用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生的方法，其工藝步驟包括取細葉百合無菌苗葉片，接種于MS+BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1中培養(yǎng)35天，獲得非胚性愈傷組織。隨后將其轉于MS+BA0.5mg·L-1+NAA1.0mg·L-1中培養(yǎng)45天，獲得胚性愈傷組織后轉入MS+NAA0.5mg·L-1中，調整胚性比例，而后依次交替使用這兩種培養(yǎng)基，可獲得胚性比例高、萌發(fā)率低的胚性愈傷組織培養(yǎng)物。最后轉于MS中，每1cm3胚性愈傷組織培養(yǎng)物可形成超過21個體細胞胚。本發(fā)明以無菌苗為外植體，降低對百合原種的消耗；胚性愈傷組織誘導率高，保存效果好，肉眼可辨別，是遺傳轉化的良好受體；較以往方法，本發(fā)明建立的體細胞胚再生體系在愈傷組織誘導率和成苗系數(shù)方面分別提高了40%和3-4倍。
【專利說明】用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于球根花卉離體培養(yǎng)和遺傳育種研究領域，尤其涉及用于細葉百合遺傳轉化和種球繁育的體細胞胚離體再生【技術領域】。

【背景技術】
[0002]體細胞胚是一種由單細胞發(fā)育而成的胚狀體，采用這種方式繁殖具有取材少、遺傳穩(wěn)定性高、變異率低和再生率高等優(yōu)點，可有效減輕轉基因植株后期繁重的篩選工作，被認為在基因工程、體細胞融合、細胞突變體誘導、人工種子制備、雜種合子胚挽救、種質保存以及苗木快速繁殖等領域具有廣泛應用前景，已成為近年來遺傳轉化等基因工程方面研究的熱點。
[0003]細葉百合HJlium pumilumDG.Fisch.),別名山丹,是我國原產(chǎn)野生球根花丼，自然分布于東北、青海、陜西、寧夏等高寒地區(qū)，是分布最廣、分布緯度偏北的百合種之一，自然生長于陰坡疏林下。細葉百合抗性較強，耐鹽堿、耐寒、耐旱、耐陰，引種無須馴化，加之花色鮮紅、花型優(yōu)美，可直接應用于家庭盆栽、庭院及城市園林綠化，是促成栽培的優(yōu)良植物材料。細葉百合鱗莖食用有滋陰、安神、潤肺的功效，莖、葉具有消炎止痛的作用。
[0004]然而細葉百合從種子繁殖到植株開花需要3年時間，種球生長周期長，近年來由于生態(tài)環(huán)境惡化和人為亂采濫挖現(xiàn)象嚴重，其原生種球自然分布量銳減，瀕臨滅絕。因此，細葉百合作為一種優(yōu)良的中國原產(chǎn)野生球根花卉，其種質資源保存和種球繁殖迫在眉睫。此外，細葉百合植株莖桿較為細弱，觀賞性狀有待于進一步改良。體細胞胚再生作為一種現(xiàn)代無性繁殖技術，是最有希望解決百合種球繁殖、優(yōu)質種球培育、百合胚胎形態(tài)建成、組織分化以及植株再生等方面理論和實踐問題的重要【技術領域】。胚性愈傷組織是基因轉化的良好受體材料，誘導愈傷組織并長期保持其胚性狀態(tài)對基于轉基因技術的觀賞性狀改良及種質創(chuàng)新意義深遠。這一技術的應用將對百合種質保存、人工種子研制、突變體篩選、多倍體育種及轉基因育種等領域產(chǎn)生重要意義。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是以細葉百合無菌苗葉片為外植體，誘導外植體脫分化形成胚性愈傷組織，經(jīng)過胚性比例調整和保存階段，獲得胚性比例高于90%、萌發(fā)率低于5%的胚性愈傷組織，在控制愈傷組織長期保持胚性狀態(tài)的基礎上有效保存胚性愈傷組織并誘導球形胚，獲得胚性比例高達100%、萌發(fā)率為O的良好胚性愈傷組織培養(yǎng)物，其中I cm3愈傷組織培養(yǎng)物含有20個以上的球形胚。而在體細胞胚萌發(fā)階段，提高萌發(fā)率，促進球形胚萌發(fā)，后經(jīng)歷類似合子胚的發(fā)育過程，最終成功獲得成熟萌發(fā)的體細胞胚，I cm3胚性愈傷組織培養(yǎng)物可形成超過21個體細胞胚。從而為細葉百合的種球擴繁和種質保存提供高效穩(wěn)定的體細胞胚再生體系，并為基于轉基因的遺傳轉化提供胚性愈傷組織這一優(yōu)良轉化受體。
[0006]本發(fā)明提供的技術方案，包括以下工藝步驟: 1.外植體脫分化階段(非胚性愈傷組織誘導階段)
