北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法
【專利摘要】一種可以代替冬蟲夏草入藥、能代替天然冬蟲夏草藥源的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法。技術(shù)方案是包括下列步驟：（1）母種制備；（2）母種轉(zhuǎn)原種和栽培種；（3）懸浮液菌種或/液體菌種的制備；（4）北冬蟲夏草菌種的人工栽培。
【專利說(shuō)明】北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法領(lǐng)域，尤其是一種北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草是我國(guó)特有的一類珍貴藥材，具有極高的醫(yī)療保健價(jià)值加經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在 國(guó)內(nèi)外享有盛譽(yù)，素有"東方傳奇式珍寶"之美稱，是我國(guó)傳統(tǒng)的出口創(chuàng)匯商品，所以，冬蟲 夏草是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥寶庫(kù)中的一朵奇葩。
[0003] 唯有冬蟲夏草的醫(yī)療保健價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高，所以在國(guó)內(nèi)外真菌界、醫(yī)藥界、食 品界、生物界等多年來(lái)致力于研究開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。冬蟲夏草具有抗疲勞、耐缺氧、抗衰老、抗 腫瘤以及提高人體免疫功能等多種醫(yī)療保健作用。對(duì)人體可起到滋肺補(bǔ)腎、止血化痰、平 喘、擴(kuò)張氣管、鎮(zhèn)靜抗各類細(xì)菌、降血壓等作用。冬蟲夏草中含有蟲草素、沖草酸多種人體必 需氨基酸，有益微量元素的維生素、蟲草多糖、超氧化物歧化酶（S0D)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗 癌抗衰老的活性物質(zhì)，主要成份之一蟲草素是一種具有抗生作用和抑制細(xì)胞分裂作用的物 質(zhì)，能抑制癌細(xì)胞的增生。國(guó)內(nèi)外同位素檢測(cè)技術(shù)對(duì)冬蟲夏草研究證明冬蟲夏草中蟲草素 和沖草酸不僅具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、益精定喘的作用，而且能明顯地對(duì)抗細(xì)胞衰老。
[0004] 冬蟲夏草生長(zhǎng)在我國(guó)西部與西南部的高寒地區(qū)，生長(zhǎng)環(huán)境特殊，資源有限，隨著多 年來(lái)國(guó)內(nèi)外的深入研究，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到冬蟲夏草對(duì)人體的醫(yī)療和滋補(bǔ)研究，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到 冬蟲夏草對(duì)人體的醫(yī)療和滋補(bǔ)所具有的重要價(jià)值，需求不斷增加，由于天然冬蟲夏草資源 本就不多，加上蟲草資源數(shù)量銳減，產(chǎn)量不斷下降，供求矛盾日益加劇，造成市場(chǎng)供求脫節(jié)， 價(jià)格昂貴，針對(duì)這種情況，投入對(duì)冬蟲夏草的人工引種馴化，栽培遺傳及應(yīng)用等方面的研究 工作之中，作為一種有發(fā)展?jié)摿Φ男录夹g(shù)新工藝，開(kāi)辟藥源生物發(fā)酵技術(shù)確實(shí)具有重大價(jià) 值和發(fā)展前途。
