無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法，其以無(wú)芒雀麥成熟種子作為外植體，先進(jìn)行表面滅菌，再將經(jīng)過(guò)滅菌處理的無(wú)芒雀麥種子轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)入第一繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行首次繼代，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；將分化培養(yǎng)得到的不定芽接入第二繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行二次繼代，分化出苗后接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。本方法以無(wú)芒雀麥成熟種子作為外植體，通過(guò)加入不同濃度生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織及分化、生根，從而建立其完整組培再生體系，為無(wú)芒雀麥通過(guò)基因工程進(jìn)行遺傳改良提供基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 無(wú)芒雀麥?zhǔn)呛瘫究疲℅ramineae)雀麥屬（5γο·Λ5)的多年生 草本植物。具有適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、產(chǎn)量大、利用季節(jié)長(zhǎng)、再生性強(qiáng)等特征，是優(yōu)良的牧 草。其野生種廣泛分布于我國(guó)各省區(qū)，為1000?3500m山地草甸草場(chǎng)優(yōu)勢(shì)草種。因其具有 發(fā)達(dá)的地下根莖，具有很強(qiáng)的抗旱能力，也是建立人工草場(chǎng)和環(huán)保固沙的先鋒植物。
[0003] 近年來(lái)，隨著產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和環(huán)境治理的需求，我國(guó)無(wú)芒雀麥的人工種植面積 不斷擴(kuò)大，對(duì)無(wú)芒雀麥種子的需求呈上升趨勢(shì)，對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)改良已迫在眉睫。隨著生物技 術(shù)的發(fā)展，利用基因工程進(jìn)行植物品質(zhì)改良已成為普遍和實(shí)用的手段，而成功進(jìn)行基因轉(zhuǎn) 化的前提就是建立高效、快速的植物組織培養(yǎng)再生體系。國(guó)內(nèi)通過(guò)組織培養(yǎng)建立草本植物 再生體系更多的集中于苜蓿等豆科牧草，而禾本科牧草組織培養(yǎng)再生體系的建立由于而相 對(duì)較難，其相關(guān)技術(shù)的探索還較薄弱，而以成熟種子作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)再生體系的 建立更為鮮見(jiàn)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)無(wú)芒雀麥離體組培再生體系建立的研究還處于起步階段，僅有 研究通過(guò)低能離子束注入的方式對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)進(jìn)行探索，而通過(guò)不同激素的合 理有效配比來(lái)建立無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生體系的研究還未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)其再生過(guò)程 中誘導(dǎo)、分化、生根等關(guān)鍵步驟建立方法的研究還屬于空白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種建立完整組培再生體系的無(wú)芒雀麥成熟種 子組織培養(yǎng)再生的方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：其以無(wú)芒雀麥成熟種子作為 外植體，先進(jìn)行表面滅菌，再將經(jīng)過(guò)滅菌處理的無(wú)芒雀麥種子轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中 培養(yǎng)；誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)入第一繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行首次繼代，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中 培養(yǎng)；將分化培養(yǎng)得到的不定芽接入第二繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行二次繼代，分化出苗后接入生 根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。
[0006] 本發(fā)明所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：附加2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4_D)0. 5?lmg/L、6_節(jié)基 氨基嘌呤（6-BA) 0· 5?lmg/L、蔗糖25g/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基，pH值為5. 8?6。
[0007] 本發(fā)明所述第一繼代培養(yǎng)基為：附加2, 4-二氯苯氧乙酸1?2mg/L、6_芐基氨基 嘌呤0· 5?lmg/L、蔗糖25g/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基，pH值為5. 8?6。
[0008] 所述愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和第一繼代培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件均為：溫度25? 27°C，光照時(shí)間12?14h/d，光照強(qiáng)度1000?2000Lux，誘導(dǎo)時(shí)間30?35d。
