油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法,屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域。主要通過(guò)油桐下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷組織誘導(dǎo)不定芽、繼代增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過(guò)程,不僅為快速繁殖優(yōu)良油桐植株提供了一條途徑,而且為以后通過(guò)基因工程的方法改良油桐的抗性、加速油桐分子育種進(jìn)程及提高油脂質(zhì)量等性狀,以及為油桐遺傳體系的建立打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于油桐細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及 高效再生植株的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 油桐為大戟科（Euphorbiaceae)油桐屬（Vernicia)植物的統(tǒng)稱，是重要的工業(yè) 油料樹種，與油茶、核桃和烏桕并稱我國(guó)四大木本油料樹種。從油桐種子榨取的油稱為桐 油，是世界上最優(yōu)質(zhì)的植物干性油，為油漆、印刷墨油的優(yōu)良原料。桐油具有干燥快、附著 力強(qiáng)、比重輕、富光澤、耐酸堿、耐高溫、抗凍裂、防水等優(yōu)良特性。此外，桐油還是一種優(yōu)良 涂料，是合成新型復(fù)合材料的基本原料，具有廣泛的用途。近年來(lái)，隨著全球人口增加和 經(jīng)濟(jì)的飛速增長(zhǎng)，資源開發(fā)利用過(guò)度，發(fā)展油桐產(chǎn)業(yè)已迫在眉睫，如何挖掘油桐這一寶貴 資源在生物質(zhì)能源等領(lǐng)域的重要作用，推進(jìn)油桐規(guī)?；l(fā)展是當(dāng)前科研工作者艱巨的任 務(wù)，也是幫助山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的手段之一。目前，油桐的常規(guī)育苗方法主要為實(shí)生苗及 嫁接苗，嫁接苗雖然能夠保持母本的優(yōu)良性狀，但成本較高，不利于規(guī)?；a(chǎn)。同時(shí)， 油桐枯萎病是我國(guó)油桐產(chǎn)區(qū)一種毀滅性病害，嚴(yán)重影響了油桐產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。通過(guò)組織 培養(yǎng)可以快速繁殖油桐脫毒苗，在此基礎(chǔ)上通過(guò)遺傳體系轉(zhuǎn)化而獲得抗病植株，在木本油 料植物遺傳改良方面有廣闊的前景。
[0003] 油桐的離體培養(yǎng)研究很晚，到目前為止僅有以油桐離體葉片通過(guò)器官發(fā)生途徑 獲得再生植株的報(bào)道，但由于葉片較嫩，在農(nóng)桿菌侵染過(guò)程中特別容易受傷，再生活性降 低，對(duì)實(shí)現(xiàn)油桐的遺傳體系轉(zhuǎn)化產(chǎn)生很大的障礙，并且，葉片容易失水，對(duì)卡那霉素的抗 性較低，在卡那霉素篩選過(guò)程中容易死亡，而下胚軸是通過(guò)合子胚發(fā)育而來(lái)胚性器官，胚 性較強(qiáng)，具有很高的活力及分化再生能力，在植物遺傳體系轉(zhuǎn)化中有廣闊的前景。目前， 通過(guò)農(nóng)桿菌侵染下胚軸獲得轉(zhuǎn)基因植株已經(jīng)在油菜及柑橘中獲得成功，而這些植物通過(guò) 離體葉片也可以獲得再生植株，但在農(nóng)桿菌侵染時(shí)的過(guò)程中，以及在卡那霉素篩選中葉片 容易死亡，不能獲得轉(zhuǎn)基因植株，相反，這些植物的下胚軸對(duì)卡那霉素的抗性較強(qiáng)，有利 于目的基因的介導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和再生。因此，通過(guò)利用油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)獲得再生植株 在油桐轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域有廣闊的前景。本發(fā)明以油桐幼嫩的下胚軸為外植體，通過(guò)在高濃度的 激素下誘導(dǎo)愈傷組織，然后轉(zhuǎn)接到愈傷組織分化不定芽的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的分化、繼 代增殖、生根和煉苗移栽等過(guò)程，旨在建立一個(gè)高效穩(wěn)定的油桐下胚軸離體快繁體系，為 油桐遺傳改良奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)目前油桐采用葉盤法獲得再生植株技術(shù)存在的缺陷，在此 基礎(chǔ)上，提供了利用油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)獲得再生植株，該方法利用油桐幼嫩的下胚 軸誘導(dǎo)愈傷組織，再通過(guò)愈傷組織分化不定芽，其誘導(dǎo)率高，不定芽健壯，不定芽繼代增 殖系數(shù)1?，壯苗效果好，生根率1?，關(guān)鍵還在于能夠大大提1?農(nóng)桿菌浸染實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的 可能性。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的。
