一種龍膽的組織培養(yǎng)快速繁殖方法
【專利摘要】一種龍膽的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)取龍膽為開裂果實(shí)作為外植體進(jìn)行消毒；(2)將消毒后的外植體在超凈工作臺撥開，將種子抖落到MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)發(fā)芽得到無菌試管苗；(3)將所述無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中進(jìn)行試管苗快速繁殖培養(yǎng)獲得叢生芽；(4)將所述叢生芽置于MS生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到完整的帶根苗；(5)取完整的帶根苗進(jìn)行煉苗后移植于苗床生長一個月，再移栽至大田。采用本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法得到的龍膽叢生芽增殖系數(shù)達(dá)到15-20倍，獲得的組培苗生根率達(dá)到99.5％，移栽苗床成活率達(dá)到98％，有效解決了龍膽的規(guī)?；鐔栴}。
【專利說明】一種龍膽的組織培養(yǎng)快速繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物繁殖方法，特別是一種龍膽的組織培養(yǎng)快速繁殖方法。

【背景技術(shù)】
[0002]龍膽，拉丁學(xué)名Gentiana scabra Bunge,也稱龍膽草,膽草、草龍膽、山龍膽，為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，為藥材龍膽草的基源植物之一，以根與根莖入藥，具有清肝膽、瀉下焦?jié)駸岬裙π?，主要用于治療能治頭脹頭疼、目赤腫疼、濕熱黃疸、小便淋疼、陰腫陰癢、帶下、抽搐、驚風(fēng)等疾病。現(xiàn)代研究認(rèn)為其主要有效成分為龍膽苦苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、耐缺氧，以及抗疲勞等作用。
[0003]龍膽草是我國大宗常用中藥材，市場需求量大，長期供不應(yīng)求，在過去三十幾年一直列入國家和省管理的統(tǒng)配品種，但鮮有人工種植，主要來源于野生資源。近年來，由于亂墾、亂牧、亂采挖致使野生資源遭到嚴(yán)重破壞，藥材的蘊(yùn)藏量越來越少，野生資源趨于枯竭，可能有絕種的危險，因此于1989年被列入國家重點(diǎn)發(fā)展的保護(hù)品種，是重點(diǎn)推薦發(fā)展的63種緊缺中藥材之一。為了保護(hù)珍貴的野生資源，促進(jìn)龍膽的可持續(xù)發(fā)展，滿足市場的需求，需要加快推進(jìn)龍膽的中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程，尋找更加快速的繁苗方法，以推動人工種植的發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種龍膽的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，它能夠提高龍膽種苗的繁殖速度和質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)龍膽優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化育苗，以滿足生產(chǎn)上的需要。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的:一種龍膽的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0006](I)外植體的選擇與消毒:取龍膽的成熟為開裂果實(shí)作為外植體，依次用2%洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15-30min、添加了 2_3滴吐溫-20的100毫升0.1%升汞消毒10-12min、無菌水沖洗3_5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經(jīng)高壓滅菌的蒸餾水；
[0007](2)種子萌發(fā)獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體在超凈工作臺上剝開，將種子抖落到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001uX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養(yǎng)30天，種子發(fā)芽后獲得無菌試管苗，其中MS培養(yǎng)基中含0.2mg/L的芐基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0008](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001uX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養(yǎng)30天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基中含0.5-2.5mg/L的芐基腺嘌呤6-BA、0.1-0.3mg/L的吲哚乙酸IAA、0.0-0.2mg/L的激動素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8 ；
[0009](4)叢生芽生根培養(yǎng):將步驟(3)中得到的叢生芽切成帶頂芽或葉芽的莖段，置于1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時間為12-14小時/天的條件下培養(yǎng)30天得到帶根的完整植株，其中1/2MS生根培養(yǎng)基中含0.1-0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.3mg/L的生根粉ABT、0_0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊月旨，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ；
[0010](5)煉苗與移栽:步驟(4)獲得帶根的完整植株后，在室溫為25°C的室內(nèi)打開瓶蓋，在瓶中加入少量自來水，煉苗2-4天，表面角質(zhì)形成后將苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，立即移栽到苗床中，在苗床中生長一個月后移栽大田。
[0011]移栽后一個星期內(nèi)，每天早8點(diǎn)到晚6點(diǎn)噴霧3-5次，每次lOmin，此后每天早8點(diǎn)、晚6點(diǎn)各噴霧I次，每次1min ;移栽時的溫度條件為20_28°C，相對濕度75-80%，遮陽率為60%。
[0012]本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于:
[0013](I)采用組織培養(yǎng)技術(shù)繁育龍膽種苗具有繁殖速度快、種苗質(zhì)量均一，且不受時間、空間、季節(jié)限制等突出優(yōu)點(diǎn)，縮短了種苗繁育周期，提高了種苗質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，滿足生產(chǎn)上的需要。
[0014](2)在本發(fā)明所述的培養(yǎng)體系上得到的龍膽叢生芽增殖系數(shù)達(dá)到15-20倍，叢生芽健康粗壯，無玻璃化現(xiàn)象，接種到含有生根粉吲哚乙酸IAA、生根粉ABT的1/2MS生根培養(yǎng)基上，獲得的組培苗生根率達(dá)到99.5%，煉苗后移栽苗床成活率達(dá)到98%。