選取小鱗莖直徑為1-1.2 Cm的細葉百合無菌苗，將葉片切為長0.5 Cm小段，正面向上、平鋪接種于脫分化培養(yǎng)基MS+BA 1.0 mg.Ι^+ΝΑΑ 0.5 mg.Γ1 (其中Μ/ΜΑ為2)中，光培養(yǎng)。該培養(yǎng)基中含有蔗糖30 8噸_1，瓊脂(條)7 g-Γ1 ,pH 5.8，121°C高壓滅菌20分鐘。培養(yǎng)室溫度為25± I°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μ mo I.m_2.s—1 ;接種15天時，葉片、葉柄表層皺縮并形成細微的嫩黃色顆粒，后形成愈傷化。接種35天時，形成黃綠色、晶瑩度大、濕度高、表面平滑的非胚性愈傷組織。
[0007]2.胚性細胞轉化階段(胚性愈傷組織誘導階段):在脫分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)第45天，將步驟I中外植體脫分化獲得的非胚性愈傷組織切為0.5 cm3小塊，轉接于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+BA 0.5 mg.Ι^+ΝΑΑ 1.0 mg.Γ1 (即Μ/ΜΑ為1/2)中，使非胚性愈傷組織插入培養(yǎng)基內2-3 mm，光培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為25± 1°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μ mo I.πΓ2.s—1。接種30天，在黃綠色非胚性愈傷組織表面形成亮黃色、顆粒性明顯的胚性愈傷組織。
[0008]3.胚性比例和顆粒性調整階段:經(jīng)步驟2培養(yǎng)45天，去除黃綠色非胚性愈傷組織部分，將亮黃色的胚性愈傷組織切為I cm3小塊，轉接于胚性愈傷組織調整培養(yǎng)基MS+NAA
0.5 mg 中，光培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為25±1°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μ mo I.πΓ2 相同培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)I次后可獲得胚性比例高于90%、萌發(fā)率低于5%、顆粒性良好的胚性愈傷組織。
[0009]4.球形胚誘導階段:選擇步驟3中獲得的胚性愈傷組織，去除綠色非胚性愈傷組織和萌發(fā)的芽，依次交替使用胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基(MS+BA 0.5 mg.L^1+NAA 1.0mg.L—1)和胚性比例調整培養(yǎng)基(MS+NAA 0.5 mg.L—1)，培養(yǎng)室溫度為25± I °C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36μ mo I.m_2.s'每45天更換一次培養(yǎng)基，交替使用2次。可獲得胚性比例高達100%、萌發(fā)率為O的良好胚性愈傷組織培養(yǎng)物，其中I cm3愈傷組織培養(yǎng)物含有20個以上的球形胚。
[0010]5.體細胞胚萌發(fā)和成苗階段:將步驟4中含有球形胚的胚性愈傷組織培養(yǎng)物轉于MS基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室溫度為25 土 1°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%,每天16小時光照,8小時黑暗,光照強度為36 μ mo I.πΓ2.s' 15-20天后，球形胚萌發(fā)，依次經(jīng)歷心形胚、盾形胚及子葉胚階段萌發(fā)形成成熟體細胞胚，I cm3胚性愈傷組織培養(yǎng)物可形成超過21個體細胞胚。
[0011 ] 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
1.以無菌苗葉片為外植體，降低百合原種的消耗，可有效保護野生種質資源，而且對試管鱗莖無損耗，不影響煉苗移栽，為科學繁殖野生百合提供了新思路；
2.胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織可憑顏色肉眼辨別。本發(fā)明中，表面平滑、黃綠色的為非胚性愈傷組織，而亮黃色、呈明顯顆粒性狀的為胚性愈傷組織；