[0006] 油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法，包括以下步驟：
[0007] 將油桐成熟胚在無(wú)菌條件下萌發(fā)30天的下胚軸，在無(wú)菌條件下切成長(zhǎng)為 0· 5-1. 0cm 的小塊，接種到 WPM+5. 0-10. 0mg/L6-BA+l. Omg/L ΚΤ+0. lmg/L NAA 的培養(yǎng)基中 誘導(dǎo)愈傷組織，暗培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)10天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照 強(qiáng)度為2100-22001X，光照時(shí)間12-14h/d;然后經(jīng)過(guò)不定芽分化、繼代增殖、壯苗和生根培 養(yǎng)獲得完整植株；最后進(jìn)行煉苗、移栽。
[0008] 上述方法中不定芽分化的具體過(guò)程如下：將下胚軸誘導(dǎo)的質(zhì)地較好的愈傷組織 接種到 WPM+0. 5-1. 0mg/L6-BA+0. 01-0. 05mg/L NAA+2. Omg/L GA3 的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的 分化培養(yǎng)，暗培養(yǎng)1天后，轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)25-30天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng) 度為 2100-22001X，光照時(shí)間 12-14h/d。
[0009] 上述方法中繼代增殖培養(yǎng)的具體過(guò)程如下：將愈傷組織分化培養(yǎng)得到的健壯不 定芽切下接種到WPM+2. 0-3. Omg/L ΚΤ+0. 05mg/L IAA+2. Omg/L GA3的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽 的增殖培養(yǎng)，暗培養(yǎng)1天后，在光照條件下培養(yǎng)25-30天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng) 度為 2100-22001X，光照時(shí)間 12-14h/d。
[0010] 上述方法中壯苗培養(yǎng)的具體過(guò)程如下：將增殖培養(yǎng)得到的芽轉(zhuǎn)接到 WPM+0. 5-1. Omg/LNAA+1. 0-2. Omg/L GA3的培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)1天后，在光照 條件下培養(yǎng)15-20天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光照時(shí)間12-14h/ d〇
[0011] 上述方法中生根培養(yǎng)的具體過(guò)程如下：將壯苗培養(yǎng)獲得2-4cm的苗接到 1/4MS+0. 1-0. 3mg/L IBA的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為26 士 1 °C，暗培養(yǎng)3-5天， 再轉(zhuǎn)到光照下培養(yǎng)5-7天即可生根，光照強(qiáng)度為2100-22001X，光照時(shí)間12-14h/d。
[0012] 上述方法中煉苗、移栽的具體過(guò)程如下：
[0013] 將生根后的苗先在人工氣候箱中進(jìn)行移栽前煉苗，煉苗保持空氣相對(duì)濕度為 80%以上，3-5天后從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到營(yíng)養(yǎng)杯中，基質(zhì)為泥炭土： 珍珠巖：黃土 = 2:1:1，用薄膜蓋住營(yíng)養(yǎng)杯口，保持恒定的氣候條件，兩周后取出薄膜， 逐步進(jìn)行正常水肥管理。
[0014] 所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法優(yōu)選，
[0015] 不定芽分化的培養(yǎng)基為：WPM+1. 0mg/L6-BA+0. 01mg/L NAA+2. 0mg/L GA3。
[0016] 壯苗培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為：WPM+0. 5-1. Omg/L NAA+2. Omg/L GA3。
[0017] 下胚軸的獲得過(guò)程如下：
[0018] 選取成熟的油桐當(dāng)年生種子，取除種皮，將種仁用自來(lái)水沖洗5_8min，然后浸泡 15-20h，中間換水3-4次，然后在超凈工作臺(tái)中用0. 1%的HgCl2消毒3-5min，用無(wú)菌水沖 洗4-6次，接種在1/2MS基本培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3-5天，再轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)20-30天 即可使用下胚軸進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001X，光 照時(shí)間12-14h/d。
