一種四倍體金線蓮的培育方法
【專利摘要】一種四倍體金線蓮的培育方法，本發(fā)明包括金線蓮（Anoectochilusroxburghii）人工授粉、非共生萌發(fā)、誘變劑處理、壯苗培養(yǎng)和試管苗移栽等各階段。金線蓮開花后采取人工方法授粉，將成熟的金線蓮蒴果經(jīng)消毒后切開把種胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成原球莖，然后轉(zhuǎn)入含有誘變劑的液體分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘變處理，再接種到壯苗培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，最后進(jìn)行試管苗移栽。本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，誘變頻率達(dá)到75%以上，同時(shí)也可大幅度提高金線蓮的藥材產(chǎn)量，為金線蓮多倍體育種、遺傳改良和新品種培育開辟了一條新途徑。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物新品種的培育方法，具體地說，涉及一種四倍體金線蓮的培育方 法。 一種四倍體金線蓮的培育方法

【背景技術(shù)】
[0002] 金線蓮riar/wrgAii)，即花葉開唇蘭，另lj名金線蓮、金石松、虎頭 蕉、鳥人參等，為蘭科開唇蘭屬珍稀藥用植物。金線蓮是我國(guó)傳統(tǒng)珍貴藥材，由于其治療面 廣、療效獨(dú)特，有"神藥"之稱，享有"藥王"等美譽(yù)。
[0003] 染色體是決定生物個(gè)體性狀基因的載體，染色體加倍以后的植株與親本之間會(huì)產(chǎn) 生形態(tài)及性狀上的變化，其中巨大性是多倍體最為顯著的外部形態(tài)特征。與此同時(shí)，植物染 色體倍性的變化也往往會(huì)導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物含量變化。中藥材是一類具有特殊用途的經(jīng)濟(jì) 植物，一般以其根、莖、葉等器官為收獲對(duì)象。多倍體植物中的染色體加倍，往往表現(xiàn)出植株 的巨大性，能較好地滿足中藥生產(chǎn)的需求。金線蓮植株矮小、生長(zhǎng)慢、生境苛刻，若能將其培 育為多倍體并固定下來，則可能提高其藥用價(jià)值，同時(shí)為選育優(yōu)質(zhì)金線蓮提供珍貴的原始 材料。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種四倍體金線蓮的培育方法，通過人工授粉、非共生萌 發(fā)、誘變劑處理、壯苗培養(yǎng)和試管苗移栽等各階段，以秋水仙堿和氟樂靈混合液作為多倍體 誘變劑處理金線蓮類原球莖，提高了誘變率，處理一次即可獲得數(shù)量可觀的四倍體金線蓮， 從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005] 本發(fā)明的一種四倍體金線蓮的培育方法，包括以下的步驟： (1)人工授粉：按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，選定株系優(yōu)良的金線蓮植株作為親本，在金 線蓮開花后進(jìn)行異花授粉。
[0006] (2)非共生萌發(fā)：在金線蓮蒴果發(fā)育基本成熟而果實(shí)未開裂時(shí)，經(jīng)75%?80%的酒 精溶液消毒2?5分鐘后,用無(wú)菌水沖洗2?5次后置于0. 1%升萊溶液消毒8?15分鐘， 經(jīng)無(wú)菌水沖洗2?5次后用無(wú)菌濾紙吸干，然后用無(wú)菌解剖刀沿蒴果縱軸方向?qū)⑤艄虚_， 用接種針將黃色種胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)20?30天后種子萌發(fā)成原球莖。
[0007] (3)誘變劑處理：將非共生萌發(fā)開成的原球莖轉(zhuǎn)入含有誘變劑的液體分化培養(yǎng)基 中，在25?28°C條件下進(jìn)行間歇振蕩誘變處理240?480小時(shí)。
[0008] (4)壯苗培養(yǎng)：將經(jīng)誘變處理的金線蓮原球莖接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)一步形 成5?8cm高的帶根小苗。
[0009] (5)試管苗移栽：將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗 從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和松樹皮（1 :3)混合成的基質(zhì)中并按常 規(guī)的二倍體金線蓮進(jìn)行大田栽培管理。
