一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，構(gòu)建iaaM基因在黃花蒿腺毛細(xì)胞特異表達(dá)的載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黃花蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株。對轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增檢測，并對轉(zhuǎn)基因黃花蒿腺毛發(fā)育細(xì)胞情況及青蒿素含量進(jìn)行觀察與分析，篩選青蒿素含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株，通過組織培養(yǎng)繁殖建立轉(zhuǎn)基因高青蒿素含量的黃花蒿品系。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因黃花蒿中青蒿素含量顯著提高，最高可達(dá)非轉(zhuǎn)化黃花蒿含量的1.5倍，本發(fā)明對于為青蒿素的規(guī)?；a(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)定新藥源具有重要意義。
【專利說明】一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】的提高青蒿素含量的方法，特別涉及一種轉(zhuǎn)iaaM 基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 青蒿素是從植物黃花蒿中提取的含過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯藥物，是當(dāng)今瘧疾治療 的最理想藥物，能有效治療對傳統(tǒng)藥物氯奎產(chǎn)生抗藥性的瘧原蟲感染。青蒿素主要從黃花 蒿中直接提取得到，或提取黃花蒿中含量較高的青蒿酸，然后半合成而成。目前除黃花蒿、 青蒿外，尚未發(fā)現(xiàn)含有青蒿素的其它天然植物資源。因此黃花蒿仍是青蒿素藥物生產(chǎn)的惟 一藥源。
[0003] 雖然黃花蒿系世界廣泛分布品種，但青蒿素含量隨產(chǎn)地不同差異極大。研究證實(shí) 黃花蒿中合成青蒿素的主要部位是其葉片表面的腺毛細(xì)胞。由于其合成部位的特異性，黃 花蒿中青蒿素的含量僅占葉片干重的〇. 8%-1. 4%，因而使其分離成本高、產(chǎn)量低、廢棄物多。 野生黃花蒿中青蒿素含量很低，僅為〇. 1-0. 8%。通過雜交和定向育種開展了大量提高黃花 蒿中青蒿素含量的嘗試，但目前報(bào)道的最高青蒿素含量也未超過1. 4%，說明了常規(guī)選育方 法的局限性。本發(fā)明提供一種采用基因工程的植物遺傳轉(zhuǎn)化法提高黃花蒿中青蒿素含量的 方法，涉及到生長素合成酶基因在其腺毛細(xì)胞中特異表達(dá)，是一種運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)開展 的黃花蒿育種新方法。
[0004] 本發(fā)明采用的iaa#基因是植物通過色氨酸途徑合成生長素（IAA)的關(guān)鍵酶，該基 因最初來自于感染植物的土壤細(xì)菌根癌農(nóng)桿菌，為編碼色氨酸單加氧酶的基因，在植物中 表達(dá)后能利用色氨酸合成吲哚乙酸，即生長素。因此轉(zhuǎn)化iaaM基因后的植物細(xì)胞由于能過 量合成生長素，使其分裂和分化不受植株整體控制，出現(xiàn)如冠癭瘤的惡性生長現(xiàn)象。但若使 用特異性啟動(dòng)子使iaaM基因在特定的組織或細(xì)胞中表達(dá)，就有可能促進(jìn)特定細(xì)胞和組織 的生長。本發(fā)明使用腺毛細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子是來自于擬南芥表皮毛細(xì)胞特異性 表達(dá)的G12基因啟動(dòng)子，能在黃花蒿中有效作用，保證iaaM基因僅在腺毛細(xì)胞中表達(dá)，從而 不影響植株的整體發(fā)育，提高其青蒿素含量。
[0005] 根據(jù)本發(fā)明要解決的技術(shù)問題和本發(fā)明采用的技術(shù)方案進(jìn)行專利檢索，其檢索結(jié) 果如下。
[0006] 專利 1 : 專利權(quán)人為上海交通大學(xué)，申請?zhí)枮?00710170423. 8。本發(fā)明是一種生物【技術(shù)領(lǐng)域】的 轉(zhuǎn)ads基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發(fā)明從青蒿中克隆紫穗槐二烯合成酶ADS基 因，構(gòu)建含ads基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將ads基因轉(zhuǎn)入青蒿并再生出植 株，PCR檢測外源目的基因 ads的整合情況，高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定轉(zhuǎn)基 因青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基 因青蒿中青蒿泰的含量顯著提高，最高達(dá)到非轉(zhuǎn)化對照植株的2. 3倍，從而提供了一種提 高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用轉(zhuǎn)基因青蒿大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素打下了基礎(chǔ)。
[0007] 專利 2 : 專利權(quán)人為上海交通大學(xué)，申請?zhí)枮?00710170427. 6。本發(fā)明是一種生物【技術(shù)領(lǐng)域】的 用RNA干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發(fā)明從青蒿中克隆鯊烯合酶SQS基因 sqs片 段，構(gòu)建含sqs hairpin的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將sqs hairpin基因轉(zhuǎn)入青蒿 中獲得再生植株，PCR和RT - PCR檢測目的基因 sqs hairpin的整合和表達(dá)情況，高效液相 色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素合量提高的轉(zhuǎn)基因 青蒿植株。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的含量顯著提高，最高達(dá)到非轉(zhuǎn)化對照植株 的2. 8倍，從而提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用轉(zhuǎn)基因青蒿大規(guī)模生產(chǎn) 青蒿素打下了基礎(chǔ)。