3.胚性愈傷組織誘導率高，保存效果好，為遺傳轉化提供良好受體。在胚性愈傷組織誘導階段，以脫分化的非胚性愈傷組織誘導胚性細胞轉化，誘導率高；在胚性愈傷組織保存階段，改良培養(yǎng)基配方，在控制愈傷組織長期保持胚性狀態(tài)的基礎上有效保存胚性愈傷組織，獲得胚性比例高于90%、萌發(fā)率低于5%的胚性愈傷組織，并在有效保存胚性愈傷組織的基礎上誘導球形胚，獲得胚性比例高達100%、萌發(fā)率為O的良好胚性愈傷組織培養(yǎng)物，其中I Cm3愈傷組織培養(yǎng)物含有20個以上的球形胚，為顯著提高再生效率奠定基礎；此外，該胚性愈傷組織對常用抗生素敏感性強，為細葉百合基于轉基因的遺傳轉化提供胚性愈傷組織這一優(yōu)良轉化受體；
4.再生效率高。本發(fā)明在體細胞胚萌發(fā)階段，提高萌發(fā)率，促進球形胚萌發(fā)，后經(jīng)歷類似合子胚的發(fā)育過程，最終成功獲得成熟萌發(fā)的體細胞胚，I cm3胚性愈傷組織培養(yǎng)物可形成超過21個體細胞胚，與前人關于其他種類百合體細胞胚離體再生的研究結果相比，胚性愈傷組織誘導率和分化成苗系數(shù)均提高20%，分化系數(shù)提高5倍，實現(xiàn)了高效再生的目的，從而為細葉百合的種球擴繁和種質保存提供高效穩(wěn)定的體細胞胚再生體系；而相比細葉百合的現(xiàn)有研究，本發(fā)明首次建立了體細胞胚再生體系，與前人采用的離體再生途徑相比，愈傷組織誘導率提高了 40%，分化系數(shù)提高近3-4倍，可作為細葉百合種球快繁高效穩(wěn)定的再生體系；
5.降低生產(chǎn)成本。目前TDZ、PIC、DIC、KT等新型激素被廣泛用于其他種類百合愈傷組織或體細胞胚的誘導(Tang Y P, 2010; Tribulato A, 2006; Khosravi S，2007),但此類激素價格普遍偏高。而本發(fā)明中建立的細葉百合體細胞胚發(fā)生體系，僅使用BA和NAA兩種常見植物激素，市售價格僅為新型激素的1/10-1/5，在保證再生效率的基礎上有效降低了生產(chǎn)成本；此外，在體細胞胚萌發(fā)階段，前人研究中需額外添加NAA、IBA或BA，以促進體細胞胚萌發(fā)和生根(翟彥等，2011;袁雪等，2012)，而本發(fā)明采用不添加任何激素的MS基本培養(yǎng)基，保證體細胞胚高分化系數(shù)和正常生根的同時，可有效降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為外植體脫分化(Bar: 5 mm)；
圖2為胚性愈傷組織誘導(Bar: 5 mm)；
圖3為非胚性愈傷組織(Bar:1 mm)；
圖4為調整后的胚性愈傷組織(Bar: 5 mm)；
圖5為球形胚誘導(Bar: 2 mm)；
圖6為體細胞胚萌發(fā)(Bar: 5 mm)；
圖7為不定芽成苗(Bar: 5 mm);
圖8為體細胞胚成苗(Bar: 5 mm)；
圖9為球形胚(Bar: 2 mm)；
圖10為心形胚(Bar: 2 mm)；
圖11為盾形胚(Bar: 2 mm)；
圖12為子葉形胚后期(Bar: 5 mm)；
圖13為非胚性愈傷組織切片觀察(Bar: 200 μ m)；
圖14為胚性愈傷組織切片觀察(Bar: 200 μ m)；
圖15為不定芽再生；
圖16為體細胞胚再生。

【具體實施方式】
[0013]為了更詳細敘述本發(fā)明的工藝步驟，下面舉實例說明。
[0014]實例一、細葉百合體細胞胚離體再生技術
1.非胚性愈傷組織誘導階段(外植體脫分化階段)
選取小鱗莖直徑為1-1.2 Cm的細葉百合無菌苗，將葉片切為長0.5 Cm小段，正面向上、平鋪接種于脫分化培養(yǎng)基MS+BA 1.0 mg.Ι^+ΝΑΑ 0.5 mg.Γ1 (即Μ/ΜΑ為2)中，光培養(yǎng)。其中含有蔗糖30 8*171，瓊脂(條)7 g*r1,pH 5.8，121°C高壓滅菌20分鐘。培養(yǎng)室溫度為25± 1°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μ mo I.πΓ2.s'
[0015]試驗環(huán)節(jié)發(fā)現(xiàn)，若以鱗片為外植體，均以不定芽直接再生途徑發(fā)生。而以葉片和葉柄為外植體時未形成不定芽，而是在接種15天時，葉片、葉柄表層出現(xiàn)皺縮并形成細微的嫩黃色顆粒，后形成愈傷化。接種35天，形成黃綠色、晶瑩度大、濕度高、表面平滑的非胚性愈傷組織，經(jīng)愈傷組織間接再生途徑發(fā)生。
[0016]愈傷狀況及愈傷化程度因激素濃度不同而不同。BA濃度較低為1.0 mgiSNAA濃度較高為0.5 mg t1時，葉片和葉柄的愈傷化程度最高。即培養(yǎng)基MS+BA 1.0 mg -L^+NAA
0.5 mg.Γ1 (ΒΑ/ΝΑΑ為2時)為細葉百合無菌苗葉片和葉柄誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基，愈傷組織誘導率達30%，誘導形成的非胚性愈傷組織呈黃綠色、晶瑩度大、濕度高且表面平滑(見附圖1、圖3)。