[0010] 上述（2)?（4)各步驟中的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25?30°C，每天光照10? 15小時(shí)，光照強(qiáng)度1500?20001x。
[0011] 上述步驟（2)所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為：0. 5?2. Og/L花寶1號(hào)+0. 2?2. Og/L蛋白 胨+100?200ml/L椰子汁+20?35g/L蔗糖+3. 0?7. Og/L瓊脂+0· 3?1. Og/L活性炭， 其余為MS培養(yǎng)基的有機(jī)物成分，pH為5. 4?5. 8 ; 上述步驟（3)所述的液體分化培養(yǎng)基為：l/2MS+0. 2?1. 2mg/L 6-BA+0. 1?0. 6mg/L NAA+20?35g/L蔗糖+0· 2?2. Og/L蛋白胨+0· 1?0· 5g/L酸性水解酪蛋白+0· 3?1. 0g/ L活性炭，pH為5. 4?5. 8; 上述步驟（3)所述的誘變劑為0. 01%?0. 05%秋水仙堿（olchicine) +0. 01%?0. 03% 氟樂靈（trifluralin)的混合液； 上述步驟（4)所述的壯苗培養(yǎng)基為：0. 5?2. 0g/L花寶1號(hào)+0. 5?2. 0g/L花寶2號(hào) +0· 5?L 5mg/LNAA+0. 2?2. 0g/L蛋白胨+0· 1?0· 5g/L酸性水解酪蛋白+20?35g/L蔗 糖+3. 0?7. 0g/L瓊脂+0. 3?1. 0g/L活性炭，其余為MS培養(yǎng)基的有機(jī)物成分，pH為5. 4? 5. 8 ； 上述步驟（5)所述的試管苗為經(jīng)染色體計(jì)數(shù)后選取染色體數(shù)目為2n=80的試管苗。
[0012] 本發(fā)明具有的特點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于金線蓮多倍體離體誘導(dǎo)有少量報(bào)道，但技術(shù)還 不夠成熟，而本發(fā)明具有簡(jiǎn)單、易行、誘變率高的特點(diǎn)。本發(fā)明處理一次即可獲得數(shù)量可觀 的四倍體金線蓮，可以為金線蓮遺傳育種提供親本材料，也為金線蓮的新品種培育提供新 的思路。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0014] 實(shí)施例1 1、 品種來源 福建產(chǎn)組培苗經(jīng)大田栽培2年后的優(yōu)質(zhì)金線蓮； 2、 培育過程 (1)人工授粉：按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，金線蓮開花進(jìn)行異花授粉后120天蒴果成 熟。
[0015] (2)非共生萌發(fā)：在金線蓮蒴果發(fā)育基本成熟而未開裂時(shí)，經(jīng)75%的酒精溶液消毒 3分鐘后，用無(wú)菌水沖洗2次后置于0. 1%升汞溶液消毒8分鐘，經(jīng)無(wú)菌水沖洗2次后用無(wú)菌 濾紙吸干，然后用無(wú)菌解剖刀沿蒴果縱軸方向?qū)⑤艄虚_，用接種針將黃色種胚接種到萌 發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)23天后種子萌發(fā)成原球莖。所采用的萌發(fā)培養(yǎng)基為：1. 5g/L花寶1 號(hào)+1. 0g/L蛋白胨+200ml/L椰子汁+25g/L蔗糖+4. 5g/L瓊脂+0. 5g/L活性炭，其余為MS 培養(yǎng)基的有機(jī)物成分，pH為5. 6。
[0016] (3)誘變劑處理：將非共生萌發(fā)開成的原球莖轉(zhuǎn)入含有0. 02%秋水仙堿和0. 01%氟 樂靈混合液的液體分化培養(yǎng)基中，在28°C條件下進(jìn)行間歇振蕩誘變處理240小時(shí)，經(jīng)染色 體計(jì)數(shù)，四倍體誘導(dǎo)率為72%。所采用的液體分化培養(yǎng)基為：1/2MS+1. 2mg/L 6-BA+O. 4mg/L NAA+25g/L蔗糖+1. 0g/L蛋白胨+0. 5g/L酸性水解酪蛋白+0. 3g/L活性炭，pH為5. 6。
