一種復(fù)合生防菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種防治農(nóng)作物土傳病害的復(fù)合生防菌劑及其制備方法和應(yīng)用。該菌劑由蠟狀芽孢桿菌和綠針假單胞菌按照1:5-20的菌落形成單位數(shù)目比配制而成，對灰霉菌有良好抑制效果，可防治蔬菜灰霉菌病，提高蔬菜產(chǎn)量，從而為防治農(nóng)作物土傳灰霉菌病害提供了新的生物防治產(chǎn)品，以及為開發(fā)新型生物有機(jī)肥提供了必要的條件。
【專利說明】一種復(fù)合生防菌劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種防治農(nóng)作物土傳病害的復(fù)合生防菌劑及其制備方法和應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]農(nóng)作物土傳病害每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此病害防治工作成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)科學(xué)的當(dāng)務(wù)之急。目前，農(nóng)作物土傳病害的防治方法主要是以利用抗病品系植株以及化學(xué)防治為主。一方面，使用抗病品系的植株可以達(dá)到經(jīng)濟(jì)有效的防治效果，但要想獲得一株理想的抗病品系并不是一件容易的事，而且抗病品種往往在其推廣幾年之后便出現(xiàn)抗性喪失甚至生長不良等情況；另一方面，化學(xué)防治由于其防效較高、速度快、抗菌譜較廣等優(yōu)點(diǎn)而在農(nóng)作物土傳病害防治中起到非常重要的作用，然而它又受到三個因素的限制:一是目前高效低毒的化學(xué)殺菌藥劑品種較少，大多數(shù)仍為毒性較大的藥劑，以毒殺菌并不是長久之計；二是環(huán)境因素對防治效果的影響也不小，當(dāng)環(huán)境條件適合病原菌侵入和傳播時，其防治效果往往不能令人滿意；三是化學(xué)藥劑容易造成環(huán)境污染，危機(jī)人類日常生活。作為病害防治方法之一的生物防治，在某些條件下具有良好的防治效果，并己成為目前病害防治研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。[0004]近年來，國內(nèi)外廣泛利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物來抑制病原菌的生存活動，使這一防治策略得以迅速發(fā)展，拮抗菌在農(nóng)作物土傳病害生物防治這一領(lǐng)域起到了非常重要的作用，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌甚至霉菌，而人們在應(yīng)用中仍主要以拮抗細(xì)菌為主。具有拮抗能力的細(xì)菌無論是在自然發(fā)生的生物防治現(xiàn)象中還是人為應(yīng)用于病害防治的試驗(yàn)中，都具有非常明顯的防治功效，其主要優(yōu)勢在于:(I)細(xì)菌的種類和數(shù)量繁多，在植物的根際和土壤表面及內(nèi)層都大量存在；(2)拮抗細(xì)菌對病原菌的抑制作用方式較多，包括競爭營養(yǎng)、寄生、分泌殺菌物質(zhì)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式，從而對病原菌產(chǎn)生不利影響；(3)具有驚人的繁殖速度，一般細(xì)菌的生長繁殖速度要快于真菌、放線菌等；(4)細(xì)菌可以人工培養(yǎng)，便于控制，在實(shí)踐中易于操作；(5)某些細(xì)菌不僅能防治病害，還具有促進(jìn)植株生長等功效，從而增加產(chǎn)量。
[0005]灰霉菌屬半知菌亞門葡萄孢屬?；颐咕稚咦庸＜?xì)長，灰黑色，大小為(960~1200) ymX (16~22) μ m，不規(guī)則樹狀分支，分支頂端細(xì)胞膨大成球形，其上著生許多小梗，小梗上著生分生孢子，形似葡萄穗狀。分生孢子單胞無色，橢圓形或卵圓形，大小為(8~14) μ mX (6~9) μ m,孢子集生呈灰色。菌核褐色，形狀不規(guī)則，大小為(2~4)mmX (I~3)mm[l]?；颐咕軌蚯秩?00多種植物，屬真菌病害，多種植物的花、果、葉、莖均可發(fā)病。該菌核在土壤或病殘體上越冬越夏，病菌耐低溫，在7-20°C大量產(chǎn)生孢子，苗期棚內(nèi)溫度15_23°C。弱光，相對濕度在90%以上或幼苗表面有水膜時易發(fā)病?；ㄆ谧钜赘胁?