一種與植物低氮耐性相關(guān)的ton1蛋白及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與植物低氮耐性相關(guān)的TON1蛋白及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用。該蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能提高植物低氮耐性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的蛋白具有提高植物低氮耐性的功能，該蛋白在植物育種方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種與植物低氮耐性相關(guān)的T0N1蛋白及其相關(guān)生物材料 與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種與植物低氮耐性相關(guān)的T0N1蛋白及其 相關(guān)生物材料與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 氮是一種在植物生長和發(fā)育中需求量最大的礦質(zhì)營養(yǎng)元素，植物干物質(zhì)和植株全 氮中的含氮量分別為1. 5% -2%和16%。元素氮對作物生長起著非常重要的作用，它是植 物體內(nèi)氨基酸的組成部分、是構(gòu)成蛋白質(zhì)的成分，也是植物進(jìn)行光合作用起決定作用的葉 綠素的組成部分。施用氮肥不僅能提高農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量，還能提高農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量。
[0003] 20世紀(jì)下半葉，為了提高作物的生產(chǎn)率，主要高產(chǎn)作物對氮肥和其它營養(yǎng)的需求 大幅提升，導(dǎo)致了全球氮肥用量提高了十倍。然而植物對氮肥的吸收利用遠(yuǎn)小于其施用量 的一半，大部分的氮肥由于N 2和NH3等氣體的揮發(fā)以及硝化反硝化脫氮、淋溶等被浪費(fèi)。而 且氮肥現(xiàn)今已成為作物生產(chǎn)所需的最主要成本，還會在較大程度上影響農(nóng)民的收入。因此 如何讓植物能更高效的利用氮肥成為了亟待解決的問題。
[0004] 水稻是人類最主要的糧食作物，全世界約有一半人口以水稻作為主食，其產(chǎn)量和 能量的供應(yīng)在所有重要的谷物中是最高的。通過選育優(yōu)良品種及改良栽培制度，水稻的生 產(chǎn)能力在一定程度上得到了提高，但由于在品質(zhì)和抗性等方面一直沒有取得較大突破，使 得水稻的生產(chǎn)水平長期徘徊不前。Rangel和Tanksley等指出育種資源狹窄是造成這一現(xiàn) 象的根本原因之一。因此，當(dāng)前作物育種急需發(fā)掘新基因，以拓寬遺傳基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與植物低氮耐性相關(guān)的T0N1蛋白及其相關(guān)生物材 料與應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0007] a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008] b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與植物低氮耐性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明所提供的所述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料，為下述B1)至B6)中的任一種： [0010] B1)編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子；
[0011] B2)含有B1)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0012] B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0013] B4)含有B1)所述核酸分子的重組質(zhì)粒、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組質(zhì)粒；
[0014] B5)含有B1)所述核酸分子的重組菌、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組菌、或含有 B3)所述重組載體的重組菌；
[0015] B6)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞系、或含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
[0016] 上述相關(guān)生物材料中，B1)所述核酸分子為如下1)或2)所示的基因：
[0017] 1)其編碼序列是序列表中序列2的第52-600位核苷酸的DNA分子；
[0018] 2)核苷酸序列是序列表中序列2的DNA分子。
[0019] 上述蛋白質(zhì)、或上述相關(guān)生物材料在提高植物低氮耐性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0020] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0021] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：使上述蛋白質(zhì)在出發(fā)植 物中過表達(dá)，進(jìn)而使植物的低氮耐性提高。
[0022] 上述過程中，所述使上述蛋白質(zhì)在出發(fā)植物中過表達(dá)的方法為：向出發(fā)植物中導(dǎo) 入上述蛋白質(zhì)的編碼基因，得到轉(zhuǎn)基因植物；轉(zhuǎn)基因植物與出發(fā)植物相比，低氮耐性提高。