[0005] 由于冬蟲夏草生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性，人工培養(yǎng)作為冬蟲夏草近緣種的北冬蟲夏草受 到了關(guān)注。然而，在現(xiàn)有的北冬蟲夏草人工培養(yǎng)中，由于北冬蟲夏草菌種極其容易退化和衰 老、不易保藏，在栽培實(shí)踐中導(dǎo)致許多種植戶使用同一優(yōu)良菌種，甚至同樣制備和使用液體 菌種，卻不出草或很少出草。
[0006] 在現(xiàn)有的北冬蟲夏草人工培養(yǎng)，往往僅僅關(guān)注單一步驟的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條 件，未總體考慮到各個(gè)步驟的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，有時(shí)導(dǎo)致在某一步驟的培養(yǎng)效果雖 然好，但是卻可能影響到后續(xù)步驟的培養(yǎng)效果，從而導(dǎo)致總體培養(yǎng)效果較差。
[0007] 例如，CN1724641A公開(kāi)了一種北冬蟲夏草液體菌種營(yíng)養(yǎng)基的制備方法及其應(yīng)用， 它主要通過(guò)選取不同的原料，包括胡蘿卜、葡萄糖等物料進(jìn)行充分混合，再加入一定量的連 霉素等，進(jìn)行發(fā)酵，制備得北冬蟲夏草液體菌種營(yíng)養(yǎng)基。然后是在培育北冬蟲夏草過(guò)程中進(jìn) 行溫度、時(shí)間的不同控制，可以達(dá)到較好的培育效果。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，營(yíng)養(yǎng)基的制備方 法簡(jiǎn)單，操作方便；培養(yǎng)基在北冬蟲夏草的培育過(guò)程中可以取得較好的效果，縮短時(shí)間，溫 度控制要求低，遮光要求低等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的實(shí)施，可以有利于北冬蟲夏草的大力推廣與培 育。然而，在該專利文獻(xiàn)中，北冬蟲夏草總體培養(yǎng)效果欠佳，如產(chǎn)量不高。
[0008] CN101463325A公開(kāi)了一種北冬蟲夏草工廠化栽培方法，經(jīng)菌種制備、配料裝瓶、滅 菌、接種、培養(yǎng)、出草采收步驟工廠化栽培北冬蟲夏草，采用了常見(jiàn)的人工代料作為培養(yǎng)材 料，降低了生產(chǎn)成本，而且本發(fā)明獲得的北蟲草質(zhì)量穩(wěn)定性好，生物轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)。在該 專利文獻(xiàn)，成草率較低。
[0009] 非專利文獻(xiàn)"不同氮源對(duì)北冬蟲夏草生長(zhǎng)影響的研究"，楊宣華，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué) 院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），第26卷第3期，2008年5月，以硝酸鉀，蛋白胨、黃豆粉、硫酸銨、尿 素5種不同氮源對(duì)北冬蟲夏草的菌球數(shù)量、干重，菌絲生長(zhǎng)狀況及子實(shí)體的鮮重和干重進(jìn) 行研究，認(rèn)為液體培養(yǎng)的菌球最多的是蛋白胨，其次是黃豆粉，最差是硝酸鉀，固體斜面培 養(yǎng)基從菌絲長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看最好是蛋白胨，最差的是硝酸鉀，北冬蟲夏草最佳的氮源是黃豆粉。然 而，在專利文獻(xiàn)中所述優(yōu)選氮源對(duì)不同菌種的適應(yīng)性較差。
[0010] 本發(fā)明人的在先專利申請(qǐng)CN1935979A公開(kāi)了一種北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法。然 而，母種穩(wěn)定性較差，易退化和衰老。