[0017] (4)壯苗培養(yǎng)：將經(jīng)誘變處理的金線蓮原球莖接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)一步形 成5?8cm高的帶根小苗。所采用的壯苗培養(yǎng)基為：1. 0g/L花寶1號(hào)+1. 0g/L花寶2號(hào) +0· 5mg/LNAA+2. Og/L 蛋白胨 +0· 5g/L 酸性水解酪蛋白 +35g/L 蔗糖 +3. Og/L 瓊脂 +1. Og/L 活性炭，其余為MS培養(yǎng)基的有機(jī)物成分，pH為5. 6. (5)試管苗移栽：將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶 中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和松樹皮（1 :3)混合成的基質(zhì)中并按常規(guī)的二倍 體金線蓮進(jìn)行大田栽培管理，四倍體金線蓮成活率達(dá)92%。
[0018] 上述（2)?（4)各步驟中的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度28°C，每天光照13小時(shí)，光照 強(qiáng)度 15001x。
[0019] 實(shí)施例二 1、 品種來源 臺(tái)灣產(chǎn)組培苗經(jīng)大田栽培1年后的優(yōu)質(zhì)金線蓮； 2、 培育過程 (1)人工授粉：按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，金線蓮開花進(jìn)行異花授粉后110天蒴果成 熟。
[0020] (2)非共生萌發(fā)：在金線蓮蒴果發(fā)育基本成熟而未開裂時(shí)，經(jīng)78%的酒精溶液消毒 2分鐘后，用無(wú)菌水沖洗5次后置于0. 1%升汞溶液消毒10分鐘，經(jīng)無(wú)菌水沖洗3次后用無(wú) 菌濾紙吸干，然后用無(wú)菌解剖刀沿蒴果縱軸方向?qū)⑤艄虚_，用接種針將黃色種胚接種到 萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后種子萌發(fā)成原球莖。所采用的萌發(fā)培養(yǎng)基為：1. Og/L花寶 1號(hào)+2. Og/L蛋白胨+100ml/L椰子汁+25g/L蔗糖+6. Og/L瓊脂+0. 3g/L活性炭，其余為 MS培養(yǎng)基的有機(jī)物成分，pH為5. 8。
[0021] (3)誘變劑處理：將非共生萌發(fā)開成的原球莖轉(zhuǎn)入含有0. 01%秋水仙堿和0. 03%氟 樂靈混合液的液體分化培養(yǎng)基中，在25°C條件下進(jìn)行間歇振蕩誘變處理360小時(shí)，經(jīng)染色 體計(jì)數(shù)，四倍體誘導(dǎo)率為74%。所采用的液體分化培養(yǎng)基為：l/2MS+0. 4mg/L 6-BA+O. 2mg/L NAA+25g/L蔗糖+2. 0g/L蛋白胨+0. 5g/L酸性水解酪蛋白+0. 5g/L活性炭，pH為5. 8。
[0022] (4)壯苗培養(yǎng)：將經(jīng)誘變處理的金線蓮原球莖接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)一步形 成5?8cm高的帶根小苗。所采用的壯苗培養(yǎng)基為：1.5g/L花寶1號(hào)+1. 0g/L花寶2號(hào) +1. 5mg/LNAA+l. 0g/L 蛋白胨 +0· 3g/L 酸性水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖 +3. 0g/L 瓊脂 +1. 0g/L 活性炭，其余為MS培養(yǎng)基的有機(jī)物成分，pH為5. 8. (5)試管苗移栽：將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶 中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和松樹皮（1 :3)混合成的基質(zhì)中并按常規(guī)的二倍 體金線蓮進(jìn)行大田栽培管理，四倍體金線蓮成活率達(dá)95%。
[0023] 上述（2)?（4)各步驟中的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25°C，每天光照10小時(shí)，光照 強(qiáng)度 20001x。
[0024] 實(shí)施例三 1、 品種來源 廣西產(chǎn)組培苗經(jīng)大田栽培1. 5年后的優(yōu)質(zhì)金線蓮； 2、 培育過程 (1)人工授粉：按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，金線蓮開花進(jìn)行異花授粉后95天蒴果成熟。
[0025] (2)非共生萌發(fā)：在金線蓮蒴果發(fā)育基本成熟而未開裂時(shí)，經(jīng)80%的酒精溶液消毒 4分鐘后，用無(wú)菌水沖洗3次后置于0. 1%升汞溶液消毒15分鐘，經(jīng)無(wú)菌水沖洗5次后用無(wú)
【權(quán)利要求】