[0023] 上述過程中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)所示的基因：
[0024] 1)其編碼序列是序列表中序列2的第52-600位核苷酸的DNA分子；
[0025] 2)核苷酸序列是序列表中序列2的DNA分子。
[0026] 上述過程中，所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為 水稻。
[0027] 上述過程中，所述耐低氮體現(xiàn)在如下方面中的至少一種：
[0028] (1)轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的株高高；
[0029] (2)轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的苗干重高；
[0030] (3)轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的苗高高；
[0031] (4)轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的根長長；
[0032] (5)轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的整個(gè)植株中的氮濃度高；
[0033] (6)轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的整個(gè)植物體內(nèi)的總氮量高。
[0034] 擴(kuò)增上述T0N1基因全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。引物序 列如下：序列表中序列3和序列表中序列4。
[0035] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的蛋白具有提高植物低氮耐性的功能，該蛋白在植 物育種方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1為基因 T0N1在低氮處理2h后特青以及HL105的相對表達(dá)量比較。
[0037] 圖2為在轉(zhuǎn)基因植株Oel和空載體對照1300中的表達(dá)水平比較。
[0038] 圖3為低氮處理后轉(zhuǎn)基因植株Oel和空載體對照1300的表型對比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0040] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041] 以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
[0042] 實(shí)施例1、水稻耐低氮相關(guān)蛋白T0N1及基因的發(fā)現(xiàn)
[0043] 以水稻滲入系HL105及對照親本特青為材料進(jìn)行（芯片為Affimetrix公司的水 稻全基因組芯片）雜交，并在芯片數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合比較基因組學(xué)進(jìn)行分析，篩選耐 低氮相關(guān)基因，經(jīng)過基因組比較和耐低氮性的相關(guān)性分析，最后獲得耐低氮基因 T0N1，經(jīng)低 氮（-N，0. 24mM ΝΗ4Ν03)處理2小時(shí)后，T0N1基因在特青中的表達(dá)量變化不明顯（圖1)，而 在HL105中的表達(dá)量明顯降低，是氮誘導(dǎo)基因。
[0044] 實(shí)施例2、T0N1轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及其鑒定
[0045] 一、T0N1植物過表達(dá)載體的構(gòu)建
[0046] 1、RNA提?。禾崛〗?jīng)低氮（-N，0. 24mM ΝΗ4Ν03)處理2小時(shí)后的特青苗期總RNA，以 此RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。
[0047] 2、引物設(shè)計(jì)：引物兩端分別引入限制性內(nèi)切酶ΚρηΙ和Spel識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基。 引物序列如下：
[0048] T0Nl-0e F: 5' -ATGGTACCATGGCGTCAGCTCCGGCCGC-3'（序列表中序列 3);
[0049] T0Nl-0e R: 5' -ATACTAGTTCATGGGCAGAAGACGACTC-3'（序列表中序列 4)。
[0050] 3、RT-PCR擴(kuò)增：采用引物T0Nl-0e F和T0Nl-0e R，以上述cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。反應(yīng)結(jié)束后，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化DNA片段后進(jìn)行測 序。
[0051] 測序結(jié)果得到的DNA序列為序列表中序列2所示的第52-600位脫氧核苷酸序列。
[0052] 4、載體的構(gòu)建：將PBI121(Promega公司）上的35S啟動子利用內(nèi)切酶Hindlll和 Xbal酶切回收后，重組到pCAMBIA1300載體上，獲得pCAMBIA1300-35S載體。
[0053] 5、重組表達(dá)載體的獲得：用ΚρηΙ和Spel酶對pCAMBIA1300-35S載體進(jìn)行酶切，并 用ΚρηΙ和Spel酶切上述擴(kuò)增獲得的DNA片段，連接，得到含有水稻T0N1基因的重組表達(dá) 載體,命名為 PCAMBIA1300-35S-T0N1。
[0054] 將pCAMBIA1300-35S-T0Nl進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明在pCAMBIA1300-35S載體的 ΚρηΙ和Spel酶切位點(diǎn)間插入的基因序列如序列2中52-600位核苷酸所示，表明載體正確。