[0008] 專利 3 : 專利權(quán)人為上海交通大學(xué)，申請?zhí)枮?01110099411. 7。本發(fā)明是一種生物【技術(shù)領(lǐng)域】的 轉(zhuǎn)A0C基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發(fā)明從青蒿中克隆丙二烯氧化環(huán)化酶A0C基 因，構(gòu)建含A0C基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將A0C基因轉(zhuǎn)入青蒿并再生出植 株，PCR檢測外源目的基因 A0C的整合情況，高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定轉(zhuǎn)基 因青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基 因青蒿中青蒿素的含量顯著提高，在非轉(zhuǎn)化普通青蒿含量為1. 53mg/g DW時(shí)，同時(shí)期轉(zhuǎn)A0C 基因青蒿中青蒿素的含量最高達(dá)到10. 17mg/g DW，其含量是非轉(zhuǎn)化青蒿含量的6. 65倍，從 而提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用轉(zhuǎn)基因青蒿大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素打下了 基礎(chǔ)。
[0009] 專利 4 : 專利權(quán)人為中國科學(xué)院研究生院，申請?zhí)枮?01110344258. X。本發(fā)明公開了青蒿bHLH 轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子，是如下a)或b)的蛋 白質(zhì)：a)由序列表中序列2所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所不的 氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與青蒿素合成相關(guān) 的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明將bHLH轉(zhuǎn)錄因子瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到青蒿植株內(nèi)過表達(dá)，其所調(diào)控 的青蒿素生物合成代謝中的關(guān)鍵酶表達(dá)量大幅度提高，可以用來生產(chǎn)青蒿素。本發(fā)明調(diào)控 青蒿素合成的方法解決了原料的限制問題，且生產(chǎn)工藝簡單，有利于青蒿素的大規(guī)模工業(yè) 生產(chǎn)。
[0010] 專利 5 : 專利權(quán)人為上海交通大學(xué)，申請?zhí)枮?01110430810. 7。本發(fā)明涉及一種生物【技術(shù)領(lǐng)域】 的高青蒿素含量轉(zhuǎn)基因青蒿植株的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：從青蒿中克隆ADS，CYP71AV1 和CPR三個(gè)基因，構(gòu)建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)， 將ADS，CYP71AV1和CPR三基因轉(zhuǎn)入青蒿并再生出植株，篩選，獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基 因青蒿植株。在非轉(zhuǎn)化普通青蒿含量為6. 43mg/g DW時(shí)，本發(fā)明得到的轉(zhuǎn)基因青蒿株系中 青蒿素的含量最高達(dá)到15. 09mg/g DW，其含量是非轉(zhuǎn)化青蒿含量的2. 35倍，本發(fā)明的方法 對于為青蒿素的規(guī)?；a(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)定新藥源具有重要意義。
[0011] 通過專利文件的檢索，沒有發(fā)現(xiàn)能夠破壞本發(fā)明專利新穎性的現(xiàn)有技術(shù)，也不存 在相互結(jié)合能破壞本發(fā)明創(chuàng)造性的文件。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)， 將生長素合成酶iaaM基因轉(zhuǎn)入黃花蒿，利用特異性G12基因啟動(dòng)子保證iaaM基因在黃花 蒿腺毛細(xì)胞中特異表達(dá)，促進(jìn)黃花蒿腺毛細(xì)胞發(fā)育和代謝，從而提高其青蒿素含量。本發(fā)明 建立了穩(wěn)定提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，為利用黃花蒿大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素奠定堅(jiān)實(shí)的 基礎(chǔ)。
[0013] 實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿 素含量的方法，其特征在于，其包括以下步驟： 步驟1、構(gòu)建iaaM基因在黃花蒿腺毛細(xì)胞特異表達(dá)的載體：將iaaM基因與G12基因啟 動(dòng)子重組，克隆到Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)pBI121質(zhì)粒的Hindlll及PstI位點(diǎn)，以NPT-II基因?yàn)?選擇標(biāo)記基因，載體以PBI121作為出發(fā)載體進(jìn)行改造和載體構(gòu)建，獲得pBI121-G12-iaaM 的重組Ti質(zhì)粒，提取重組Ti質(zhì)粒做PRC檢測和酶切驗(yàn)證； 步驟2、工程化根癌農(nóng)桿菌菌株的制備：構(gòu)建的重組Ti質(zhì)粒通過電激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化根 癌農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌經(jīng)過篩選、培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，所述的根癌農(nóng)桿菌為 LBA4404 ； 步驟3、利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化黃花蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植 株，具體包括以下步驟： 1) 外植體預(yù)培養(yǎng)：黃花蒿種子經(jīng)消毒后在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽成苗，待苗長至4-6cm時(shí) 剪取黃花蒿幼苗子葉用于轉(zhuǎn)化； 2) 黃花蒿幼苗子葉與根癌農(nóng)桿菌的共培侵染轉(zhuǎn)化：將黃花蒿幼苗子葉在培養(yǎng)至對數(shù)生 長后期的根癌農(nóng)桿菌液中侵泡30min ; 3) 誘導(dǎo)愈傷組織：將共培侵染轉(zhuǎn)化后的黃花蒿子葉以消毒后的MS培養(yǎng)液沖洗3遍，轉(zhuǎn) 接到 MS+1% 6-BA+0. 