，借氣流，灌溉及農(nóng)事操作從傷口、衰老器官侵入。目前國內(nèi)對灰霉病防治的農(nóng)藥主要為化學(xué)產(chǎn)品，主要有:乙霉威、腐霉利、異菌脲、菌核凈、嘧霉胺、井R霉素等。鑒于化學(xué)藥劑存在環(huán)境污染問題，因此研究適宜的防治灰霉病的新型生防菌劑，這對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的長遠(yuǎn)發(fā)展顯得尤為重要。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的第一個目的在于提供一種防治農(nóng)作物土傳病害的復(fù)合生防菌劑，該菌劑對灰霉菌有良好抑制效果，可防治蔬菜灰霉菌病，提高蔬菜產(chǎn)量。另外，本發(fā)明的另一個目的在于提供一種上述復(fù)合生防菌劑的制備方法和應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種復(fù)合生防菌劑，該菌劑由蠟狀芽孢桿菌和綠針假單胞菌按照1:5-20的菌落形成單位數(shù)目比配制而成。優(yōu)選地，該菌劑由蠟狀芽孢桿菌和綠針假單胞菌按照1:10的菌落形成單位數(shù)目比配制而成。
[0009]本發(fā)明提供的上述復(fù)合生防菌劑，其中所述的蠟狀芽孢桿菌為蠟狀芽孢桿菌(,Bacillus cereus ) CICC21687 ;所述的綠針假單胞菌為綠針假單胞菌iPseudomormschlororaphis ) CICC20676。
[0010]一種上述復(fù)合生防菌劑的制備方法，該方法包括如下步驟:
(1)將蠟狀芽孢桿菌、綠針假單胞菌分別接種到培養(yǎng)液中進(jìn)行液態(tài)種子培養(yǎng)及液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到活菌數(shù)大于1.0X IO9個/ml的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液、綠針假單胞菌發(fā)酵液，低溫負(fù)壓干燥，得蠟狀芽孢桿菌菌粉、綠針假單胞菌菌粉；
(2)按蠟狀芽孢桿菌、綠針假單胞菌的菌落形成單位數(shù)目比為1:5-20(優(yōu)選菌落形成單位數(shù)目比為1:10)，將步驟(1)所得蠟狀芽孢桿菌菌粉和綠針假單胞菌菌粉混合配制成生防菌肥發(fā)酵的復(fù)合菌劑。
[0011]在上述復(fù)合生防菌劑的制備方法中，步驟(1)中所述的培養(yǎng)液的組成為:蛋白胨10g/L，牛肉膏 5g/L, NaCl 5g/L，ρΗ7.0。
[0012]在上述復(fù)合生防菌劑的制備方法中，步驟(1)中所述蠟狀芽孢桿菌的液態(tài)發(fā)酵的條件為:通氣攪拌下于28°C _32°C發(fā)酵30-60h ;所述綠針假單胞菌的液態(tài)發(fā)酵的條件為:通氣攪拌下于25°C -30°C發(fā)酵20-36h。
[0013]本發(fā)明人在篩選抑制灰霉菌生長的拮抗菌時意外的發(fā)現(xiàn)，含有蠟狀芽孢桿菌CICC21687與綠針假單胞菌CICC20676的復(fù)合菌液對灰霉菌具有極其顯著的抑制作用?；诖税l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人通過培養(yǎng)發(fā)酵并低溫干燥的方式，將這兩種拮抗菌制備成了復(fù)合生防菌劑。同時，發(fā)明人還將生防菌劑接入熟化的畜禽糞便與秸桿中堆肥發(fā)酵，形成了防治農(nóng)作物土傳灰霉菌病害的生物有機(jī)肥。本發(fā)明制成的生物有機(jī)肥，其中每克肥料中所含有效拮抗菌數(shù)(cfu)大于1.0 X IO8個，有機(jī)質(zhì)含量(以干基計)大于25%，水分含量低于30%，其它指標(biāo)符合生物有機(jī)肥國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。因此，本發(fā)明提供了上述復(fù)合菌劑的應(yīng)用，即:上述的復(fù)合生防菌劑在制備防治農(nóng)作物土傳灰霉菌病害的生物有機(jī)肥中的應(yīng)用。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的復(fù)合生防菌劑由蠟狀芽孢桿菌OfeciJAz1Scereus)CICC21687 和綠針假單胞菌chlororaphis)ClCC2Q^l^ 組成，這兩種接抗菌可發(fā)揮抑制灰霉菌的協(xié)同作用，從而為防治農(nóng)作物土傳灰霉菌病害提供了新的生物防治產(chǎn)品，以及為開發(fā)新型生物有機(jī)肥提供了必要的條件。[0015]