[0055] 二、T0N1轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
[0056] 用基因槍法將PCAMBIA1300-35S-T0N1轉(zhuǎn)化中花17的成熟胚愈傷組織，并用含 50mg/L潮霉素的NB培養(yǎng)基進(jìn)行2輪篩選，每輪篩選20-30天，經(jīng)預(yù)分化、分化得到陽性植 株。
[0057] 利用TONl-Oe引物序列和潮霉素引物序列對上述轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR篩選，獲得 L代陽性轉(zhuǎn)基因植株〇el。
[0058] 熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，目的基因 T0N1在陽性轉(zhuǎn)基因植株Oel葉片中的表達(dá) 量顯著高于轉(zhuǎn)空載的植株的葉片，是轉(zhuǎn)空載的植株的葉片中表達(dá)量的60倍多（圖2)。
[0059] 三、轉(zhuǎn)基因水稻的表型鑒定
[0060] 當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株和對照植株（轉(zhuǎn)空載的植株）長至兩葉一心時(shí)，進(jìn)行低氮 (_N，0. 24mMNH4N03)處理，觀察耐低氮表型。低氮處理21d后，過表達(dá)植株Oel的苗干重、苗 高、根長、氮濃度（整個(gè)植株中的氮濃度）和總氮量（整個(gè)植物體內(nèi)的總氮量）均顯著高于 對照（圖3A-F，圖3A為轉(zhuǎn)基因植株Oel和空載體對照1300低氮處理21d后的表型比較，左 為1300,右為Oel ;圖3B為轉(zhuǎn)基因植株Oel和空載體對照1300低氮處理21d后的苗干重比 較；圖3C為轉(zhuǎn)基因植株Oel和空載體對照1300低氮處理21d后的苗高比較；圖3D為轉(zhuǎn)基 因植株Oel和空載體對照1300低氮處理21d后的根長比較；圖3E為轉(zhuǎn)基因植株Oel和空 載體對照1300低氮處理21d后的氮濃度比較；圖3F為轉(zhuǎn)基因植株Oel和空載體對照1300 低氮處理21d后的總氮量比較。）。由此可見，轉(zhuǎn)基因植株Oel比對照株系受低氮脅迫程度 小，耐低氮特性增強(qiáng)。
[0001] 序列表 <110〉中國農(nóng)業(yè)大學(xué) <120〉一種與植物低氮耐性相關(guān)的T0N1蛋白及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用 <160〉 4 <210〉 1 <211> 182 <212〉 PRT <213〉軸稻特青期） <400> 1 Met Ala Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Val Leu Val Va丄 Val Val 15 10 15 Leu Val Ala Ser Leu Ala Ala Gly Gly Ala Asn Ala Ala Thr Phe Thr 20 25 30 lie Thr Asn Arg Cys Ser Phe Thr Yal Trp Pro Ala Ala Thr Pro Val 35 40 45
[0002] Gly Gly Gly Thr Gin Leu Asn Pro Gly Gin Thr Trp Thr lie Asn Val 50 55 60 Pro Ala Gly Thr Ser Ser Gly Arg Val Trp Gly Arg Thr Gly Cys Ser 65 70 75 80 Phe Asp Gly Ala Gly Arg Gly Arg Cys Ala Thr Gly Asp Cys Gly Gly 85 90 95 Ala Leu Ser Cys Arg Leu Ser Gly Gin Pro Pro Leu Thr Leu Ala Glu 100 105 110 Phe Thr Leu Gly Thr Ser Gly Gly Asn Arg Asp Phe Tvr Asn Leu Ser 115 120 125 Val lie Asp Gly Tyr Asn Val Ala Met Ser Phe Ser Cys Ser Ser Gly 150 135 140
[0003] Val Thr Leu Thr Cys Arg Glu Arg Ser Cvs Pro Asp Ala Tyr Gin Tyr 145 150 lb5 160 Pro Ser Asp Asp Ser Lys Leu Arg Ser Cys Asn Glj^ Asn Ser Asn Tyr 165 170 175 Arg Val Val Pho Cys Pro 180 <210〉 2 <211> 701 <212> DNA <213〉秈稻特青 <400〉 2 aattaacaag ctatacaaat taacacaaag attagaagaa agcaagcaac aatggcgtca 60 gctccggccg cctctcccgc agtgctcgtc gtcgtggtcc tggtggcgag cctcgccgcc 120 ggcggcgcca acgcggcgac cttcaccatc accaaccgtt gctcgttcac ggtgtggccg 丄80 gcggcgacgc cggtgggcgg cggcacgcag ctgaacccgg ggcagacgtg gaccatcaac 2"10 gtgcccgccg ggaccagctc cggcagggtg tggggccgga ccgggtgcag cttcgacggc 300