[0011] 因此，目前亟需一種穩(wěn)定且有效的北冬蟲夏草培養(yǎng)方法。
[0012]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入研究，在先前研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)大量篩選和實(shí)驗(yàn)，從整體認(rèn)真 研究了每個(gè)培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，通過(guò)將每一步驟的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件 加以總體和協(xié)同考慮，提供如下可以代替冬蟲夏草入藥、能代替天然冬蟲夏草藥源的北冬 蟲夏草菌種培養(yǎng)方法。
[0014] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，包括下列步驟： (1)母種制備；（2)母種轉(zhuǎn)原種和栽培種；（3)懸浮液菌種或/液體菌種的制備；(4)北 冬蟲夏草菌種的人工栽培。
[0015] 所述的母種制備包括：（1)制作培養(yǎng)基；（2)試管母種制備；（3)試管母種的擴(kuò)大 培養(yǎng)；(4)出草試驗(yàn)；（5)組織分離制作母種。
[0016] 所述（1)母種制備制備優(yōu)選包括：將斜面菌種活化后分割成豌豆大小，每2?3塊 接種到一瓶液體培養(yǎng)基中，于25°C、100 r/min振蕩培養(yǎng)7天得等級(jí)為1的種，將培養(yǎng)好的等 級(jí)為1的種以8% (V/V)接種量接種到相同的液體培養(yǎng)基中，在所述等級(jí)為1的種相同條件 下培養(yǎng)20天，分別將各菌株胞外液經(jīng)0. 40 μπι膜過(guò)濾后進(jìn)行蟲草素含量測(cè)定，每組試驗(yàn)重 復(fù)3次，篩選得到所需母種。
[0017] 所述（2)試管母種制備優(yōu)選包括采用冬蟲夏草的組織直接切取蟲草菌核內(nèi)部的 一小塊菌索，〇. 2%升汞溶液和0. 1% ΚΝ03溶液分別表面消毒3 min，無(wú)菌水沖洗3?5次， 無(wú)菌條件下切去外層、避開(kāi)腸道，切取內(nèi)部黑色菌索〇. 4 cm左右，將菌索分別接種到8個(gè)基 本培養(yǎng)基中，在三角瓶中進(jìn)行1?8倍的擴(kuò)大培養(yǎng)，然后于生化培養(yǎng)箱中20°C靜置培養(yǎng)120 h〇
[0018] 在上述培養(yǎng)基中優(yōu)選加入占培養(yǎng)基總重量的0. 001%重量的吲哚基丙酸，并維持 培養(yǎng)基的pH為約6. 7,可以使子實(shí)體生長(zhǎng)良好并且使分化的子實(shí)體原基較多。
[0019] 所述的母種轉(zhuǎn)原種和栽培種包括：（1)培養(yǎng)基的配制、（2)母種轉(zhuǎn)管擴(kuò)大。
[0020] 所述的懸浮液菌種制備包括：（1)培養(yǎng)基配制、（2)滅菌、（3)接種培養(yǎng)。
[0021] 所述的液體菌種制作包括（1)液體菌種培養(yǎng)基配方、（2)接種培養(yǎng)。
[0022] 所述的北冬蟲夏草菌種人工栽培包括：（1)按培養(yǎng)基配方制作培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配 方選自以下5種中的任一種或多種： ① 炒大米93%，葡萄糖2 %，蛋白胨2%，檸檬酸0. 29 %，硫酸鎂0. 2%，蠶蛹粉2. 5 %， 維生素 B10. 01% ; ② 高粱米85%，蠶蛹粉10%，蔗糖1.99%，蛋白胨2%，磷酸二氫鉀0. 1%，硫酸鎂 〇. 1%，酵母粉〇. 8%，另加維生素 B10. 01% ; ③ 小米95 %，葡萄糖3. 