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下是本發(fā)明的的具體實(shí)施例，需要說明的是，本發(fā)明各實(shí)施例所用的蠟狀芽孢桿菌為蠟狀芽孢桿菌cereus) CICC21687，所用的綠針假單胞菌為綠針假單胞菌iPsoudomorms chlororaphis) CICC20676,均購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection, CICC,位于北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號院6號樓)。
[0017]實(shí)施例1復(fù)合菌劑的制備
(1)液體種子培養(yǎng)基的配制:稱取蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，加純化水?dāng)嚢杌靹?，補(bǔ)足水到1000mL,iI pH=7.0，分裝到10個150mL的三角瓶，121°C滅菌30min,即可。
[0018](2)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:稱取蛋白胨1kg，牛肉膏0.5 kg,NaCl 0.5kg，加純化水?dāng)嚢杌靹?，補(bǔ)足水到IOOLdM pH=7.0,121°C滅菌30min，即可。
[0019](3)將蠟狀芽孢桿菌接入上述三角瓶中的液體培養(yǎng)基中，于30°C、180r/min搖床振蕩培養(yǎng)30h，形成種子液；將種子液按1:500的體積比例接種到發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵罐的基本工作參數(shù)為--溫度30°C，攪拌速度200r/min，pH7.0，溶解氧30%，罐壓0.04MPa，48小時后終止發(fā)酵，得到活菌數(shù)大于9.6 X IO9個/ml的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液，收集所有的發(fā)酵液，低溫負(fù)壓干燥，得菌粉A。
[0020](4)將綠針假單胞菌接入上述三角瓶中的液體培養(yǎng)基中，于28°C、150r/min搖床振蕩培養(yǎng)20h，形成種子液；將種子液按1:500的體積比例接種到發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵罐的基本工作參數(shù)為--溫度28°C，攪拌速度150r/min，pH7.0，溶解氧30%，罐壓0.04MPa，25小時后終止發(fā)酵，得到活菌數(shù)大于2.1 X IO9個/ml的綠針假單胞菌發(fā)酵液，收集所有的發(fā)酵液，低溫負(fù)壓干燥，得菌粉B。
[0021](5)按蠟狀芽孢桿菌、綠針假單胞菌的菌落形成單位數(shù)目比為1:10，將所得菌粉A和菌粉B混合配制成生防菌肥發(fā)酵的復(fù)合菌劑，其中每克復(fù)合菌劑有效活菌數(shù)(cfu)大于
2.2億個。
[0022]實(shí)施例2不同菌株對灰霉菌的抑制試驗(yàn)研究
PDA培養(yǎng)基的配制:稱取去皮馬鈴薯200g，切塊煮沸30min，然后用紗布過濾取汁，再加20.0g葡萄糖及20.0g瓊脂，溶化后補(bǔ)足水到1000mL,分裝到10個150mL的三角瓶，121 °C滅菌30min,即可。
[0023]在無菌條件下，取20mL經(jīng)滅菌后冷卻至45°C左右的PDA培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿，制成PDA平板。放置24h后，在平板中央接種病原菌灰霉菌菌絲，22°C培養(yǎng)4d。在已長好的灰霉菌平皿中，用直徑I cm打孔器在菌落邊緣切取菌落圓塊，備用。
[0024]分別取實(shí)施例1步驟(3)、(4)制備的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液、綠針假單胞菌發(fā)酵液，用無菌水稀釋發(fā)酵液至菌體濃度為I X IO5個/ml—1的稀釋液，其中菌體計數(shù)法采用的是顯微直接計數(shù)法。向放置I天的PDA平板中加入100 μ L的拮抗菌發(fā)酵稀釋液(復(fù)合菌液中蠟狀芽孢桿菌與綠針假單胞菌的數(shù)量比為1:10)，用涂布器涂勻，每個處理4個重復(fù)。將切取的灰霉菌菌塊接種在涂好的平板中央，有菌絲的一面接觸平板。25°C培養(yǎng)4d后，用直尺“十字交叉法”測量灰霉菌菌落直徑(單位為cm)，結(jié)果取其平均值。另取實(shí)施例1步驟(3)、(4)制備的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液、綠針假單胞菌發(fā)酵液，4000r / min離心30min，上清液經(jīng)過0.22 μ L膜過濾，濾除菌體，得無菌發(fā)酵上清液，作為對照。按如下公式計算抑菌率:抑菌