[0004] gccggccgcg gcaggtgcgc caccggcgac tgcggcggcg cgctgtcgt.g caggctgtcc 360 gggcagccgc cgctgacgct ggcggagttc acgctgggga cgtccggcgg caaccgggac 420 ttctacaacc tgtcggtgat cgacgggtac aacgtcgcca tgagcttctc ctgcagctcc 480 ggcgtgacgc tgacgtgcag ggagaggagc tgcccggacg cgtaccagta cccctccgac 540 gactccaagc tgcgctcctg caacggcaac agcaactacc gagtcgtctt ctgcccatga 600 tttcatgcat atgaacctac tactatatat atacttctac taaactgtat cagggaaaat b60 aataagaaca tacaataaaa cgaacgtgat ccagaattgc t 701 <210> 3 <211〉 28 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉 <400> 3 atggtaccat ggcgtcagct ccggccgc 28 <210> 4 <211〉 28 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉
[0005] <400> 4 atactagttc atgggcagaa gacgactc 28
【權(quán)利要求】
1. 蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)： a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且與植物低氮耐性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
2. 與權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料，為下述B1)至B6)中的任一種： B1)編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表達(dá)盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體； B4)含有B1)所述核酸分子的重組質(zhì)粒、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組質(zhì)粒； B5)含有B1)所述核酸分子的重組菌、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組菌、或含有B3)所 述重組載體的重組菌； B6)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物 細(xì)胞系、或含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的相關(guān)生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子為如下1)或 2)所不的基因： 1) 其編碼序列是序列表中序列2的第52-600位核苷酸的DNA分子； 2) 核苷酸序列是序列表中序列2的DNA分子。
4. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)、或權(quán)利要求2或3所述相關(guān)生物材料在提高植物低氮耐性 中的應(yīng)用。
5. -種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：使權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在出發(fā)植物 中過表達(dá)，進(jìn)而使植物的低氮耐性提高。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述使權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在出發(fā)植 物中過表達(dá)的方法為：向出發(fā)植物中導(dǎo)入權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因，得到轉(zhuǎn)基因 植物；轉(zhuǎn)基因植物與出發(fā)植物相比，低氮耐性提高。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白質(zhì)的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)所 不的基因： 1) 其編碼序列是序列表中序列2的第52-600位核苷酸的DNA分子； 2) 核苷酸序列是序列表中序列2的DNA分子。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述出發(fā)植物為單子葉植物或 雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：所述耐低氮體現(xiàn)在如下方面中 的至少一種： (1) 轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的株高高； (2) 轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的苗干重高； (3) 轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的苗高高； (4) 轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的根長長； (5) 轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的整個(gè)植株中的氮濃度高； (6) 轉(zhuǎn)基因植物比出發(fā)植物的整個(gè)植物體內(nèi)的總氮量高。
10. 擴(kuò)增編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子全長或其片段的引物對，引物序列如 下：序列表中序列3和序列表中序列4。
【文檔編號】A01H5/00GK104059139SQ201410309018
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】孫傳清, 張陽軍, 譚祿賓, 劉鳳霞, 付永彩, 朱作峰, 顧憑, 才宏偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)