[0009] 本發(fā)明所述分化培養(yǎng)基為：附加萘乙酸（NAA) 1.5?2mg/L、6_芐基氨基嘌呤 0. 5?lmg/L、蔗糖30g/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基，pH值為5. 8?6。所述愈傷組織在分化 培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：溫度25?27°C，光照時(shí)間14?16h/d，光照強(qiáng)度1000?2000Lux， 培養(yǎng)時(shí)間30?35d。
[0010] 本發(fā)明所述第二繼代培養(yǎng)基為：附加萘乙酸1?1. 5mg/L、6-芐基氨基嘌呤0. 5? lmg/L、蔗糖30g/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基，pH值為5. 8?6。所述不定芽在第二繼代培 養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：溫度25?27°C，光照時(shí)間14?16h/d，光照強(qiáng)度1000?2000LUX， 培養(yǎng)時(shí)間35?40d。
[0011] 本發(fā)明所述生根培養(yǎng)基為：附加蔗糖25g/L和瓊脂7. 5g/L的1/2 MS培養(yǎng)基。所 述生根培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：溫度25?27°C，光照時(shí)間16?18h/d，光照強(qiáng)度1000? 2000Lux，培養(yǎng)時(shí)間35?40d。
[0012] 采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：1、以往禾本科牧草需要長(zhǎng)時(shí)間暗培養(yǎng) 才可誘導(dǎo)出愈傷組織，在之后的分化、生根培養(yǎng)過(guò)程再調(diào)整為光培養(yǎng)，步驟較繁瑣；本發(fā)明 從誘導(dǎo)到生根只需光培養(yǎng)即可成功得到再生植株，省去繁瑣的暗培養(yǎng)控制過(guò)程，節(jié)省人力 物力。2、與其他禾本科牧草組培不同，本發(fā)明在分化后又進(jìn)行二次繼代，得到的植株數(shù)量更 多，生活力更強(qiáng)。3、本發(fā)明在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中只用到3種激素，較以往更節(jié)約成本。4.在分 化過(guò)程中，特意將光照培養(yǎng)時(shí)間加長(zhǎng)，使之與植株本身正常生長(zhǎng)節(jié)律相匹配，得到的植株較 以往更易適應(yīng)外界環(huán)境響應(yīng)。5、生根培養(yǎng)過(guò)程中，特意加大了瓊脂份量，提高了培養(yǎng)基本身 的硬度，得到的植株根部較以往更粗壯，移栽更容易成活。
[0013] 本發(fā)明以無(wú)芒雀麥成熟種子作為外植體，從誘導(dǎo)到生根只需對(duì)光培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行小 幅度調(diào)整即可成功得到再生植株，通過(guò)加入不同濃度生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo) 愈傷組織及分化、生根，從而建立其完整組培再生體系，具有培養(yǎng)工藝簡(jiǎn)單、成本低，得到的 植株數(shù)量多、活力強(qiáng)、更容易成活的特點(diǎn)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1是本發(fā)明的工藝流程示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0016] 實(shí)施例1 :圖1所示，本無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法采用下述具體的工 藝步驟。
[0017] (1)外植體滅菌處理：選擇飽滿的無(wú)芒雀麥種子，去殼后置于50ml三角瓶中。在 超凈工作臺(tái)上用體積百分比為75%的乙醇表面消毒lmin，無(wú)菌水沖洗1遍；再用體積百分 比為0. 1%的氯化汞進(jìn)一步消毒15min，其間不停振蕩，最后用無(wú)菌水沖洗5次，在室溫下用 無(wú)菌水浸泡12h，讓種子充分吸脹。
[0018] (2)愈傷組織的誘導(dǎo)：將已滅菌的無(wú)芒雀麥種子接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn) 行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度26°C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1500LUX ;誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：在MS 培養(yǎng)基中加入lmg/L的2, 4-D、0. 5mg/L的6-BA、25g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂，pH值5. 8,誘 導(dǎo)時(shí)間30d。
[0019] (3)將愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)：種子誘導(dǎo)得到愈傷組織后，將 其轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度26°C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度 1500Lux ;繼代培養(yǎng)基 1 為：MS + lmg/L 2, 4-D + lmg/L 6-BA + 25g/L 蔗糖 + 7g/L 瓊脂， pH值5. 8,培養(yǎng)時(shí)間30d。