05% NAA+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +500 mg/L 羧芐青霉素 +20 mg/L 卡那霉 素的MSI固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d進(jìn)行誘導(dǎo)抗性愈傷組織； 4) 抗性再生植株的篩選：抗性愈傷組織團(tuán)生長至3-4_大小，取出葉盤采用無菌吸水 紙吸干其表面多余水分，將葉盤平放到MS+1. 5mg/L 6-BA+0. 05mg/L NAA+500mg/L羧芐青霉 素+20mg/L卡那霉素的MS2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化出芽，具體過程為愈傷組織稍微壓入培養(yǎng)基， 溫度控制在22-24°C之間，16h/8h進(jìn)行光暗交替培養(yǎng)；28-35d后誘導(dǎo)出抗性叢生芽，切下 帶芽愈傷部分，插入MS2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至莖分化和長高，待抗性芽生長至3-5cm后，將其 從愈傷組織基部切下，并將其移入1/2 MS+0. 5mg/L NAA+0. 5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L瓊 脂的MS3生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其生根，此時(shí)對每一顆陽性苗進(jìn)行編號，溫度控制在22-24°C之 間，16h/8h進(jìn)行光暗交替培養(yǎng)；根誘導(dǎo)分化14d后，將分化苗移至消毒蛭石中，培養(yǎng)室內(nèi)煉 苗7d，然后移栽至營養(yǎng)土中生長得到轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株； 步驟4、轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株的PCR檢測和腺毛細(xì)胞發(fā)育觀察：提取轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株葉 片DNA，PCR法進(jìn)行基因擴(kuò)增檢測，并對轉(zhuǎn)基因黃花蒿腺毛發(fā)育細(xì)胞情況及青蒿素含量進(jìn)行 觀察與分析； 步驟5、建立轉(zhuǎn)基因黃花蒿品系：篩選青蒿素含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株，通過 組織培養(yǎng)繁殖建立轉(zhuǎn)基因高青蒿素含量的黃花蒿品系。
[0014] 所述步驟1中G12基因啟動(dòng)子獲得途徑為：從GenBank中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中 獲得擬南芥G12基因核心序列，根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計(jì)兩條特異性引物，對擬南芥基因組 DNA擴(kuò)增，獲得G12基因啟動(dòng)子。
[0015] 所述步驟2中電激轉(zhuǎn)化法過程為制備的重組Ti質(zhì)粒DNA 0. 1 ug與1 mL感受態(tài)根 癌農(nóng)桿菌混合后置于電激杯，電激轉(zhuǎn)化儀以細(xì)菌轉(zhuǎn)化模式進(jìn)行電激轉(zhuǎn)化。
[0016] 所述步驟2中根癌農(nóng)桿菌篩選與培養(yǎng)過程為將轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌鋪于含卡那 霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培養(yǎng)基上篩選，篩選得到的根癌農(nóng)桿菌在YEB液體 培養(yǎng)基28-30°C搖瓶培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長后期，按1:10接種到擴(kuò)大的培養(yǎng)體系繼續(xù)搖瓶4 h〇
[0017] 所述步驟4中轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株腺毛發(fā)育細(xì)胞情況及青蒿素含量觀察與分析過 程為取轉(zhuǎn)基因黃花蒿幼嫩葉片，置于熒光體視顯微鏡下進(jìn)行熒光顯微觀察，統(tǒng)計(jì)單位葉面 積的腺毛細(xì)胞數(shù)，與對照非轉(zhuǎn)基因黃花蒿比較，可以估測青蒿素含量提高情況。
[0018] 綜上所述，本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供的一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中 青蒿素含量的方法，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將生長素合成酶iaaM基因轉(zhuǎn)入黃花蒿，利用特異性 G12基因啟動(dòng)子保證iaaM基因在黃花蒿腺毛細(xì)胞中特異表達(dá)，促進(jìn)黃花蒿腺毛細(xì)胞發(fā)育和 代謝，從而提高其青蒿素含量。在普通非轉(zhuǎn)化黃花蒿含量為10. 53mg/g DW時(shí)，轉(zhuǎn)iaaM基因 黃花蒿植株中青蒿素的含量最高達(dá)到15. 8mg/g DW，其含量是非轉(zhuǎn)化黃花蒿含量的1. 5倍， 該發(fā)明對于為青蒿素的規(guī)?；a(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)定新藥源具有重要意義。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本 發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0020] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的 條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0021] 實(shí)施例1 : iaaM基因的獲取 從GenBank中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中獲得編碼色氨酸單加氧酶的iaaM基因序列（登 錄號為U83987. 1)，送深圳華大基因公司合成該基因 pMD18-iaaM，并將該基因 pMD18-iaaM 轉(zhuǎn)化至E. coliDH5a中保存。