[0017]2.胚性愈傷組織誘導(胚性細胞轉化階段)
在脫分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)第45天，即非胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)第45天，將步驟I中外植體脫分化獲得的非胚性愈傷組織切為0.5 cm3小塊，轉接于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+BA
0.5 mg.L^+NAA 1.0 mg.L-1 (即BA/NAA為1/2)中，使非胚性愈傷組織插入培養(yǎng)基內2-3mm，光培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為25±1°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μ mo I.m_2.s'接種30天，在黃綠色非胚性愈傷組織表面形成亮黃色、顆粒性明顯的胚性愈傷組織(見附圖2)。
[0018]試驗環(huán)節(jié)發(fā)現(xiàn)，若將外植體脫分化產(chǎn)生的的非胚性愈傷組織接于不含BA、NAA的MS培養(yǎng)基中，黃綠色非胚性愈傷組織逐漸褐化，未誘導出現(xiàn)胚性愈傷組織；gMS培養(yǎng)基中添加BA的濃度較高為1.5或2.0 mg.L'NAA濃度較低為0.1或0.5 mg.L—1，即傳統(tǒng)添加方式一BA濃度高于NAA濃度時，非胚性愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽，并未誘導產(chǎn)生胚性愈傷組織。
[0019]與以往研究不同的是，本發(fā)明將MS培養(yǎng)基中添加的BA和NAA濃度均調整為0.5或1.0 mg 并且使得NAA濃度高于BA，均可獲得胚性愈傷組織。尤其是當NAA添加濃度為BA濃度的2倍，即BA/NAA為1/2時，獲得的胚性愈傷組織誘導率最高，可達88%。
[0020]3.胚性比例和顆粒性調整階段
經(jīng)步驟2培養(yǎng)45天，去除黃綠色非胚性愈傷組織部分，將亮黃色的胚性愈傷組織切為Icm3小塊，轉接于胚性愈傷組織調整培養(yǎng)基MS+NAA 0.5 mg.Ι^中，光培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為25± I°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μπιο?經(jīng)過胚性比例調整和保存階段，在相同培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)
I次后，在控制愈傷組織長期保持胚性狀態(tài)的基礎上有效保存胚性愈傷組織，可獲得胚性比例高于90%、萌發(fā)率低于5%、顆粒性良好的胚性愈傷組織(見附圖4)。
[0021]胚性愈傷組織顆粒性易消失，若培養(yǎng)基不適，亮黃色、顆粒性明顯的胚性愈傷組織會轉化為綠色非胚性愈傷組織。因此如何在胚性愈傷組織保存過程中，既保證胚性愈傷組織長期保持其胚性狀態(tài)，又能抑制胚性愈傷組織萌發(fā)成為試驗過程中的關鍵環(huán)節(jié)。試驗發(fā)現(xiàn)，當BA和NAA濃度均較高，分別為1.0和0.5 mg.Γ1時，胚性愈傷組織比例最高為65.67%，但此時超過50%的胚性愈傷組織由黃色轉化為綠色，即胚性喪失嚴重，而且此培養(yǎng)基中胚性愈傷組織萌發(fā)率也很高，達30%以上。
[0022]而本發(fā)明中，將非胚性愈傷組織轉接于MS+NAA 0.5 mg.L—1中培養(yǎng)45天，胚性愈傷組織比例為55.81%，且轉綠率低于30%，萌發(fā)率控制在20%以下。
[0023]4.球形胚誘導階段
選擇步驟3中獲得的胚性愈傷組織，去除綠色非胚性愈傷組織和萌發(fā)的芽，依次交替使用胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基(MS+BA 0.5 mg.L^1+NAA 1.0 mg.L—1)和胚性比例調整培養(yǎng)基(MS+NAA 0.5 mg-171 )，培養(yǎng)室溫度為25± 1°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%,每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μ mo I.πΓ2.s—1。每45天更換一次培養(yǎng)基，交替使用2次?？色@得胚性比例高達100%、萌發(fā)率為O的良好胚性愈傷組織培養(yǎng)物，其中I cm3愈傷組織培養(yǎng)物含有20個以上的球形胚(見附圖5)。
