利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛堿的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛堿的方法，采用如下步驟：(1)鐵皮石斛種子播撒于1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度23～25℃，光照強(qiáng)度1500～1700lx，光暗比為10h/14h條件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲得鐵皮石斛組培苗；(2)用2％的無水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成濃度為10mmol/L的茉莉酸甲酯母液，將茉莉酸甲酯母液添加到1/2MS培養(yǎng)基中至茉莉酸甲酯終濃度為48～52μmol/L；然后將鐵皮石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的1/2MS培養(yǎng)基，在26～28℃、相對濕度66～68％、光強(qiáng)1800～2000lx、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)29～31天。本發(fā)明在組織培養(yǎng)中通過施加少量的茉莉酸甲酯，即可大幅提高鐵皮石斛中石斛堿的積累效率，投資少，效果顯著，方便易行。
【專利說明】利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛堿的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛堿的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]石斛堿是鐵皮石斛最主要的生理活性成分之一，其藥理的強(qiáng)弱與生物堿含量有一定的關(guān)系。對鐵皮石斛石斛堿的生物學(xué)功能和藥理藥效研究表明它具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗癌、降血壓、以及鎮(zhèn)靜和止痛作用。
[0003]鐵皮石斛在自然條件下繁殖率低、生長緩慢、被過度采挖利用以及生態(tài)環(huán)境的破壞，導(dǎo)致野生資源瀕臨滅絕，限制了石斛堿生產(chǎn)和進(jìn)一步開發(fā)利用。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的日趨成熟，國內(nèi)外學(xué)者利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行鐵皮石斛的快速繁殖，以提高繁殖系數(shù)，解決資源緊缺的問題。但離體培養(yǎng)的石斛原球莖、組培苗等的石斛堿含量和化學(xué)組成及作用等方面與野生石斛相當(dāng)，仍不能有效解決石斛資源短缺的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種技術(shù)工藝簡單易行、廉價高效且能顯著提高鐵皮石斛生產(chǎn)石斛堿效率的利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛堿的方法。其技術(shù)方案為:
[0005]一種利用茉 莉酸甲酯誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛堿的方法，其特征在于采用如下步驟:
[0006]I)制備鐵皮石斛組培苗:鐵皮石斛種子播撒于1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度23~25°C，光照強(qiáng)度1500~17001x，光暗比為10h/14h條件下培養(yǎng)至苗高3~4cm，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗；
[0007]2)積累石斛堿:用2%的無水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成濃度為1mmol/L的茉莉酸甲酯母液。將茉莉酸甲酯母液添加到培養(yǎng)基中至茉莉酸甲酯終濃度為48~52 μ mol/L;然后將鐵皮石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的培養(yǎng)基中，在26~28°C、相對濕度66~68%、光強(qiáng)1800~20001x、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)29~31天。
[0008]所述利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛堿的方法，其特征在于:步驟I)中，培養(yǎng)基采用添加30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基，石斛種子采用浙江雁蕩山鐵皮石斛種子。
[0009]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是:在組織培養(yǎng)中施加了少量的茉莉酸甲酯，大幅提高了鐵皮石斛中石斛堿的積累效率，具有投資少、效果顯著、方便易行的特點(diǎn)，對于降低石斛堿的生產(chǎn)成本、滿足石斛堿的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1:
[0011]步驟1、制備鐵皮石斛組培苗:選用浙江雁蕩山鐵皮石斛種子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度23°C，光照強(qiáng)度15001x，光暗比為10h/14h條件下讓種胚分化成芽，日光燈下培養(yǎng)至鐵皮石斛無菌苗高度約3~4cm，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的鐵皮石斛無菌苗。
[0012]步驟2、誘導(dǎo)鐵皮石斛積累石斛堿:茉莉酸甲酯采用美國西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司生產(chǎn)的茉莉酸甲酯。先用2%的無水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成濃度為lOmmol/L的茉莉酸甲酯母液，將茉莉酸甲酯母液添加到含30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯終濃度為48 μ mol/L，然后將石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的1/2MS培養(yǎng)基，與空白對照組同時在26°C、相對濕度66%、光強(qiáng)18001x、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)31天。
[0013]實(shí)施例2:
[0014]步驟1、制備鐵皮石斛組培苗:選用浙江雁蕩山鐵皮石斛種子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度24°C，光照強(qiáng)度16001x，光暗比為10h/14h條件下讓種胚分化成芽，日光燈下培養(yǎng)日光燈下培養(yǎng)至鐵皮石斛無菌苗高度約3~4cm,即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的鐵皮石斛無菌苗。
[0015]步驟2、誘導(dǎo)鐵皮石斛積累石斛堿:茉莉酸甲酯采用美國西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司生產(chǎn)的茉莉酸甲酯。先用2%的無水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成濃度為lOmmol/L的茉莉酸甲酯母液，將茉莉酸甲酯母液添加到含30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯終濃度為50 μ mol/L，然后將石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的1/2MS培養(yǎng)基，與空白對照組同時在27°C、相對濕度67%、光強(qiáng)19001x、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)30天。
[0016]實(shí)施例3:
[0017]步驟1、制備鐵皮石斛組培苗:選用浙江雁蕩山鐵皮石斛種子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度25°C，光照強(qiáng)度17001x，光暗比為10h/14h條件下讓種胚分化成芽，日光燈下培養(yǎng)至鐵皮石斛無菌苗高度約3~4cm，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的鐵皮石斛無菌苗。
[0018]步驟2、誘導(dǎo)鐵皮石斛積累石斛堿:茉莉酸甲酯采用美國西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司生產(chǎn)的茉莉酸甲酯。先用2%的無水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成濃度為lOmmol/L的茉莉酸甲酯母液，將茉莉酸甲酯母液添加到含30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯終濃度為52 μ mol/L，然后將石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的1/2MS培養(yǎng)基，與空白對照組同時在28°C、相對濕度68%、光強(qiáng)20001x、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)29天。
[0019]采用以下方法對本發(fā)明中茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的鐵皮石斛組培苗及空白對照組定期進(jìn)行觀察和檢測，具體是每天取少量鐵皮石斛樣品按以下步驟對本發(fā)明茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的鐵皮石斛及空白對照組中的石斛堿含量進(jìn)行測定:①精確稱取5g鐵皮石斛苗，80°C殺青30分鐘，60°C烘干至恒重，磨成石斛粉(40目)，加入1mL石油醚回流脫脂0.5h，抽濾后溶于50°C的1mL蒸餾水中；②將活化的纖維素酶加入到脫脂后的鐵皮石斛粉末中(用量為石斛粉末質(zhì)量的0.5% )，恒溫酶解1.5h，90°C滅活，冷卻過濾；③加入90%乙醇浸提三次，每次0.5h，過濾，蒸干乙醇。加入氯仿萃取三次，合并濾液，蒸干氯仿，得石斛總堿；④采用高效液相色譜法測定石斛堿含量，色譜柱Waters Symmetry C18 (4.6mmx250mm, 5um),流動相為水(0.1 %三乙胺)-乙腈，梯度洗脫條件為0-20-30min，5% -80% -80%乙腈，流速1.0mL/min，檢測波長280nm，柱溫為常溫，進(jìn)樣量20 μ I ;⑤用甲醇溶解石斛堿純品，配制成不同濃度的純品石斛堿溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X，μ g/ml)進(jìn)行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程；⑥將提取的石斛堿樣品溶于甲醇中，0.45 μ m的濾膜過濾后得石斛堿樣品溶液。將樣品溶液按色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，根據(jù)各個樣品的峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程計算出石斛堿濃度，得出樣品中石斛堿的含量。
[0020]結(jié)果表明:本發(fā)明中用茉莉酸甲酯處理的鐵皮石斛苗中所檢測的石斛堿含量相比于對照組顯著提高，處理后鐵皮石斛苗石斛堿的平均含量達(dá)到0.45~0.49%，是對照的
。3.21 ~3.5 倍。
【權(quán)利要求】
1.一種利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛堿的方法，其特征在于采用如下步驟:(1)制備鐵皮石斛組培苗:鐵皮石斛種子播撒于1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度23~25°C，光照強(qiáng)度1500~17001x，光暗比為10h/14h條件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗； (2)積累鐵皮石斛石斛堿:用2%的無水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成濃度為lOmmol/L的茉莉酸甲酯母液，將茉莉酸甲酯母液添加到培養(yǎng)基中至茉莉酸甲酯終濃度為48~52ymol/L ;然后將鐵皮石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的培養(yǎng)基中，在26~28°C、相對濕度66~68 %、光強(qiáng)1800~20001x、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)29~31天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛堿的方法，其特征在于:步驟(1)中，培養(yǎng)基采用添加30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基，石斛種子采用浙江雁蕩山鐵皮石 斛種子。
【文檔編號】A01H4/00GK104026015SQ201410276232
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】袁佐清, 張建勇, 劉濤, 林聰
申請人:山東理工大學(xué)