[0022] 具體操作步驟為： 1) 通過設(shè)計(jì)引入BamH I和Pst I酶切位點(diǎn)的iaaM基因特異性引物 上游引物 iaaMUP :5' -GCGGATCCATGTCAGCCTCATCTCTTCT-3' 下游引物 i aaMDN : 5，-AACTGCAGTTAAITTCTATTGCGGTAGTTATATC-3' 2) 以pMD18-iaaM為模板，iaaMUP和iaaMDN為引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增iaaM基因。PCR 反應(yīng)體系為：pMD-iaaM質(zhì)粒（約 100ng)luL，lOXBuffer 2. 5uL，dNTPs(10mmol/L)luL，MgCl2 (25mmol/L) 1. 5uL，iaaMUP (10umol/L) luL，iaaMDN (10umol/L) luL，TaqDNA 聚合酶（1U/ uL) luL，補(bǔ) ddH20 至 25uL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性 4min，94°C變性 lmin、62°C退火 lmin、 72°C延伸2. 5min、共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min。
[0023] 3 )PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、切膠回收后，用BamH I和Pst I雙酶切，酶 切體系為：iaaM 基因 10uL，10XBuffer Tango 2uL，BamH I (10U/uL) luL，Pst I (10U/uL) luL，補(bǔ)ddH20至20uL。37°C酶切12h，1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段。
[0024] 本實(shí)施例合成的iaaM基因?yàn)橥ㄟ^轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量提供了一 個(gè)重要關(guān)鍵酶基因。
[0025] 實(shí)施例2 : 構(gòu)建iaaM基因在黃花蒿腺毛細(xì)胞特異表達(dá)的載體 從GenBank中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中獲得擬南芥G12基因核心序列（登錄號： L32873. 1)根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計(jì)以下兩條特異性引物： 上游引物為 1G12: 5，-CCCAAGCTTTTTCCTTCACTATACGTCTTCG-3' 下游引物為 2G12: 5' -CGCGGATCCCAAATCCTGTCCCTAGCTAG-3' 對擬南芥基因組DNA擴(kuò)增，獲得G12啟動(dòng)子片段。將iaaM基因與G12基因啟動(dòng)子重組， 克隆到Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)pBI121質(zhì)粒的Hindlll及PstI位點(diǎn)，以NPT-II基因?yàn)檫x擇標(biāo) 記基因，載體以PBI121作為出發(fā)載體進(jìn)行改造和載體構(gòu)建，獲得pBI121-G12-iaaM的重組 Ti質(zhì)粒，提取質(zhì)粒做PRC檢測和酶切驗(yàn)證。
[0026] 本實(shí)施例獲得了 G12啟動(dòng)子片段，將iaaM基因與G12基因啟動(dòng)子重組，構(gòu)建了 iaaM基因在腺毛細(xì)胞特異表達(dá)的載體，保證iaaM基因僅在黃花蒿腺毛細(xì)胞中表達(dá)，從而不 影響植株的整體發(fā)育，提高其青蒿素含量。
[0027] 實(shí)施例3 : 1.工程化根癌農(nóng)桿菌菌株的制備 構(gòu)建的重組Ti質(zhì)粒通過電激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404,電激轉(zhuǎn)化法過程為制備 的重組Ti質(zhì)粒DNA 0. 1 ug與1 mL感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌混合后置于電激杯，電激轉(zhuǎn)化儀以細(xì) 菌轉(zhuǎn)化模式進(jìn)行電激轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌鋪于含卡那霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培養(yǎng)基上篩選，篩選得到的根癌農(nóng)桿菌在YEB液體培養(yǎng)基28°C搖瓶培養(yǎng)過夜 至對數(shù)生長后期，按1:10接種到擴(kuò)大的培養(yǎng)體系繼續(xù)搖瓶4 h。結(jié)果表明，構(gòu)建的iaaM基 因在黃花蒿腺毛細(xì)胞特異表達(dá)的載體已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。
[0028] 2.利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化黃花蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植 株 1) 外植體預(yù)培養(yǎng)：黃花蒿種子經(jīng)消毒后在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽成苗，待苗長至4cm時(shí) 剪取黃花蒿幼苗子葉用于轉(zhuǎn)化； 2) 黃花蒿幼苗子葉與根癌農(nóng)桿菌的共培侵染轉(zhuǎn)化：將黃花蒿幼苗子葉在實(shí)施例3中得 到的培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的根癌農(nóng)桿菌液中侵泡30min ; 3) 誘導(dǎo)愈傷組織：將共培侵染轉(zhuǎn)化后的黃花蒿子葉以消毒后的MS培養(yǎng)液沖洗3遍，轉(zhuǎn) 接到 MS+1% 6-BA+0. 05% NAA+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +500 mg/L 羧芐青霉素 +20 mg/L 卡那霉 素的MSI固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d進(jìn)行誘導(dǎo)抗性愈傷組織； 4) 抗性再生植株的篩選：抗性愈傷組織團(tuán)生長至3_大小，取出葉盤采用無菌吸水紙 吸干其表面多余水分，將葉盤平放到MS+1. 