[0020] (4)將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)：挑選生長(zhǎng)狀態(tài)佳的愈傷組織轉(zhuǎn) 入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度26°C，光照時(shí)間14h/d，光照強(qiáng)度1500LUX ;分化培 養(yǎng)基為：MS + 2mg/L NAA + lmg/L 6-BA + 30g/L 蔗糖 + 7g/L 瓊脂，pH 值 5. 8,培養(yǎng)時(shí)間 30d。
[0021] (5)將分化培養(yǎng)得到的不定芽接入繼代培養(yǎng)基2中繼續(xù)進(jìn)行繼代：分化培養(yǎng)基培 養(yǎng)得到的不定芽轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基2中進(jìn)行繼代直至出苗。培養(yǎng)條件為：溫度26°C，光照時(shí) 間 14h/d，光照強(qiáng)度 1500Lux ;繼代培養(yǎng)基 2 為：MS + lmg/L NAA + lmg/L 6-BA + 30g/L 蔗糖+ 7g/L瓊脂，pH值5. 8,培養(yǎng)時(shí)間35d。
[0022] (6)分化出苗后接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根：待再生小苗長(zhǎng)至3?4cm時(shí)轉(zhuǎn)入生 根培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為：溫度26°C，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度1500LUX ;生根培養(yǎng)基 為：1/2 MS + 25g/L蔗糖+ 7. 5g/L瓊脂，pH值5. 8,培養(yǎng)時(shí)間35d。
[0023] 上述培養(yǎng)基中各附加成分（2, 4-D、6_BA、蔗糖、瓊脂、萘乙酸等）的加入量以各培養(yǎng) 基總量為基準(zhǔn)計(jì)算得出。
[0024] 經(jīng)分析、檢測(cè)，本實(shí)施例的誘導(dǎo)率為68%，分化率為83%，生根率在90%以上。
[0025] 實(shí)施例2 :本無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法采用下述具體的工藝步驟。
[0026] ( 1)外植體滅菌處理：同實(shí)施例1。
[0027] (2)愈傷組織的誘導(dǎo)：培養(yǎng)條件為：溫度25°C，光照時(shí)間13h/d，光照強(qiáng)度2000LUX ; 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS + 0· 8mg/L 2, 4-D + lmg/L 6-BA + 25g/L 蔗糖 + 7g/L 瓊脂，pH值 6. 0， 誘導(dǎo)時(shí)間35d ; (3)將愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)：培養(yǎng)條件為：溫度27°C，光照時(shí)間13h/ d，光照強(qiáng)度 2000Lux ;繼代培養(yǎng)基 1 為：MS + L 5mg/L 2, 4-D + (λ 5mg/L 6-BA + 25g/L 蔗 糖+ 7g/L瓊脂，pH值5. 9,培養(yǎng)時(shí)間35d。
[0028] (4)將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)：培養(yǎng)條件為：溫度25°C，光照時(shí) 間 15h/d，光照強(qiáng)度 2000Lux ;分化培養(yǎng)基為：MS + L 5mg/L NAA + 0· 8mg/L 6-BA + 30g/ L蔗糖+ 7g/L瓊脂，pH值6· 0,培養(yǎng)時(shí)間32d。
[0029] (5)將分化培養(yǎng)得到的不定芽接入繼代培養(yǎng)基2中繼續(xù)進(jìn)行繼代：培養(yǎng)條件為：溫 度25°C，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度2000Lux ;繼代培養(yǎng)基2為：MS+ 1. 2mg/L NAA +0. 5mg/ L 6-BA + 30g/L蔗糖+ 7g/L瓊脂，pH值5· 9,培養(yǎng)時(shí)間40d。
[0030] (6)分化出苗后接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根：培養(yǎng)條件為：溫度25°C，光照時(shí)間 18h/d，光照強(qiáng)度2000LUX ;生根培養(yǎng)基為：1/2 MS + 25g/L蔗糖+ 7. 5g/L瓊脂，pH值5. 8， 培養(yǎng)時(shí)間38d。
[0031] 經(jīng)分析、檢測(cè)，本實(shí)施例的誘導(dǎo)率為65%，分化率為85%，生根率在90%以上。
[0032] 實(shí)施例3 :本無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法采用下述具體的工藝步驟。
[0033] ( 1)外植體滅菌處理：同實(shí)施例1。
[0034] (2)愈傷組織的誘導(dǎo)：培養(yǎng)條件為：溫度271：，光照時(shí)間1411/(1，光照強(qiáng)度10001^? ; 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS + 0· 5mg/L 2, 4-D + 0· 7mg/L 6-BA + 25g/L 蔗糖 + 7g/L 瓊脂，pH 值 5. 9,誘導(dǎo)時(shí)間33d ; (3)將愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)：培養(yǎng)條件為：溫度25°C，光照時(shí)間14h/ d，光照強(qiáng)度 lOOOLux ;繼代培養(yǎng)基 1 為：MS + 2mg/L 2, 4-D + 0· 8mg/L 6-BA + 25g/L 蔗 糖+ 7g/L瓊脂，pH值5. 9,培養(yǎng)時(shí)間32d。
[0035] (4)將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)：培養(yǎng)條件為：溫度27°C，光照時(shí) 間 16h/d，光照強(qiáng)度 lOOOLux ;分化培養(yǎng)基為：MS + L 8mg/L NAA + 0· 5mg/L 6-BA + 30g/ L蔗糖+ 7g/L瓊脂，pH值5· 9,培養(yǎng)時(shí)間35d。