49 %，酵母膏1. 2 %，磷酸二氫鉀0. 1 %，硫酸鎂0. 2 %，另加維生 素 B10. 01% ; ④ 高粱米45%，玉米渣40%，小米10%，蔗糖2%，蛋白胨2%，酵母粉0. 8%，磷酸二氫 鉀0. 1%，硫酸鎂0. 1% ; ⑤ 大米50 %，麥麩25 %，玉米粉9. 99 %，葡萄糖（或蔗糖）2 %，木屑10 %，蠶蛹粉2 %， 尿素0. 1%，硫酸鎂0. 9%，另加維生素 B10. 01% ; (2)拌料裝瓶；（3)滅菌；(4)接種；（5)培養(yǎng)室培養(yǎng)；(6)后期管理；(7)采收。
[0023] 所述的母種制備中，制作培養(yǎng)基配方為兩種之一： (1)葡萄糖20克、瓊脂20克、去皮土豆200克（煮汁）、水1000毫克（PDA培養(yǎng)基）； (2)燕麥片30克、瓊脂20克、水1000毫升； 試管母種擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為下列三種之一： (1) 蛋白胨10克，葡萄糖10克，含脂蠶蛹10克，全脂奶粉10克，磷酸二氫鉀15克，瓊 脂20克，水1000毫升； (2) 葡萄糖10克，蛋白胨10克，酵母膏1克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0. 5克，瓊脂20 克，生長(zhǎng)素5暈升，水1000暈升； (3) 去皮土豆200克（煮汁），葡萄糖20克（或蔗糖40克），磷酸二氫鉀1. 5克，瓊脂 20克，維生素 B110克，增長(zhǎng)靈0. 5克，水1000毫升。
[0024] 母種轉(zhuǎn)原種和栽培種的培養(yǎng)基為下列之一： (1) 蔗糖10克，蛋白胨10克，瓊脂15克，硫酸鎂0. 5克，維生素 B15片1000毫升； (2) 葡萄糖20克，瓊脂20克，土豆200克（煮汁），維生素 B13片，蛋白胨5克，磷酸二 氫鉀（試劑）0.5克。
[0025] 懸浮液菌種的培養(yǎng)基為下列之一： (1) 磷酸二氫鉀3克，食鹽3克，維生素 B15片，葡糖糖15克，硫酸鎂0. 5克，味精0. 2 克，黃豆粉15克，水1000毫升； (2) 玉米粉12克，酵母粉3克，磷酸二氫鉀1克，葡萄糖22克，黃豆粉10克，維生素 B1180-200毫，硫酸鎂0.5克，水1000毫升； (3) 葡糖糖35克，蛋白胨25克，磷酸二氫鉀1克，食鹽2. 5克，維生素 B13片。
[0026] 液體菌種制備的培養(yǎng)基為下列之一： (1) 蛋白胨12克、酵母粉25克、玉米粉10克、黃豆粉10克、磷酸二氫鉀0. 5克、硫酸鎂 〇. 3克、味精0. 1克、葡萄糖20克、食鹽0. 3克、維生素 B1100毫克、水1000毫升； (2) 葡萄糖10克、磷酸二氫鉀0. 5克、硫酸鎂1克、氯化鈣1克、氨基酸復(fù)合粉5克、去 皮土豆250克（煮汁）、蟬蛹20克、水1000毫升； (3)磷酸二氫鉀0. 05克、維生素 B11150毫克、蛋白胨15克、葡萄糖25克、酵母粉10 克、硫酸鎂〇. 05克、食鹽8克、水1000毫升。
[0027] 本發(fā)明的效果是：通過(guò)本發(fā)明的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，能夠增加冬蟲夏草的 產(chǎn)量，從根本上降低冬蟲夏草的價(jià)格，為廣大患者減輕疾病的痛苦發(fā)揮作用，為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī) 藥寶庫(kù)中又增加另一朵奇葩。