5mg/L 6-BA+0. 05mg/L NAA+500mg/L羧芐青霉素 +20mg/L卡那霉素的MS2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化出芽，具體過程為愈傷組織稍微壓入培養(yǎng)基，溫 度控制在22°C之間，16h/8h進(jìn)行光暗交替培養(yǎng)；35d后誘導(dǎo)出抗性叢生芽，切下帶芽愈傷部 分，插入MS2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至莖分化和長高，待抗性芽生長至5cm后，將其從愈傷組織基 部切下，并將其移入1/2 MS+O. 5mg/L NAA+O. 5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L瓊脂的MS3生根 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其生根，此時(shí)對每一顆陽性苗進(jìn)行編號，溫度控制在22°C之間，16h/8h進(jìn)行 光暗交替培養(yǎng)；根誘導(dǎo)分化14d后，將分化苗移至消毒蛭石中，培養(yǎng)室內(nèi)煉苗7d，然后移栽 至營養(yǎng)土中生長得到轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株。
[0029] 3.轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株的PCR檢測和腺毛細(xì)胞發(fā)育觀察 提取轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株葉片DNA，PCR法進(jìn)行基因擴(kuò)增檢測；并對轉(zhuǎn)基因青蒿腺毛發(fā)育 細(xì)胞情況及青蒿素含量進(jìn)行觀察與分析，具體操作為取轉(zhuǎn)基因黃花蒿幼嫩葉片，置于熒光 體視顯微鏡下進(jìn)行熒光顯微觀察，統(tǒng)計(jì)單位葉面積的腺毛細(xì)胞數(shù)，與對照非轉(zhuǎn)基因黃花蒿 比較，可以估測青蒿素含量提高情況。
[0030] 4.建立轉(zhuǎn)基因黃花高品系 篩選青蒿素含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株，通過組織培養(yǎng)繁殖建立轉(zhuǎn)基因高青蒿 素含量的黃花蒿品系。
[0031] 實(shí)施例4 1.工程化根癌農(nóng)桿菌菌株的制備 構(gòu)建的重組Ti質(zhì)粒通過電激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404,電激轉(zhuǎn)化法過程為制備 的重組Ti質(zhì)粒DNA 0. 1 ug與1 mL感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌混合后置于電激杯，電激轉(zhuǎn)化儀以細(xì) 菌轉(zhuǎn)化模式進(jìn)行電激轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌鋪于含卡那霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培養(yǎng)基上篩選，篩選得到的根癌農(nóng)桿菌在YEB液體培養(yǎng)基30°C搖瓶培養(yǎng)過夜 至對數(shù)生長后期，按1:10接種到擴(kuò)大的培養(yǎng)體系繼續(xù)搖瓶4 h。結(jié)果表明，構(gòu)建的iaaM基 因在黃花蒿腺毛細(xì)胞特異表達(dá)的載體已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。
[0032] 2.利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化黃花蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植 株 1) 外植體預(yù)培養(yǎng)：黃花蒿種子經(jīng)消毒后在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽成苗，待苗長至6cm時(shí) 剪取黃花蒿幼苗子葉用于轉(zhuǎn)化； 2) 黃花蒿幼苗子葉與根癌農(nóng)桿菌的共培侵染轉(zhuǎn)化：將黃花蒿幼苗子葉在實(shí)施例3中得 到的培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的根癌農(nóng)桿菌液中侵泡30min ; 3) 誘導(dǎo)愈傷組織：將共培侵染轉(zhuǎn)化后的黃花蒿子葉以消毒后的MS培養(yǎng)液沖洗3遍，轉(zhuǎn) 接到 MS+1% 6-BA+0. 05% NAA+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +500 mg/L 羧芐青霉素 +20 mg/L 卡那霉 素的MSI固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d進(jìn)行誘導(dǎo)抗性愈傷組織； 4) 抗性再生植株的篩選：抗性愈傷組織團(tuán)生長至4_大小，取出葉盤采用無菌吸水紙 吸干其表面多余水分，將葉盤平放到MS+1. 5mg/L 6-BA+0. 05mg/L NAA+500mg/L羧芐青霉素 +20mg/L卡那霉素的MS2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化出芽，具體過程為愈傷組織稍微壓入培養(yǎng)基，溫 度控制在24°C之間，16h/8h進(jìn)行光暗交替培養(yǎng)；28d后誘導(dǎo)出抗性叢生芽，切下帶芽愈傷部 分，插入MS2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至莖分化和長高，待抗性芽生長至5cm后，將其從愈傷組織基 部切下，并將其移入1/2 MS+0. 5mg/L NAA+O. 5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L瓊脂的MS3生根 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其生根，此時(shí)對每一顆陽性苗進(jìn)行編號，溫度控制在24°C之間，16h/8h進(jìn)行 光暗交替培養(yǎng)；根誘導(dǎo)分化14d后，將分化苗移至消毒蛭石中，培養(yǎng)室內(nèi)煉苗7d，然后移栽 至營養(yǎng)土中生長得到轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株。