[0024]5.體細胞胚萌發(fā)和成苗階段
現(xiàn)有關于百合體細胞胚發(fā)生的研究中，在體細胞胚萌發(fā)成苗階段需額外添加NAA、IBA或BA，以促進體細胞胚萌發(fā)和生根(翟彥等，2011;袁雪等，2012)，而本發(fā)明在體細胞胚萌發(fā)階段，采用不添加任何激素的MS基本培養(yǎng)基，保證體細胞胚高分化系數(shù)和正常生根的同時，可有效降低生產(chǎn)成本。
[0025]具體實施步驟為:將步驟4中含有球形胚的胚性愈傷組織培養(yǎng)物轉于MS基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室溫度為25± I°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μπιο?.πΓ2.s' 15-20天后，球形胚萌發(fā)(見附圖6)，由球形胚(見附圖9)依次經(jīng)歷心形胚(見附圖10)、盾形胚(見附圖11)及子葉胚(見附圖12)階段萌發(fā)形成成熟體細胞胚，I cm3胚性愈傷組織培養(yǎng)物可形成超過21個體細胞胚。
[0026]6.抗生素敏感性篩選
以含球形胚的胚性愈傷組織培養(yǎng)物為外植體，在本發(fā)明中篩選獲得的體細胞胚萌發(fā)的最適培養(yǎng)基MS中，添加不同濃度Kan、Hyg抗生素進行敏感濃度篩選。試驗環(huán)節(jié)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的胚性愈傷組織對常用抗生素Kan和Hyg敏感，篩選獲得的亞致死濃度分別為150mg.L-1 和 30 mg.L-1。
[0027]實例二、非胚性愈傷組織和胚性愈傷組織的鑒定
經(jīng)體視顯微鏡觀察可見，非胚性愈傷組織則表面光滑，而胚性愈傷組織有顯瘤狀結構。觀察石蠟切片發(fā)現(xiàn)，兩種類型愈傷組織具有明顯差異，其中非胚性愈傷組織內部無明顯細胞結構(見附圖13)，而胚性愈傷組織多為外起源，內部細胞結構明顯，多成圓球形，由內層向外，細胞逐漸變小，排列也更為緊密(見附圖14)。
[0028]實例三、驗證體細胞胚發(fā)生途徑的高效性
雖然體細胞胚再生體系具有單細胞起源、繁殖系數(shù)高等優(yōu)點，但由于誘導相對困難，目前國內外僅有少數(shù)幾種百合獲得體細胞胚，且多為切花品種，然而包括細葉百合在內的眾多野生百合均鮮有報道。目前有關細葉百合離體再生的研究主要集中于器官發(fā)生途徑，以細葉百合鱗片(取自成株的鱗莖，非無菌苗)為外植體進行不定芽誘導時，誘導系數(shù)為3-4.8 ;以細葉百合花絲為外植體，愈傷組織誘導率為40%，愈傷組織進行不定芽分化時，分化系數(shù)為10.8(金淑梅等，2006;葛蓓孛等，2010);在其他百合有關體細胞胚發(fā)生的研究方面，東方百合切花品種胚性愈傷組織誘導率在70%左右，分化成苗率低于70% (張藝萍等，2008) ；OT系列切花‘Manissa’胚性愈傷組織的誘導率約79%，成苗數(shù)為5.6 (翟彥等，2011);麝香百合胚性愈傷組織誘導率為65.74%，分化成苗率達81.48%，成苗數(shù)為2.04 (袁雪，2012)。
[0029]而本發(fā)明提供的細葉百合胚性愈傷組織誘導率達88%以上，分化成苗率達95%以上，并且分化系數(shù)超過20，與前人有關細葉百合離體再生的研究結果相比，愈傷組織誘導率提高了 40%，分化系數(shù)提高3-4倍(見附圖7-8、15-16)，而與前人關于體細胞胚離體再生的研究結果相比，胚性愈傷組織誘導率提高20%，分化成苗率提高20%，分化系數(shù)提高5倍，可作為細葉百合種球快繁高效穩(wěn)定的再生體系。
【權利要求】