【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說明。
[0016]本發(fā)明所述的龍膽的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0017](I)外植體的選擇與消毒:取龍膽的成熟為開裂果實(shí)作為外植體，依次用2%洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15-30min、添加了 2_3滴吐溫-20的100毫升0.1%升汞消毒10-12min、無菌水沖洗3_5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經(jīng)高壓滅菌的蒸餾水。
[0018](2)種子萌發(fā)獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體在超凈工作臺上剝開，將種子抖落到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001uX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養(yǎng)30天，種子發(fā)芽后獲得無菌試管苗，其中MS培養(yǎng)基中含0.2mg/L的芐基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0019](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001uX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養(yǎng)30天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基中含表1所列的不同濃度的芐基腺嘌呤6-BA、吲哚乙酸IAA、和激動素KT,以及30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。由表1的結(jié)果看出，芐基腺嘌呤6-BA對龍膽叢生芽的亞增殖倍率具有顯著影響，隨著芐基腺嘌呤6-BA濃度的增加，亞增殖倍率迅速增加。三種激素對龍膽亞增殖倍率的影響順序?yàn)锳>C>B，最佳配比為A3B2C3，即MS培養(yǎng)基中添加2.5mg/L的芐基腺嘌呤6_BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA和0.2mg/L的激動素KT增殖效果最好，增殖倍率達(dá)到20倍以上。
[0020]表1不同激素對龍膽組織培養(yǎng)快速繁殖效果的影響
[0021]

【權(quán)利要求】
1.一種龍膽的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)外植體的選擇與消毒:取龍膽的成熟為開裂果實(shí)作為外植體，依次用2%洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15-30min、添加了 2_3滴吐溫-20的100毫升0.1%升汞消毒10-12min、無菌水沖洗3_5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經(jīng)高壓滅菌的蒸餾水， (2)種子萌發(fā)獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體在超凈工作臺上剝開，將種子抖落到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001uX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養(yǎng)30天，種子發(fā)芽后獲得無菌試管苗，其中MS培養(yǎng)基中含0.2mg/L的芐基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8， (3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001UX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養(yǎng)30天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基中含0.5-2.5mg/L的芐基腺嘌呤6_BA、0.1-0.3mg/L的吲哚乙酸IAA、0.0-0.2mg/L的激動素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為 5.8， (4)叢生芽生根培養(yǎng):將步驟(3)中得到的叢生芽切成帶頂芽或葉芽的莖段，置于1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時間為12-14小時/天的條件下培養(yǎng)30天得到帶根的完整植株，其中1/2MS生根培養(yǎng)基中含0.1-0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.3mg/L的生根粉ABT、0_0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊月旨，培養(yǎng)基的pH值 為5.8， (5)煉苗與移栽:步驟(4)獲得帶根的完整植株后，在室溫為25°C的室內(nèi)打開瓶蓋，在瓶中加入少量自來水，煉苗2-4天，表面角質(zhì)形成后將苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，立即移栽到苗床中，在苗床中生長一個月后移栽大田。
【文檔編號】A01H4/00GK104067939SQ201410299280
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】韋坤華, 李林軒, 繆劍華, 韋瑩, 李翠, 劉凡, 韋范, 黃寶優(yōu), 林偉 申請人:廣西壯族自治區(qū)藥用植物園