[0033] 3.轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株的PCR檢測和腺毛細(xì)胞發(fā)育觀察 提取轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株葉片DNA，PCR法進(jìn)行基因擴(kuò)增檢測；并對轉(zhuǎn)基因青蒿腺毛發(fā)育 細(xì)胞情況及青蒿素含量進(jìn)行觀察與分析，具體操作為取轉(zhuǎn)基因黃花蒿幼嫩葉片，置于熒光 體視顯微鏡下進(jìn)行熒光顯微觀察，統(tǒng)計(jì)單位葉面積的腺毛細(xì)胞數(shù)，與對照非轉(zhuǎn)基因黃花蒿 比較，可以估測青蒿素含量提高情況。
[0034] 4.建立轉(zhuǎn)基因黃花高品系 篩選青蒿素含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株，通過組織培養(yǎng)繁殖建立轉(zhuǎn)基因高青蒿 素含量的黃花蒿品系。
[0035] 實(shí)施例5 1.工程化根癌農(nóng)桿菌菌株的制備 構(gòu)建的重組Ti質(zhì)粒通過電激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404,電激轉(zhuǎn)化法過程為制備 的重組Ti質(zhì)粒DNA 0. 1 ug與1 mL感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌混合后置于電激杯，電激轉(zhuǎn)化儀以細(xì) 菌轉(zhuǎn)化模式進(jìn)行電激轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌鋪于含卡那霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培養(yǎng)基上篩選，篩選得到的根癌農(nóng)桿菌在YEB液體培養(yǎng)基29°C搖瓶培養(yǎng)過夜 至對數(shù)生長后期，按1:10接種到擴(kuò)大的培養(yǎng)體系繼續(xù)搖瓶4 h。結(jié)果表明，構(gòu)建的iaaM基 因在黃花蒿腺毛細(xì)胞特異表達(dá)的載體已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。
[0036] 2.利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化黃花蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植 株 1) 外植體預(yù)培養(yǎng)：黃花蒿種子經(jīng)消毒后在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽成苗，待苗長至5cm時(shí) 剪取黃花蒿幼苗子葉用于轉(zhuǎn)化； 2) 黃花蒿幼苗子葉與根癌農(nóng)桿菌的共培侵染轉(zhuǎn)化：將黃花蒿幼苗子葉在實(shí)施例3中得 到的培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的根癌農(nóng)桿菌液中侵泡30min ; 3) 誘導(dǎo)愈傷組織：將共培侵染轉(zhuǎn)化后的黃花蒿子葉以消毒后的MS培養(yǎng)液沖洗3遍，轉(zhuǎn) 接到 MS+1% 6-BA+0. 05% NAA+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +500 mg/L 羧芐青霉素 +20 mg/L 卡那霉 素的MSI固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d進(jìn)行誘導(dǎo)抗性愈傷組織； 4) 抗性再生植株的篩選：抗性愈傷組織團(tuán)生長至3. 5_大小，取出葉盤采用無菌吸水 紙吸干其表面多余水分，將葉盤平放到MS+1. 5mg/L 6-BA+0. 05mg/L NAA+500mg/L羧芐青霉 素+20mg/L卡那霉素的MS2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化出芽，具體過程為愈傷組織稍微壓入培養(yǎng)基， 溫度控制在23°C之間，16h/8h進(jìn)行光暗交替培養(yǎng)；32d后誘導(dǎo)出抗性叢生芽，切下帶芽愈傷 部分，插入MS2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至莖分化和長高，待抗性芽生長至4cm后，將其從愈傷組織 基部切下，并將其移入1/2 MS+0. 5mg/L ΝΑΑ+0. 5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L瓊脂的MS3生 根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其生根，此時(shí)對每一顆陽性苗進(jìn)行編號，溫度控制在23°C之間，16h/8h進(jìn) 行光暗交替培養(yǎng)；根誘導(dǎo)分化14d后，將分化苗移至消毒蛭石中，培養(yǎng)室內(nèi)煉苗7d，然后移 栽至營養(yǎng)土中生長得到轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株。
[0037] 3.轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株的PCR檢測和腺毛細(xì)胞發(fā)育觀察 提取轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株葉片DNA，PCR法進(jìn)行基因擴(kuò)增檢測；并對轉(zhuǎn)基因青蒿腺毛發(fā)育 細(xì)胞情況及青蒿素含量進(jìn)行觀察與分析，具體操作為取轉(zhuǎn)基因黃花蒿幼嫩葉片，置于熒光 體視顯微鏡下進(jìn)行熒光顯微觀察，統(tǒng)計(jì)單位葉面積的腺毛細(xì)胞數(shù)，與對照非轉(zhuǎn)基因黃花蒿 比較，可以估測青蒿素含量提高情況。
[0038] 4.建立轉(zhuǎn)基因黃花高品系 篩選青蒿素含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株，通過組織培養(yǎng)繁殖建立轉(zhuǎn)基因高青蒿 素含量的黃花蒿品系。
[0039] 以上實(shí)施例利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化黃花蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因 黃花蒿植株。并通過對黃花蒿腺毛細(xì)胞發(fā)育情況進(jìn)行觀察，結(jié)果表明本發(fā)明中轉(zhuǎn)iaaM基因 顯著提高了黃花蒿中青蒿素的含量，轉(zhuǎn)iaaM基因黃花蒿中青蒿素的含量最高可達(dá)15. 8mg/ g DW，是非轉(zhuǎn)化黃花蒿含量的1. 5倍。通過篩選青蒿素含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株， 經(jīng)過組織培養(yǎng)繁殖建立轉(zhuǎn)基因高青蒿素含量的黃花蒿品系，為規(guī)?；a(chǎn)青蒿素提供了一 種可行方法。