[0019] 所述方法中用到的培養(yǎng)基均附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH調(diào)至5. 4-5. 8。
[0020] 本發(fā)明主要過(guò)程包括：主要通過(guò)油桐下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷組織分化不定 芽、繼代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽。該方法對(duì)油桐下胚軸愈傷組織誘 導(dǎo)率高，愈傷組織再分化能力強(qiáng)，不定芽健壯有利于繼代培養(yǎng)，增殖系數(shù)高，壯苗效果 好，生根率高；不僅為快速繁殖大量?jī)?yōu)良油桐植株提供了一條新的技術(shù)途徑，而且為以后 通過(guò)基因工程的方法改良油桐抗性、培育抗病植株，提高油桐產(chǎn)量及油脂質(zhì)量等性狀，以 及為油桐遺傳體系的建立打下基礎(chǔ)。這為油桐從傳統(tǒng)的育種方式向分子育種方向邁進(jìn)提供 了可行性，為以后緩解生物能源短缺方面有著重要意義。
[0021] 此外，油桐離體組織培養(yǎng)的研究比較少見。本發(fā)明的詳細(xì)優(yōu)勢(shì)總結(jié)如下：
[0022] 1、本發(fā)明采用的離體組織是下胚軸，是通過(guò)合子胚發(fā)育而來(lái)胚性器官，胚性較 強(qiáng)，具有很高的活力及分化再生能力，在植物遺傳體系轉(zhuǎn)化中有廣闊的前景；
[0023] 2、下胚軸在農(nóng)桿菌侵染時(shí)的過(guò)程中不易死亡，以及在卡那霉素篩選中抗性較強(qiáng)， 有利于目的基因的介導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和再生。目前，通過(guò)下胚軸獲得轉(zhuǎn)基因植株已有報(bào)道，轉(zhuǎn)基因 油菜就是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)下胚軸成功獲得的，在木本植物柑橘中也通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)下胚 軸獲得了轉(zhuǎn)基因植株，而柑橘葉片再生體系已建立，但是通過(guò)農(nóng)桿菌侵染葉片的過(guò)程中， 葉片容易死亡，此方法還不能得到柑橘轉(zhuǎn)基因植株。因此，下胚軸在植物遺產(chǎn)體系轉(zhuǎn)化過(guò) 程中是較好的選擇。本發(fā)明是在前人在其它植物研究過(guò)程中的到了啟發(fā)，選取油桐下胚軸 通過(guò)大量的試驗(yàn)組合得到了油桐下胚軸高效再生體系建立的培養(yǎng)基配方，為油桐轉(zhuǎn)基因 植株的培育提供更有效的途徑。
[0024] 3、本發(fā)明通過(guò)油桐下胚軸誘導(dǎo)的不定芽無(wú)論從長(zhǎng)勢(shì)、芽體長(zhǎng)度、葉片數(shù)量、葉片顏 色、芽的粗度及質(zhì)地等方面都要好于葉片誘導(dǎo)的不定芽（圖15-16)。由圖可知，葉片誘導(dǎo) 的不定芽雖然較密，芽體較多，但大部分芽畸形，沒(méi)有明顯的頂芽和莖，只長(zhǎng)葉片，不利 于后期的繼代培養(yǎng)，因此，通過(guò)油桐下胚軸誘導(dǎo)的不定芽生長(zhǎng)健壯，主莖明顯，能過(guò)克服 葉片誘導(dǎo)不定芽的不足，從而為油桐遺傳改良提供了更廣的途徑。
[0025] 4、試驗(yàn)表明，用誘導(dǎo)葉片的培養(yǎng)基配方對(duì)下胚軸不定芽的誘導(dǎo)效果較差，主要原 因是不同器官組織所含的營(yíng)養(yǎng)成分和內(nèi)源激素的含量有所差異，因此，不同組織器官有合 適他們的最適宜培養(yǎng)基配方，下胚軸是通過(guò)合子胚發(fā)育而來(lái)的，具有胚性，細(xì)胞活性較 強(qiáng)，分化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉片和其他器官的分化能力。所以本發(fā)明重新考慮以下胚軸為外植 體，通過(guò)在高濃度的激素下誘導(dǎo)愈傷組織，然后轉(zhuǎn)接到愈傷組織分化不定芽的培養(yǎng)基中進(jìn) 行不定芽的分化、繼代增殖、生根和煉苗移栽等過(guò)程，旨在建立一個(gè)新的高效穩(wěn)定的油桐 下胚軸離體快繁體系和途徑，為油桐遺傳改良奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵還在于能夠大大提高農(nóng)桿菌 浸染實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的可能性。