[0028] 應(yīng)指出的是，本發(fā)明的培養(yǎng)基體系是本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量創(chuàng)造性勞動(dòng)所篩選出的， 這樣的培養(yǎng)基體系在現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有記載，也不是北冬蟲夏草人工栽培的常規(guī)技術(shù)手段， 需要付出過(guò)度勞動(dòng)才能夠加以確定。通過(guò)本發(fā)明的培養(yǎng)基體系，生物學(xué)效率可達(dá)60%，遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于現(xiàn)有的約45%生物學(xué)效率。利用本發(fā)明培養(yǎng)基體系獲得最大蟲草產(chǎn)量為36. 65g/L，t匕 現(xiàn)有所知的蟲草產(chǎn)量高出約50%。
[0029] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0030]

【具體實(shí)施方式】
[0031] 北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，包括下列步驟： 一、母種制備 母種制備采用孢子分離法，屬于有性繁殖法。它是在無(wú)菌條件下利用菌類子實(shí)體自行 彈射孢子的原理，使孢子散落在人工培養(yǎng)基上，通過(guò)培養(yǎng)，得到原始菌系體，然后再移接入 斜面試管進(jìn)行培養(yǎng)。具體包括下列步驟： (一）制作培養(yǎng)基 培養(yǎng)基可以選擇下列兩種配方進(jìn)行制作： 1、 葡萄糖20克、瓊脂20克、去皮土豆200克（煮汁）、水1000毫克（PDA培養(yǎng)基） 2、 燕麥片30克、瓊脂20克、水1000毫升 配制方法：燕麥片加水，在沸騰水浴中加熱1小時(shí)用兩層紗布濾后加水補(bǔ)足到配制量， 加瓊脂深化后裝入培養(yǎng)器滅菌即成。
[0032](二）試管母種制備 1、一直徑25厘米左右的搪瓷盆，上襯4層紗布，在紗布上放一中號(hào)培養(yǎng)器（器內(nèi)裝有 培養(yǎng)基），并在器內(nèi)放一不銹鋼三角架，供插蟲草子座用，在培養(yǎng)器上方加蓋一個(gè)玻璃鐘罩， 連同瓷盤一起用紗布包好，在147千帕壓力下滅菌1小時(shí)，冷卻后備用。
[0033] 2、選取新鮮、優(yōu)質(zhì)、成熟、尚未散發(fā)孢子的正常蟲草子座用清水沖洗干凈、晾干。
[0034] 3、將上述滅過(guò)菌的整套裝置去掉紗布，連同蟲草子實(shí)體0. 1%升汞液（或75%酒 精）無(wú)菌水等一起放入接種箱內(nèi)嚴(yán)格消毒，消毒之后，在無(wú)菌條件下，用0.1%升汞液（或 75%酒精）對(duì)蟲草子實(shí)體表面消毒，并用無(wú)菌水清洗表面殘留藥液，然后拆開(kāi)鐘罩，將蟲草 子實(shí)體插放于三角架上，再蓋好鐘罩。用紗布將鐘罩底部周圍塞好，并往紗布上倒〇. 1%升 汞水，最后將整套孢子采集裝置從接種箱取出，放入恒溫箱中（25攝氏度左右），使孢子下 落，待培養(yǎng)基上有蟲草菌落出現(xiàn)時(shí)，在無(wú)菌條件下挑取單個(gè)或多個(gè)菌落移接至試管斜面培 養(yǎng)基上培養(yǎng)（15攝氏度-20攝氏度恒溫條件下避光培養(yǎng)）培養(yǎng)成功后，即可移接、擴(kuò)制。
[0035] (三）、試管母種的擴(kuò)大培養(yǎng) 經(jīng)用分離方法制成試管母種后，還需進(jìn)一步轉(zhuǎn)管移植，擴(kuò)大培養(yǎng)。母種種植擴(kuò)繁除了能 大大增加菌種數(shù)量外，還能有效避免菌種老化或生長(zhǎng)不良，防止或消除雜菌感染。
[0036] 試管母種擴(kuò)大培養(yǎng)基配方： 1、蛋白胨10克，葡萄糖10克，含脂蠶蛹10克，全脂奶粉10克，磷酸二氫鉀15克，瓊脂 20克，水1000毫升。
[0037] 2、葡萄糖10克，蛋白胨10克，酵母膏1克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0.5克，瓊脂 20克，生長(zhǎng)素5暈升，水1000暈升。