1. 一種四倍體金線蓮的培育方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 人工授粉：按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，選定株系優(yōu)良的金線蓮植株作為親本，在金 線蓮開花后進(jìn)行異花授粉； (2) 非共生萌發(fā)：在金線蓮蒴果發(fā)育基本成熟而果實(shí)未開裂時(shí)，經(jīng)75%?80%的酒精溶 液消毒2?5分鐘后，用無(wú)菌水沖洗2?5次后置于0. 1%升汞溶液消毒8?15分鐘，經(jīng)無(wú) 菌水沖洗2?5次后用無(wú)菌濾紙吸干，然后用無(wú)菌解剖刀沿蒴果縱軸方向?qū)⑤艄虚_，用接 種針將黃色種胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)20?30天后種子萌發(fā)成原球莖； (3) 誘變劑處理：將非共生萌發(fā)開成的原球莖轉(zhuǎn)入含有誘變劑的液體分化培養(yǎng)基中，在 25?28°C條件下進(jìn)行間歇振蕩誘變處理240?480小時(shí)； (4) 壯苗培養(yǎng)：將經(jīng)誘變處理的金線蓮原球莖接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)一步形成 5?8cm高的帶根小苗； (5) 試管苗移栽：將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培 養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和松樹皮（1 :3)混合成的基質(zhì)中并按常規(guī)的 二倍體金線蓮進(jìn)行大田栽培管理； 上述（2)?（4)各步驟中的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25?30°C，每天光照10?15小 時(shí)，光照強(qiáng)度1500?20001x。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種四倍體金線蓮的培育方法，其特征在于步驟（2)所述 的萌發(fā)培養(yǎng)基為：〇. 5?2. Og/L花寶1號(hào)+0. 2?2. Og/L蛋白胨+100?200ml/L椰子汁 +20?35g/L蔗糖+3. 0?7. Og/L瓊脂+0. 3?1. Og/L活性炭，其余為MS培養(yǎng)基的有機(jī)物 成分，pH為5. 4?5. 8。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種四倍體金線蓮的培育方法，其特征在于步驟（3)所述 的液體分化培養(yǎng)基為：l/2MS+0. 2 ?1. 2mg/L 6-BA+0. 1 ?0. 6mg/L NAA+20 ?35g/L 蔗糖 +0· 2?2. Og/L蛋白胨+0· 1?0· 5g/L酸性水解酪蛋白+0· 3?1. Og/L活性炭，pH為5. 4? 5. 8〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種四倍體金線蓮的培育方法，其特征在于步驟（3)所述的 誘變劑為 〇· 01% ?〇· 05% 秋水仙堿（olchicine)+0· 01% ?0· 03% 氟樂靈（trifluralin)的 混合液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種四倍體金線蓮的培育方法，其特征在于步驟（4)所述的 壯苗培養(yǎng)基為：〇· 5?2. 0g/L花寶1號(hào)+0· 5?2. 0g/L花寶2號(hào)+0· 5?1. 5mg/LNAA+0. 2? 2. 0g/L蛋白胨+0· 1?0· 5g/L酸性水解酪蛋白+20?35g/L蔗糖+3. 0?7. 0g/L瓊脂 +0. 3?1. 0g/L活性炭，其余為MS培養(yǎng)基的有機(jī)物成分，pH為5. 4?5. 8。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種四倍體金線蓮的培育方法，其特征在于步驟（5)所述的 試管苗為經(jīng)染色體計(jì)數(shù)后選取染色體數(shù)目為2n=80的試管苗。
【文檔編號(hào)】A01H1/02GK104082123SQ201410297284
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月28日
【發(fā)明者】梁鈞淞, 莫昭展, 甘耀坤, 梁林英, 梁曉菊, 潘潔明, 嚴(yán)翠瓊, 張燕飛, 吳鳳娟 申請(qǐng)人:玉林師范學(xué)院