[0026] 5、黃艷等人用油桐下胚軸進(jìn)行愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)，雖然愈傷組織誘導(dǎo)率 可達(dá)100%，但后期分化的不定芽不利于繼代增殖，容易死亡，且誘導(dǎo)率較低，最高誘導(dǎo) 率僅為56%，不能實(shí)現(xiàn)油桐遺傳體系轉(zhuǎn)化。本發(fā)明前期采用該配方對(duì)油桐下胚軸進(jìn)行誘 導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)出的不定芽大部分畸形，繼代過(guò)程榮慢慢死亡，不利于后期的繼代增殖培 養(yǎng)。本發(fā)明重新選擇適合木本植物培養(yǎng)的WPM培養(yǎng)基添加高濃度的6-BA，附加 KT和生長(zhǎng) 素 NAA的不同組合快速誘導(dǎo)愈傷組織，等愈傷組織長(zhǎng)出后及時(shí)轉(zhuǎn)接到不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基 中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，通過(guò)大量試驗(yàn)得到了適合油桐下胚軸穩(wěn)定高效的培養(yǎng)基配方，極大的 提高了愈傷組織分化率，更有利于后期的繼代增殖培養(yǎng)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為本發(fā)明油桐下胚軸接種的照片；
[0028] 圖2為本發(fā)明油桐下胚軸誘導(dǎo)出愈傷組織的照片；
[0029] 圖3為本發(fā)明油桐下胚軸愈傷組織分化出不定芽初期的照片；
[0030] 圖4為本發(fā)明油桐下胚軸愈傷組織分化不定芽后的照片；
[0031] 圖5為本發(fā)明油桐下胚軸愈傷組織分化不定芽20d的照片；
[0032] 圖6為本發(fā)明油桐下胚軸愈傷組織分化不定芽15d的照片；
[0033] 圖7為本發(fā)明油桐下胚軸愈傷組織分化不定芽15d的照片；
[0034] 圖8為本發(fā)明不定芽繼代增殖培養(yǎng)初期的照片；
[0035] 圖9為本發(fā)明不定芽增殖培養(yǎng)后期的照片；
[0036] 圖10為本發(fā)明不定芽壯苗培養(yǎng)的照片；
[0037] 圖11為本發(fā)明不定芽生根培養(yǎng)的照片；
[0038] 圖12為本發(fā)明不定芽生根培養(yǎng)的照片；
[0039] 圖13為本發(fā)明生根后移栽的組培苗的照片；
[0040] 圖14為本發(fā)明移栽后成活的組培苗的照片；
[0041] 圖15為葉片誘導(dǎo)不定芽做對(duì)照；
[0042] 圖16為葉片誘導(dǎo)不定芽做對(duì)照。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] 依次進(jìn)行以下操作：
[0046] 1、選取成熟的油桐當(dāng)年生種子，取除種皮，將種仁用自來(lái)水沖洗5_8min，然后浸 泡15-20h，中間換水3-4次，然后在超凈工作臺(tái)中用0. 1%的HgCl2消毒3-5min，用無(wú)菌 水沖洗4-6次，接種在1/2MS基本培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)5天，再轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)25天， 下胚軸高度可達(dá)3-4cm，在無(wú)菌條件下切成長(zhǎng)為0.5-lcm的小塊，按形態(tài)學(xué)頂端朝上的方 式接種在1?]\1培養(yǎng)基+5.〇-10.〇11^/16-84+1.〇11^/110'+0.111^/1隱4誘導(dǎo)愈傷組織，暗培 養(yǎng)3天后，再到光照條件下培養(yǎng)10天，最高誘導(dǎo)率可達(dá)100%。附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/ L，ρΗ5· 5。培養(yǎng)溫度為（26 士 1) °C，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光照時(shí)間12-14h/d ;(見附 圖2)
[0047] 表1不同激素配比對(duì)油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的效果影響
[0048]

【權(quán)利要求】
1. 油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法，其特征在于，包括以下步驟： 將油桐成熟胚在無(wú)菌條件下萌發(fā)30天的下胚軸，在無(wú)菌條件下切成長(zhǎng)為0. 5-1. Ocm 的小塊，接種到WPM+5. O-Κλ 0mg/L6-BA+L Omg/L ΚΤ+0. lmg/L NAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷 組織，暗培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)10天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為 2100-22001X，光照時(shí)間12-14h/d ;然后經(jīng)過(guò)不定芽分化、繼代增殖、壯苗和生根培養(yǎng)獲得 完整植株；最后進(jìn)彳了煉苗、移栽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法，其 特征在于，不定芽分化的具體過(guò)程如下：將下胚軸誘導(dǎo)的質(zhì)地較好的愈傷組織接種到 WPM+0. 5-1. 0mg/L6-BA+0. 01-0. 