[0038] 3、去皮土豆200克（煮汁），葡萄糖20克（或蔗糖40克），磷酸二氫鉀1.5克，瓊 脂20克，維生素 B110克，增長(zhǎng)靈0. 5克，水1000毫升。
[0039] 有性蟲草菌絲生長(zhǎng)較慢，在20攝氏度的恒溫下，一般需要經(jīng)3-4個(gè)月的培養(yǎng)才能 長(zhǎng)滿斜面，當(dāng)見(jiàn)到試管斜面培養(yǎng)基有1-2厘米大的菌落，菌凸起且表面曲折不平，顏色為桔 黃色即說(shuō)明試管用母已經(jīng)培養(yǎng)完成。
[0040] (四）、出草試驗(yàn) 蟲草有性分離的菌種必須在種植前做出草試驗(yàn)，蟲草新分離的菌種不一定都能出草， 因此必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的出草試驗(yàn)，菌絲的有性生殖性狀穩(wěn)定以后方可投入生產(chǎn)，對(duì)于出草試 驗(yàn)中表現(xiàn)位出草較早、產(chǎn)量較高的菌種要及時(shí)進(jìn)行擴(kuò)繁和保藏。
[0041] (注：分離培養(yǎng)的母種，不能直接用于生產(chǎn)，必須經(jīng)過(guò)移植馴化，使其適應(yīng)栽培條 件，并擴(kuò)大數(shù)量，方可使用。） (五）、組織分離制作母種 選用優(yōu)良、純凈、健壯、適齡的天然蟲草作無(wú)性菌組織分離，是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵。 北冬蟲夏草無(wú)性培育代數(shù)分為母種、原種和栽培種3級(jí)，母種是組織分離培育成的菌絲體， 原種和栽培種是在試管母種的基礎(chǔ)上擴(kuò)大培育而成菌種，母種通常不宜直接栽培，而主要 用于轉(zhuǎn)管擴(kuò)大和制作原種，以及用作菌種保存，原種則可以用于栽培生產(chǎn)，也可以繼續(xù)擴(kuò)大 繁殖成栽培種主要用于栽培生產(chǎn)。
[0042] 組織分離法為無(wú)性繁殖，孢子分離法屬有性繁殖，孢子分離法技術(shù)性強(qiáng)，操作復(fù) 雜，難度較大，不適合一般人采用，而組織分離法簡(jiǎn)單，成功率高。下面介紹母種分離方法。
[0043] 1、無(wú)菌操作的概念，無(wú)菌操作技術(shù)是成功與失敗的關(guān)鍵，必須作好正確的思想準(zhǔn) 備，不能忽視。整個(gè)操作在接種箱進(jìn)行或在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行操作。菌種通過(guò)所暴露的空間，必 須是無(wú)菌區(qū)，菌種與容器外的空間通道口（管口、瓶口）必須用酒精燈火焰滅菌封閉。各 種工具和菌種接觸之前，都必須用酒精燈火焰滅菌、冷卻后再進(jìn)行接種，棉塞塞入試管口部 分，拔出后不得與未滅菌物接觸，以防感染。
[0044] 2、制種工具： (1)天平1臺(tái)，稱量為500克的普通天平。主要是稱取種營(yíng)養(yǎng)料數(shù)量。
[0045] (2)試管：一般選用18毫米X 180毫米或20毫米X 200毫米規(guī)格試管 (3)量杯：主要用于計(jì)量水的體積，規(guī)格用500暈升或1000暈升。
[0046] (4)塑料小漏斗：用于將培養(yǎng)基裝入試管 (5)接種鏟、接種刀、接種針及長(zhǎng)柄鑷子：用于移接菌種。
[0047] (6)單面刀片：用于切取蟲草組織分離母種。
[0048] (7)酒精燈：用于接種時(shí)一切工具進(jìn)行火焰滅菌用。
[0049] 3、滅菌藥液 (1) 福爾馬林：含甲醛37% -40%用于消毒熏蒸，每立方米空間需要2-5毫升，或用高 錳酸鉀（PP粉），以每立方米用5克，加10毫升福爾馬林溶液混合熏蒸。
[0050] (2)升汞溶液0. 1 %，升汞液用于蟲草組織分離和表面消毒升汞溶液配制方法有 兩種： ①、先配成濃的原液，用前再稀釋到所需濃度。原液成分如下：升汞20克、鹽酸 (濃）100毫升、配制消毒液時(shí)，可取原液5毫升，加蒸餾水或潔凈水1000毫升稀釋。