率=(D對照-D處理)/ D對照X 100%。
[0025]根據(jù)表1的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，綠針假單胞菌或蠟狀芽孢桿菌單獨(dú)對灰霉菌的抑制效果不顯著。然而，與單菌使用相比，這兩種菌株組成的復(fù)合菌液卻表現(xiàn)出了對灰霉菌極為顯著的抑制效果0° < 0.01)。
[0026]表1不同菌株對灰霉菌的抑制效果比較
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)合生防菌劑，其特征在于，該菌劑由蠟狀芽孢桿菌和綠針假單胞菌按照1:5-20的菌落形成單位數(shù)目比配制而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合生防菌劑，其特征在于，該菌劑由蠟狀芽孢桿菌和綠針假單胞菌按照1:10的菌落形成單位數(shù)目比配制而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合生防菌劑，其特征在于，所述的蠟狀芽孢桿菌為蠟狀芽抱桿菌(AaciJJw1S cereus) CICC21687。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合生防菌劑，其特征在于，所述的綠針假單胞菌為綠針假單胞菌chlororaphis) CICC20676。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合生防菌劑的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟: (1)將蠟狀芽孢桿菌、綠針假單胞菌分別接種到培養(yǎng)液中進(jìn)行液態(tài)種子培養(yǎng)及液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到活菌數(shù)大于1.0X109個/ml的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液、綠針假單胞菌發(fā)酵液，低溫負(fù)壓干燥，得蠟狀芽孢桿菌菌粉、綠針假單胞菌菌粉； (2)按蠟狀芽孢桿菌、綠針假單胞菌的菌落形成單位數(shù)目比為1:5-20，將步驟(1)所得蠟狀芽孢桿菌菌粉和綠針假單胞菌菌粉混合配制成生防菌肥發(fā)酵的復(fù)合菌劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合生防菌劑的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的培養(yǎng)液的組成為:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L, NaCl 5g/L，ρΗ7.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合生防菌劑的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述蠟狀芽孢桿菌的液態(tài)發(fā)酵的條件為:通氣攪拌下于28°C _32°C發(fā)酵30-60h。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合生防菌劑的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述綠針假單胞菌的液態(tài)發(fā)酵的條件為:通氣攪拌下于25°C _30°C發(fā)酵20-36h。
9.權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合生防菌劑在制備防治農(nóng)作物土傳灰霉菌病害的生物有機(jī)肥中的應(yīng)用。
【文檔編號】C05F11/08GK103952366SQ201410215969
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】段占娥 申請人:段占娥