一種密碼子植物化改造的pmi基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種密碼子植物化改造的PMI(phosphomannose?isomerase，磷酸甘露糖異構(gòu)酶)基因，本發(fā)明利用水稻優(yōu)化密碼子設(shè)計(jì)合成了PMI基因。并且本發(fā)明提供一種表達(dá)盒和一種表達(dá)載體，以及該表達(dá)盒和表達(dá)載體在遺傳轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用。本發(fā)明利用改造的PMI基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，以甘露糖為篩選劑，將外源基因?qū)胨炯?xì)胞中。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了水稻的高效遺傳轉(zhuǎn)化，這是因?yàn)榻?jīng)過密碼子植物化改造的plant?PMI的轉(zhuǎn)化效率顯著提高。
【專利說明】一種密碼子植物化改造的PMI基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體而言，本發(fā)明涉及一種密碼 子經(jīng)過植物化改造的PMI基因，及其作為篩選標(biāo)記，在植物遺傳轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)基因技術(shù)，是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的一種有效的植物定向改良方法。該 技術(shù)主要通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍轉(zhuǎn)化等方法將目的基因?qū)胧荏w，經(jīng)過標(biāo)記篩選和分子 檢測，獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化體，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的快速定向改良，具有可用基因資源廣、改良 效率高等優(yōu)點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為農(nóng)作物的產(chǎn)量提升、品質(zhì)改良和抗性增強(qiáng)提供了新路徑、開拓 了新空間。
[0003] 但現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)，主要使用抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記，該類基因可能隨食 物進(jìn)入腸道，存在與腸道微生物基因交換產(chǎn)生耐藥菌株的潛在風(fēng)險(xiǎn)，以致影響抗生素的醫(yī) 用效果。為了替代抗生素抗性基因，其他類型篩選標(biāo)記基因被陸續(xù)研究開發(fā)，如除草劑抗性 基因、氨基酸代謝篩選基因、可視標(biāo)記基因等，但這些篩選標(biāo)記基因要么存在類似問題，要 么篩選效率和成本不適于規(guī)模化應(yīng)用。
[0004] 而PMI是一種糖代謝基因，廣泛存在于藻類和一些豆科植物中。水稻等高等植物 細(xì)胞雖能將甘露糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸甘露糖，但由于細(xì)胞自身缺乏PMI，不能進(jìn)一步將6-磷酸 甘露糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，從而進(jìn)入糖酵解途徑而被利用，因此PMI可以作為篩選標(biāo)記基 因。與抗生素、除草劑等負(fù)選擇不同，甘露糖是進(jìn)行正選擇，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)PMI基因，可以 利用甘露糖為碳源而正常生長，篩選效率高。同時(shí)，甘露糖是廣泛存在于海藻、蕨類等植物 中的己糖，且PMI的催化產(chǎn)物為6-磷酸果糖，是蜂蜜和果漿的主要成份，二者都是環(huán)境友好 的天然物質(zhì)。
[0005] 但現(xiàn)在使用的PMI是從原核生物大腸桿菌中分離出來的，而原核生物和真核生物 存在不同的密碼子偏好和堿基組成。例如以水稻為代表的單子葉植物，其GC含量高，較細(xì) 菌及雙子葉植物等物種，密碼子偏好性強(qiáng)。因此直接使用未經(jīng)人工優(yōu)化設(shè)計(jì)的PMI，會(huì)影響 其在真核細(xì)胞中的表達(dá)效率，并影響其作為篩選標(biāo)記的使用效果。此外，由于PMI來自于大 腸桿菌，可能對(duì)轉(zhuǎn)化受體基因組造成不利影響，還可能引發(fā)對(duì)其安全性的擔(dān)憂。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明希望對(duì)PMI進(jìn)行密碼子植物化改造。本發(fā)明旨在將PMI基 因?qū)γ艽a子經(jīng)過植物化改造，并作為篩選標(biāo)記，應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化。
[0007] 具體而言，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種密碼子植物化改造的PMI基因，命名為 plant PMI，該基因具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，該序列是以模式作物水稻密碼子 偏好進(jìn)行優(yōu)化，即在維持編碼氨基酸序列不變的前提下，用水稻偏好密碼子替換原有密碼 子，得到植物化改造的plant PMI序列，再經(jīng)過化學(xué)合成而來。
[0008] 在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種含有所述plant PMI基因的植物表達(dá)載體。構(gòu)建 方法是利用Xho I酶切位點(diǎn)，用Xho I酶切pCAMBIA1381載體并回收，由于合成的plant PMI 序列兩端加有Xho I酶切位點(diǎn)，可以利用T4連接酶將plant PMI連接到pCAMBIA1381載體， 得到植物表達(dá)載體pCAMBIA1381-plant PMI。
[0009] 另一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒中包含上述的PMI基 因。
[0010] 另一方面，本發(fā)明提供一種上述基因、表達(dá)盒或載體的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng) 用包括利用所述密碼子植物化改造的PMI基因作為篩選標(biāo)記，獲得轉(zhuǎn)基因植物或植物部 分。
[0011] 優(yōu)選地，所述植物包括：糧食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物。