[0051] ②直接配制：升汞液1克、鹽酸（濃）25毫升、水1000毫升，先將升汞液溶于鹽酸 中，然后再加水稀釋。
[0052] (3)無(wú)菌水：經(jīng)高溫滅菌的潔凈水（用蒸餾水更好），用于清洗蟲草體表面。
[0053] 4、培養(yǎng)基配制 ⑴葡萄糖20克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0. 5克，瓊脂20克，水1000毫升 (2) 蛋白胨10克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0. 5克，瓊脂20克，生長(zhǎng)素5毫升，葡萄糖 10克，酵母膏1克，水1000毫升。
[0054] (3)蔗糖30克，磷酸二氫鉀1. 2克，硫酸鎂0. 3克，天門冬酰胺1克，硝酸鈉0. 5 克，氯化鉀0. 5克，瓊脂20克，水1000毫升。
[0055] 配置方法：配制常用馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂CPDA、培養(yǎng)基，將新鮮土豆洗凈去皮去 牙眼后稱取200克，切成小塊或條薄片均可。加水1000毫升煮沸20分鐘，至土豆軟而不爛 時(shí)，用事先浸濕擰干的4-6層紗布過(guò)濾去渣，取其汁液于鍋中。爾后加入葡萄糖20克，再加 瓊脂20克，硫酸鎂0. 5克，加水1000毫升，繼續(xù)加熱至瓊脂溶化煮沸后即成培養(yǎng)溶液，可趁 熱迅速分裝入試管。
[0056] 5、高壓滅菌 將分裝好的試管培養(yǎng)基放入手提式高壓鍋進(jìn)行滅菌，等燒至49千帕（0. 5千克/厘 米2)壓力時(shí)，打開(kāi)排氣閥排出冷氣，使指針回零，然后繼續(xù)加熱到117.68-147. 1千帕 (1. 2-1. 5千克/厘米）壓力時(shí)，保持30-50分鐘后?；?，待指針回到零后，打開(kāi)鍋蓋，取出試 管，并趁熱把試管擺成斜面。
[0057] 6、出發(fā)菌株的選擇 出發(fā)菌株有兩種：一種是天然蟲草子實(shí)體，另一種是人工栽培的子實(shí)體，選擇生長(zhǎng)周期 短，易發(fā)育子座，產(chǎn)量高，藥用及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大，生長(zhǎng)正常，無(wú)病蟲害，沒(méi)有散發(fā)孢子的健壯子 座作為母種分離出發(fā)菌株。
[0058] 先將選好后的新鮮活性的出發(fā)菌株洗凈晾干，連同試管培養(yǎng)基及滅過(guò)菌的工具， 刀片，無(wú)菌水鑷子，一同放入接種箱，然后對(duì)接種箱消毒。
[0059] 方法是按接種體積計(jì)算：每立方米空間用福爾馬林溶液3毫升，加熱熏蒸30分鐘， 或按每立方米空間用福爾馬林10毫升加入高錳酸鉀5克熏蒸40-60分鐘（先將高錳酸鉀 倒入瓷碗內(nèi)，再將福爾馬林倒入，迅速關(guān)閉箱門。再用紫外線燈照射20-30分鐘，然后按無(wú) 菌操作，用〇. 1 %升汞溶液（或75%酒精）對(duì)菌種表面消毒，方法是用脫脂棉浸蘸0. 1升 汞液迅速涂擦蟲草組織表面，一般需擦3-5次，每次不超過(guò)1分鐘，最后用無(wú)菌水清洗1-3 次表面殘留藥液。經(jīng)表面消毒后，用單刀切去外表層，切取其內(nèi)部組織一小塊（最好從子 實(shí)體有龜背狀花紋的頂端切取組織塊）可獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的菌株，迅速移接在試管培養(yǎng)基中 央，并迅速塞上棉塞，切取的組織塊大小要適宜，一般1毫米見(jiàn)方，過(guò)大易雜菌感染，過(guò)小則 易將組織殺死，全部接種完畢后，將試管移出接種箱，在20攝氏度-28攝氏度的恒溫箱中培 養(yǎng)，一般3-4個(gè)月即可得到母種。