[0040] 以上對本發(fā)明所提供的一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法進(jìn)行了 詳細(xì)介紹，本文中對本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于幫 助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思 想，在【具體實(shí)施方式】及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對 本發(fā)明的限制。 〈11〇>趙燕 〈120> -種轉(zhuǎn)iaaM基因提高青蒿中青蒿素含量的方法 <160> 1 <170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211> 2268 <212> DNA 〈213> 根癌農(nóng)桿菌（agrobacterium tumefaciens) <400> 1 atgtcagcct catctcttct tgataaacaa tgcgatcatt tctctaccaa aattgtggat 60 ctgataatgg tcgacaaggc tgatgagttg gaccgccgcg ttgccgcagc cttctcagaa 120 cgagaagctt cgagggaaag aagaattagt caaatttccg gcgagtgcaa cgctgggtta 180 gcttgcaaaa ggctggccga cggtcgcttt ccggagatat cagccggtca gagggtcgca 240 gtcctctccg cttacatcta tgttggcgag gaaattctga ggtggatact cgaaccagaa 300 gcttcggtgc gaacaagagt gagtggtctc gttgccatcg accttgcacc atcttgcatg 360 gatatttcca gagctcaact tctccaaacc atgaatttgc tgagtggtaa aagatgtgca 420 cccagcgacc ttagtcattt cgtggccatt tcaatctctg agactgcccg ctcccgaacc 480 ctgcaaatgg cgccgtacga agaaggctcg ttgaaaagcg ttaccgggtt taccgtaatc 540 attgaagagg cagtaccatt tgacatggta gcttatggtc gaaacctgat gctgaaagcc 600 tcggcagggt cctttccaac gatcgacttg ctctatgact acagattgtt tctcgacaaa 660 tgttccgata gtgggcggat cggcttcttt ccggaagatg ttcccaggcc aaaagtagcg 720 gtcattgggg ctggcatttc cgggctcgtg gtggcaagcg aactgcttca tgctggcgta 780 gacgatgtta caatatatga agcaggtgat cgggttggag gtaagctttg gtcacatgcc 840 ttcaaggacg ctccgggcgt cgtggccgaa atgggggcga tgcgatttcc tcctgctgca 900 tcgtgcttgt ttttcttcct cgagcgatac ggtctgtctt cgatgaggcc gttcccaaat 960 cccggcacag tcgacactga cttggtctac gagggttgcc gatacatgtg gaaagccggg 1020 cagcagccac cgaagttgtt ccatcgcgtt tacagcgggt ggcatgcgtt cttgaaggac 1080 ggtttccttg agggagatat tgtgttggcg tcgcctgatg ctatcactga ggccttgaaa 1140 tcaggggaca ttaggcgggc tcatgactcc tggcaaattt ggctgaaccg tttcgggagg 1200 gagtcgttct cctcagcgat agagaggatc tttctgggca cgcatcctcc tggtggagaa 1260 acatggagtt tccctcatga ttgggaccta ttcaagctaa tgggaatagg atctggcggg 1320 tttggtccag tttttgaaag cgggtttact gagatccttc gcttggtcat aaacggatat 1380 gaagaaaatc agcggatgtg ctctgaagga atctcagaac ttccacgtcg aatagcctct 1440 caagtggtta acggtgtgtc tgtaagccag cgtatacgcc atgttcaagt cagggcgatc 1500 gagaaggaaa agacaaaaat aaagataagg cttaagagcg ggatatcaga actttatgat 1560 aaagtggtgg ttacatctgg actcgcaaat atccaactca ggcattgtct gacatgcgat 1620 accaccattt ttcgtgcacc agtgaaccaa gcggttgata acagccacat gacaggctct 1680 tcaaaactct tcctgctgac tgaacgaaaa ttttggtttg accatatgct cccgtcctgt 1740 gtcctcatgg acgggttcgc aaaagcagtc tattgcctgg actatgagcc gcaggatccg 1800 aacggtaaag gtctggtgct catcagttat acatgggagg acgactccca caagctattg 1860 gcggtccccg acaaaaaaga gagattatgt ctgctgcgtg acgcaatttc aaaatctttc 1920
【權(quán)利要求】