[0036] (5)將分化培養(yǎng)得到的不定芽接入繼代培養(yǎng)基2中繼續(xù)進(jìn)行繼代：培養(yǎng)條件為：溫 度27°C，光照時(shí)間15h/d，光照強(qiáng)度lOOOLux;繼代培養(yǎng)基2為：MS+1.5mg/L NAA +0. 8mg/ L 6-BA + 30g/L蔗糖+ 7g/L瓊脂，pH值6,培養(yǎng)時(shí)間38d。
[0037] (6)分化出苗后接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根：培養(yǎng)條件為：溫度27°C，光照時(shí)間 17h/d，光照強(qiáng)度lOOOLux ;生根培養(yǎng)基為：1/2 MS + 25g/L蔗糖+ 7. 5g/L瓊脂，pH值5. 8， 培養(yǎng)時(shí)間40d。
[0038] 經(jīng)分析、檢測(cè)，本實(shí)施例的誘導(dǎo)率為69%，分化率為80%，生根率在90%以上。
【權(quán)利要求】
1. 一種無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法，其特征在于：其以無(wú)芒雀麥成熟種子 作為外植體，先進(jìn)行表面滅菌，再將經(jīng)過(guò)滅菌處理的無(wú)芒雀麥種子轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)；誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)入第一繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行首次繼代，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng) 基中培養(yǎng)；將分化培養(yǎng)得到的不定芽接入第二繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行二次繼代，分化出苗后接 入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法，其特征在于，所述 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：附加2, 4-二氯苯氧乙酸0. 5?lmg/L、6-節(jié)基氨基噪呤0. 5?lmg/L、鹿糖 25g/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基，pH值為5. 8?6。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法，其特征在于，所述 第一繼代培養(yǎng)基為：附加2, 4-二氯苯氧乙酸1?2mg/L、6-節(jié)基氨基噪呤0. 5?lmg/L、鹿 糖25g/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基，pH值為5. 8?6。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法，其特征在于， 所述愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和第一繼代培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件均為：溫度25?27°C，光照時(shí) 間12?14h/d，光照強(qiáng)度1000?2000Lux，誘導(dǎo)時(shí)間30?35d。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法，其特征在于，所述 分化培養(yǎng)基為：附加萘乙酸1. 5?2mg/L、6-芐基氨基嘌呤0. 5?lmg/L、蔗糖30g/L和瓊 脂7g/L的MS培養(yǎng)基，pH值為5. 8?6。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法，其特征在于，所述 愈傷組織在分化培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：溫度25?27°C，光照時(shí)間14?16h/d，光照強(qiáng)度 1000?2000Lux，培養(yǎng)時(shí)間30?35d。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法，其特征在于，所述 第二繼代培養(yǎng)基為：附加萘乙酸1?1. 5mg/L、6-芐基氨基嘌呤0. 5?lmg/L、蔗糖30g/L和 瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基，pH值為5. 8?6。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法，其特征在于，所述 不定芽在第二繼代培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：溫度25?27°C，光照時(shí)間14?16h/d，光照強(qiáng) 度1000?2000Lux，培養(yǎng)時(shí)間35?40d。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法，其特征在于，所述 生根培養(yǎng)基為：附加蔗糖25g/L和瓊脂7. 5g/L的1/2 MS培養(yǎng)基。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的無(wú)芒雀麥成熟種子組織培養(yǎng)再生的方法，其特征在于，所 述生根培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：溫度25?27°C，光照時(shí)間16?18h/d，光照強(qiáng)度1000? 2000Lux，培養(yǎng)時(shí)間35?40d。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104137774SQ201410314873
【公開(kāi)日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】黃帆, 李志勇, 李鴻雁, 師文貴, 劉磊, 解永鳳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所