過(guò)使用0.05%胰蛋白酶被采集并且通過(guò)使用抗-Ki67抗體進(jìn)行流式細(xì)胞光度術(shù)，然后測(cè)定細(xì)胞周期(圖12和13)。
[0182]與ROCK抑制劑(_)組相比，在傳代培養(yǎng)的第I和2天，ROCK抑制劑(+)組含有許多Ki67陽(yáng)性細(xì)胞。然而，當(dāng)在第14天這些細(xì)胞幾乎實(shí)現(xiàn)融合時(shí)，ROCK抑制劑(+)組的陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量低于ROCK抑制劑㈠組的數(shù)量(圖11)。同樣在流式細(xì)胞光度術(shù)中，ROCK抑制劑(+)組在傳代培養(yǎng)的第I和2天含有許多Ki67陽(yáng)性細(xì)胞，這是指與ROCK抑制劑(-)組相比(圖12和13)。
[0183]因?yàn)樵诩?xì)胞增殖周期Gl中的細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)Ki67抗原，并且從S到M階段，已表明Y-27632具有在獼猴(Macaca fascicularis)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)之后的早期階段中加速細(xì)胞周期的作用并且是可用于有效細(xì)胞培養(yǎng)的藥物。
[0184]實(shí)施例9[0185]Y-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡的影響的研究
[0186]按照與實(shí)施例6中相同方式傳代培養(yǎng)的稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)角膜內(nèi)皮細(xì)胞被次代培養(yǎng)至1/4的稀釋比。添加了 Υ-27632(10μΜ)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)是用于ROCK抑制劑(+)組以及沒(méi)有添加Υ-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)是用于ROCK抑制劑(-)組。在傳代培養(yǎng)的第I天，包括在介質(zhì)中的那些細(xì)胞在內(nèi)的全部細(xì)胞通過(guò)使用0.05%胰蛋白酶被采集并且通過(guò)使用Annexin V和PI (Propidium 1dide)進(jìn)行流式細(xì)胞光度術(shù),然后測(cè)定細(xì)調(diào)凋亡(圖14和15)。
[0187]ROCK抑制劑(+)組顯示了在傳代培養(yǎng)的第I天凋亡細(xì)胞與全部細(xì)胞的比率的顯著減少(圖14)，這是指與ROCK抑制劑㈠組相比。此外，每IXlO4個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的數(shù)量的比較揭示了在ROCK抑制劑(+)組中的顯著減少，這是指與ROCK抑制劑(-)組相比(圖 15)。
[0188]從其中可以表明，Y-27632在稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)中具有抑制凋亡的作用。
[0189]實(shí)施例10
[0190]Y-27632對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的密度的影響的研究
[0191]從安樂(lè)死的稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)解離的角膜組織中分離出粘附有角膜內(nèi)皮細(xì)胞的 Descemet 膜。Descemet 膜與中性蛋白酶 II (1.2U/ml, Roche Applied Science)一起在37°C，5% CO2的 條件下培養(yǎng)45分鐘，然后通過(guò)移液管移取手術(shù)以機(jī)械方式分離出角膜內(nèi)皮細(xì)胞。分離的角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行離心處理，然后接種在用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)上。實(shí)現(xiàn)融合的角膜內(nèi)皮細(xì)胞在37°C，5% CO2的條件下用0.05%胰蛋白酶培養(yǎng)10分鐘，然后傳代培養(yǎng)。添加了 Υ_27632(10μΜ)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)是用于ROCK抑制劑⑴組以及沒(méi)有添加Υ-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)是用于ROCK抑制劑(-)組。在從培養(yǎng)起始后的72小時(shí)，該培養(yǎng)介質(zhì)被交換，并且在72小時(shí)后，ROCK抑制劑(+)組和ROCK抑制劑(-)組都在不含Υ-27632的用于角膜內(nèi)皮的常規(guī)介質(zhì)中培養(yǎng)。在每一次傳代中，用相差顯微鏡拍取細(xì)胞的照片，測(cè)量細(xì)胞密度，以及研究Υ-27632對(duì)于所培養(yǎng)的猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的密度的影響。
[0192]該傳代重復(fù)7次，和該ROCK抑制劑(+)組在整個(gè)傳代培養(yǎng)的期間顯示出更高的細(xì)胞密度(圖16)，這是指與ROCK抑制劑(-)組相比。從這一點(diǎn)可以認(rèn)為正是Υ-27632的使用能夠?qū)崿F(xiàn)具有高密度的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)，其未來(lái)將可用于再生藥物，如培養(yǎng)角膜內(nèi)皮片的移植。
[0193]實(shí)施例11
[0194]fasudil對(duì)于猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)的影響的研究
[0195]從安樂(lè)死的稱(chēng)猴(Macaca fascicularis)解離的角膜組織中分離出粘附有角膜內(nèi)皮細(xì)胞的 Descemet 膜。Descemet 膜與中性蛋白酶 II (1.2U/ml, Roche Applied Science)一起在37°C，5% CO2的條件下培養(yǎng)45分鐘，然后通過(guò)移液管移取手術(shù)以機(jī)械方式分離出角膜內(nèi)皮細(xì)胞。分離的角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行離心處理，然后在用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中傳代培養(yǎng)。作為用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)，使用與實(shí)施例1中相同的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。在通過(guò)0.05%胰蛋白酶處理進(jìn)行的傳代培養(yǎng)過(guò)程中所收集的已培養(yǎng)的猴子角膜內(nèi)皮細(xì)胞被分離和離心處理，并且在fasudil組中在添加了 fasudil(10yM，SIGMA-ALDRICH)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中和在對(duì)照組中在沒(méi)有添加fasudil的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中攪拌至相同的濃度，然后這些細(xì)胞以約2000個(gè)細(xì)胞/孔的密度被接種到96孔板上。在培養(yǎng)起始后的24小時(shí)，粘附細(xì)胞通過(guò)使用 CellTiter-Glo (注冊(cè)商標(biāo))Luminescent Cell Viability Assay (Promega)(圖 17)來(lái)計(jì)數(shù)。通過(guò)使用fasudil ( 一種ROCK抑制劑)也發(fā)現(xiàn)了角膜內(nèi)皮細(xì)胞的受促進(jìn)的細(xì)胞粘附的效果。
[0196]配方實(shí)施例5
[0197]含有Rho激酶抑制劑的前房?jī)?nèi)注射劑
[0198]根據(jù)常規(guī)方法制備下列前房?jī)?nèi)注射劑。
[0199]
【權(quán)利要求】
1.RhO激酶抑制劑用于生產(chǎn)角膜保存溶液的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲酰基)環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要 求1的用途，其中該角膜源自于人。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK103931608SQ201410200380
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2007年8月29日
【發(fā)明者】木下茂, 小泉范子, 上野盛夫 申請(qǐng)人:千壽制藥株式會(huì)社, 木下茂