1.一種用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法，其特征是工藝步驟為: (1)外植體脫分化階段 將葉片切為長0.5 Cm小段，正面向上、平鋪接種于脫分化培養(yǎng)基MS+BA 1.0mg.L^+NAA 0.5 mg.L-1中，光培養(yǎng)；該培養(yǎng)基中含有蔗糖30 g.L—1，瓊脂(條)7 g.L-1，pH 5.8，121°C高壓滅菌20分鐘。培養(yǎng)室溫度為25± 1°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μ mo I.πΓ2.s—1 ;接種15天時，葉片、葉柄表層皺縮并形成細微的嫩黃色顆粒，后形成愈傷化。接種35天時，形成黃綠色、晶瑩度大、濕度高、表面平滑的非胚性愈傷組織； ⑵胚性細胞轉化階段 在脫分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)第45天，將步驟I中外植體脫分化獲得的非胚性愈傷組織切為0.5 cm3小塊，轉接于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+BA 0.5 mg.171+NAA 1.0 mg ?Γ1 (即BA/NAA為1/2)中，使非胚性愈傷組織插入培養(yǎng)基內2-3 mm，光培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為25±1°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μπιο?接種30天，在黃綠色非胚性愈傷組織表面形成亮黃色、顆粒性明顯的胚性愈傷組織； (3)胚性比例和顆粒性調整階段 經(jīng)步驟2培養(yǎng)45天，去除黃綠色非胚性愈傷組織部分，將亮黃色的胚性愈傷組織切為Icm3小塊，轉接于胚性愈傷組織調整培養(yǎng)基MS+NAA 0.5 mg.Ι^中，光培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為25± I°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μπιο?.!^2.^。相同培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)I次后可獲得胚性比例高于90%、萌發(fā)率低于5%、顆粒性良好的胚性愈傷組織； ⑷球形胚誘導階段 選擇步驟3中獲得的胚性愈傷組織，去除綠色非胚性愈傷組織和萌發(fā)的芽，依次交替使用胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+BA+NAA和胚性比例調整培養(yǎng)基MS+NAA，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每45天更換一次培養(yǎng)基，交替使用2次，可獲得胚性比例高達100%、萌發(fā)率為O的良好胚性愈傷組織培養(yǎng)物，其中I cm3愈傷組織培養(yǎng)物含有20個以上的球形胚； (5)體細胞胚萌發(fā)和成苗階段 將步驟4中含有球形胚的胚性愈傷組織培養(yǎng)物轉于MS基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室溫度為25土 1°C，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36 μπιοΙ.πΓ2.^。15-20天后，球形胚萌發(fā)，依次經(jīng)歷心形胚、盾形胚及子葉胚階段萌發(fā)形成成熟體細胞胚，I cm3胚性愈傷組織培養(yǎng)物可形成超過21個體細胞胚。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法，其特征是:脫分化培養(yǎng)基為MS+BA 1.0 mg.L^+NAA 0.5 mg.L'
3.根據(jù)權利要求1所述的用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法，其特征是:胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg.L^+NAA 1.0 mg.L-1。
4.根據(jù)權利要求1所述的用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法，其特征是:胚性愈傷組織調整培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg.L'
【文檔編號】A01H4/00GK104126505SQ201410317450
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月7日 優(yōu)先權日:2014年7月7日
【發(fā)明者】孫紅梅, 張靜 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學