[0012] 優(yōu)選地，所述植物部分包括：細(xì)胞、原生質(zhì)體、細(xì)胞組織培養(yǎng)物、愈傷組織、細(xì)胞塊、 胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉、根、根尖、花藥和種子。
[0013] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種利用pCAMBIA1381-plant PMI表達(dá)載體（其含有所 述密碼子植物化改造的PMI基因），將外源基因?qū)胨炯?xì)胞的方法，包括下述步驟：
[0014] (1)將水稻種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上以產(chǎn)生次 級(jí)愈傷組織；
[0015] (2)將次級(jí)愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)；
[0016] (3)將步驟（2)中獲得的愈傷組織與攜帶plant PMI篩選標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌接觸 15分鐘；
[0017] (4)將步驟（3)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到上墊上三張無菌濾紙（加入2. 5-3. 5mL農(nóng)桿菌 懸浮培養(yǎng)基）的培養(yǎng)皿中，21-23°C培養(yǎng)48小時(shí)；
[0018] (5)將步驟（4)的愈傷組織置于前篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天；
[0019] (6)將步驟（5)的愈傷組織轉(zhuǎn)移篩選培養(yǎng)基上，以獲得抗性愈傷組織；
[0020] (7)將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化再生培養(yǎng)基中分化成苗；和
[0021] (8)將步驟（7)的苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根。
[0022] 其中所述步驟（1)中的種子是成熟種子；所述步驟（1)、（2)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是說 明書表1所列出的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；所述步驟（3)中的與農(nóng)桿菌接觸是將愈傷組織浸泡在所述 農(nóng)桿菌懸浮液中；所述步驟（4)中的農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基是說明書表1所列出的懸浮培養(yǎng)基； 所述步驟（5)中的前篩選培養(yǎng)基是說明書表1所列出的前篩選培養(yǎng)基；所述步驟￠)中的 篩選培養(yǎng)基是說明書表1所列出的篩選培養(yǎng)基；所述步驟（7)中的分化再生培養(yǎng)基是說明 書表1所列出的分化再生培養(yǎng)基；所述步驟（8)中的生根培養(yǎng)基是說明書表1所列出的生 根培養(yǎng)基。
[0023] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述水稻是粳稻，更優(yōu)選地，所述水稻是粳稻日本晴。
[0024] 表1培養(yǎng)基的示例性配方
[0025]

【權(quán)利要求】
1. 一種密碼子植物化改造的PMI基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. -種表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒中包含權(quán)利要求1所述的PMI基因。
3. -種表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求1所述的PMI基因或權(quán)利要 求2所述的表達(dá)盒。
4. 一種權(quán)利要求1-3所述的基因、表達(dá)盒或載體的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括利 用所述密碼子植物化改造的PMI基因作為篩選標(biāo)記，獲得轉(zhuǎn)基因植物或植物部分。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物包括：糧食作物、蔬菜作物、花卉 作物、能源作物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物部分包括：細(xì)胞、原生質(zhì)體、細(xì)胞 組織培養(yǎng)物、愈傷組織、細(xì)胞塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉、根、根尖、花藥和種 子。
7. -種利用含有權(quán)利要求1中所述的密碼子植物化改造的PMI基因的表達(dá)載體 pCAMBIA1381-plant PMI，將外源基因?qū)胨炯?xì)胞的方法，包括下述步驟： (1) 將水稻種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上以產(chǎn)生次級(jí)愈 傷組織； (2) 將所述次級(jí)愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，獲得愈傷組 織； (3) 將步驟（2)中獲得的愈傷組織與農(nóng)桿菌接觸15分鐘，其中，所述農(nóng)桿菌中引入了所 述表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中攜帶所述密碼子植物化改造的PMI基因； (4) 將步驟（3)處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到其上墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，21-23°C培養(yǎng) 48小時(shí)； (5) 將步驟（4)處理后的愈傷組織置于前篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天； (6) 將步驟（5)處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移篩選培養(yǎng)基上，以獲得抗性愈傷組織； (7) 將所述抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化再生培養(yǎng)基中分化成苗；和 (8) 將步驟（7)中所獲得的苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104046636SQ201410276408
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】李莉, 楊劍波, 魏鵬程, 宋豐順, 李 浩, 楊亞春, 倪大虎, 汪秀峰, 馬卉, 秦瑞英, 陸徐忠, 倪金龍 申請(qǐng)人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所