1. 一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1、構(gòu)建iaaM基因在黃花蒿腺毛細(xì)胞特異表達(dá)的載體：將iaaM基因與G12基因啟 動(dòng)子重組，克隆到Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)pBI121質(zhì)粒的Hindlll及PstI位點(diǎn)，以NPT-II基因?yàn)?選擇標(biāo)記基因，載體以PBI121作為出發(fā)載體進(jìn)行改造和載體構(gòu)建，獲得pBI121-G12-iaaM 的重組Ti質(zhì)粒，提取重組Ti質(zhì)粒做PCR檢測和酶切驗(yàn)證； 步驟2、工程化根癌農(nóng)桿菌菌株的制備：構(gòu)建的重組Ti質(zhì)粒通過電激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化根 癌農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌經(jīng)過篩選、培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，所述的根癌農(nóng)桿菌為 LBA4404 ； 步驟3、利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化黃花蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植 株，具體包括以下步驟： 1) 外植體預(yù)培養(yǎng)：黃花蒿種子經(jīng)消毒后在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽成苗，待苗長至4-6cm時(shí) 剪取黃花蒿幼苗子葉用于轉(zhuǎn)化； 2) 黃花蒿幼苗子葉與根癌農(nóng)桿菌的共培侵染轉(zhuǎn)化：將黃花蒿幼苗子葉在培養(yǎng)至對數(shù)生 長后期的根癌農(nóng)桿菌液中侵泡30min ; 3) 誘導(dǎo)愈傷組織：將共培侵染轉(zhuǎn)化后的黃花蒿子葉以消毒后的MS培養(yǎng)液沖洗3遍，轉(zhuǎn) 接到 MS+1% 6-BA+0. 05% NAA+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +500 mg/L 羧芐青霉素 +20 mg/L 卡那霉 素的MSI固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d進(jìn)行誘導(dǎo)抗性愈傷組織； 4) 抗性再生植株的篩選：抗性愈傷組織團(tuán)生長至3-4_大小，取出葉盤采用無菌吸水 紙吸干其表面多余水分，將葉盤平放到MS+1. 5mg/L 6-BA+0. 05mg/L NAA+500mg/L羧芐青霉 素+20mg/L卡那霉素的MS2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化出芽，具體過程為愈傷組織稍微壓入培養(yǎng)基， 溫度控制在22-24°C之間，16h/8h進(jìn)行光暗交替培養(yǎng)；28-35d后誘導(dǎo)出抗性叢生芽，切下 帶芽愈傷部分，插入MS2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至莖分化和長高，待抗性芽生長至3-5cm后，將其 從愈傷組織基部切下，并將其移入1/2 MS+0. 5mg/L NAA+0. 5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L瓊 脂的MS3生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其生根，此時(shí)對每一顆陽性苗進(jìn)行編號，溫度控制在22-24°C之 間，16h/8h進(jìn)行光暗交替培養(yǎng)；根誘導(dǎo)分化14d后，將分化苗移至消毒蛭石中，培養(yǎng)室內(nèi)煉 苗7d，然后移栽至營養(yǎng)土中生長得到轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株； 步驟4、轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株的PCR檢測和腺毛細(xì)胞發(fā)育觀察：提取轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株葉 片DNA，PCR法進(jìn)行基因擴(kuò)增檢測，并對轉(zhuǎn)基因黃花蒿腺毛發(fā)育細(xì)胞情況及青蒿素含量進(jìn)行 觀察與分析； 步驟5、建立轉(zhuǎn)基因黃花蒿品系：篩選青蒿素含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株，通過 組織培養(yǎng)繁殖建立轉(zhuǎn)基因高青蒿素含量的黃花蒿品系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征 在于，所述步驟1中G12基因啟動(dòng)子獲得途徑為：從GenBank中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中獲 得擬南芥G12基因核心序列，根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計(jì)兩條特異性引物，對擬南芥基因組DNA 擴(kuò)增，獲得G12基因啟動(dòng)子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在 于，所述步驟2中電激轉(zhuǎn)化法過程為制備的重組Ti質(zhì)粒DNA 0. 1 ug與1 mL感受態(tài)根癌農(nóng) 桿菌混合后置于電激杯，電激轉(zhuǎn)化儀以細(xì)菌轉(zhuǎn)化模式進(jìn)行電激轉(zhuǎn)化。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在 于，所述步驟2中根癌農(nóng)桿菌篩選與培養(yǎng)過程為將轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌鋪于含卡那霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培養(yǎng)基上篩選，篩選得到的根癌農(nóng)桿菌在YEB液體培養(yǎng)基 28-30°C搖瓶培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長后期，按1:10接種到擴(kuò)大的培養(yǎng)體系繼續(xù)搖瓶4 h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在 于，所述步驟4中轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株腺毛發(fā)育細(xì)胞情況及青蒿素含量觀察與分析過程為取 轉(zhuǎn)基因黃花蒿幼嫩葉片，置于熒光體視顯微鏡下進(jìn)行熒光顯微觀察，統(tǒng)計(jì)單位葉面積的腺 毛細(xì)胞數(shù)，與對照非轉(zhuǎn)基因黃花蒿比較，可以估測青蒿素含量提高情況。
【文檔編號】A01H5/00GK104059940SQ201410278312
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】趙燕, 荊風(fēng)雪, 張學(xué)文, 傅瑤, 宋南, 劉愛云 申請人:趙燕