05mg/L NAA+2. Omg/L GA3 的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的分化培 養(yǎng)，暗培養(yǎng)1天后，轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)25-30天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為 2100-22001x,光照時(shí)間 12-14h/d。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法，其特征 在于，繼代增殖培養(yǎng)的具體過(guò)程如下：將愈傷組織分化培養(yǎng)得到的健壯不定芽切下接種到 WPM+2. 0-3. Omg/L ΚΤ+0. 05mg/L IAA+2. Omg/L GA3的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的增殖培養(yǎng)，暗 培養(yǎng)1天后，在光照條件下培養(yǎng)25-30天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001X， 光照時(shí)間12_14h/d。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法，其 特征在于，壯苗培養(yǎng)的具體過(guò)程如下：將增殖培養(yǎng)得到的芽轉(zhuǎn)接到WPM+0. 5-1.0mg/L NAA+1. 0-2. Omg/L GA3的培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)1天后，在光照條件下培養(yǎng)15-20 天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光照時(shí)間12-14h/d。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法，其特征在 于，生根培養(yǎng)的具體過(guò)程如下：將壯苗培養(yǎng)獲得2-4cm的苗接到1/4MS+0. 1-0. 3mg/L IBA 的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，暗培養(yǎng)3-5天，再轉(zhuǎn)到光照下培養(yǎng)5-7 天即可生根，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光照時(shí)間12-14h/d。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法，其特征在 于，煉苗、移栽的具體過(guò)程如下： 將生根后的苗先在人工氣候箱中進(jìn)行移栽前煉苗，煉苗保持空氣相對(duì)濕度為80%以 上，3-5天后從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到營(yíng)養(yǎng)杯中，基質(zhì)為泥炭土 ：珍珠 巖：黃土 = 2:1:1，用薄膜蓋住營(yíng)養(yǎng)杯口，保持恒定的氣候條件，兩周后取出薄膜，逐步 進(jìn)行正常水肥管理。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法， 其特征在于，不定芽分化的培養(yǎng)基為：1?]?+1.〇11^/16-84+0.0111^/1嫩4+2.〇11^/16八 3。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法， 其特征在于，壯苗培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為：WPM+0. 5-1. 0mg/L NAA+2. 0mg/L GA3。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法，其特征在 于，下胚軸的獲得過(guò)程如下： 選取成熟的油桐當(dāng)年生種子，取除種皮，將種仁用自來(lái)水沖洗5-8min，然后浸泡 15-20h，中間換水3-4次，然后在超凈工作臺(tái)中用0. 1%的HgCl2消毒3-5min，用無(wú)菌水沖 洗4-6次，接種在1/2MS基本培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3-5天，再轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)20-30天 即可使用下胚軸進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光 照時(shí)間12-14h/d。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及高效再生植株的方法，其特征 在于，所述方法中用到的培養(yǎng)基均附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH調(diào)至5. 4-5. 8。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104094848SQ201410326807
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】譚曉風(fēng), 李澤, 張琳, 盧錕, 龍洪旭, 吳玲利, 林青, 呂佳斌 申請(qǐng)人:中南林業(yè)科技大學(xué)