[0060] 二、母種轉(zhuǎn)原種和栽培種 原種和栽培種來(lái)源于母種的擴(kuò)大，原種是天然蟲草菌株，通過(guò)人工培訓(xùn)后，提出優(yōu)質(zhì)菌 落轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)各個(gè)階段不同的溫度、濕度，營(yíng)養(yǎng)物得到一級(jí)母種。
[0061] 母種只能作菌種使用，不得直接栽培，所以必須作原種轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，一般原種也不易 直接栽培，因?yàn)樵N來(lái)源極少，代價(jià)高，需多次轉(zhuǎn)管培養(yǎng)成栽培種。
[0062] (一）、培養(yǎng)基的配制 1、蔗糖10克，蛋白胨10克，瓊脂15克，硫酸鎂0. 5克，維生素 B15片1000毫升。
[0063] 2、葡萄糖20克，瓊脂20克，土豆200克（煮汁），維生素 B13片，蛋白胨5克，磷酸 二氫鉀（試劑）0.5克。
[0064] 配制方法：現(xiàn)將各種營(yíng)養(yǎng)料稱取等量，合起調(diào)勻，再將1000毫升水加熱使瓊脂融 化，然后將營(yíng)養(yǎng)料倒入，煮沸時(shí)間為5-10分鐘，爾后調(diào)節(jié)值為PH5-6,趁熱分裝試管，經(jīng)過(guò)高 壓滅菌后擺成斜面?zhèn)溆谩?br> [0065](二）母種轉(zhuǎn)管擴(kuò)大 接種箱及一切用具。事先要進(jìn)行嚴(yán)格消毒，接種人員在接種前必須用肥皂或2%的來(lái)蘇 兒溶液洗手以防雜菌帶入。
[0066] 轉(zhuǎn)管操作 將母種試種口在酒精燈火焰上灼燒，同時(shí)拔出棉塞，然后將所有工具也在酒精燈灼燒， 等冷卻后進(jìn)行母種切取轉(zhuǎn)管，轉(zhuǎn)管時(shí)工具勿碰到管壁，在火焰旁迅速轉(zhuǎn)入試管中央，注意不 要把培養(yǎng)基劃破，也不能使菌種粘到試管壁上，抽出接種工具，將棉塞旋緊。
[0067] 一支母種試管一次可擴(kuò)接25支-35支試管，接種完畢將接好的試管貼上標(biāo)簽，注 明菌名年月日，接種人，7-10支為一捆用牛皮紙?jiān)o試管上部，結(jié)束后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 為了避免溫度突變，影響菌絲生長(zhǎng)發(fā)育，最好在恒溫箱中培養(yǎng)，一般在20攝氏度-28攝氏度 下，保溫培養(yǎng)10天左右，即成二級(jí)母種（可以作培養(yǎng)栽培種，也可以直接種植）。
[0068] 用上法移接擴(kuò)制的北冬蟲夏草二級(jí)母種，即可以作純菌種保存，也可以直接用來(lái) 生產(chǎn)培種，還可以直接種植。
[0069] 一般來(lái)說(shuō)1支原菌種擴(kuò)繁次數(shù)不宜太多，一般不得超過(guò)3次，否則易引起菌種退 化。
[0070] 三、懸浮液菌種的制備 懸浮液屬液體菌種的范疇，但是懸浮在很大程度上只能是母種和原種的稀釋，而液體 菌種才是蟲草的復(fù)壯繁殖，在相同的用量上懸浮液效果不如液體菌種，懸浮液菌種制作比 較簡(jiǎn)單，投資較少，栽培經(jīng)驗(yàn)不足者可以先用懸浮制作技術(shù)，只是栽培時(shí)菌種用量大些以提 高感染成功率。
[0071] ( 一）、培養(yǎng)基配制 1、磷酸二氫鉀3克，食鹽3克，維生素 B15片，葡糖糖15克，硫酸鎂0. 5克，味精0. 2克， 黃豆粉15克，水1000毫升。
[0072] 2、玉米粉12克，酵母粉3克，磷酸二氫鉀1克，葡萄糖22克，黃豆粉10克，維生素 B1180-200毫，硫酸鎂0. 5克，水1000毫升。
[0073] 3、葡糖糖35克，蛋白胨25克，磷酸二氫鉀1克，食鹽2. 5克，維生素 B13片。
[0074] 配制方法：按上述等量稱取放入鍋內(nèi)煮沸10-15分鐘，然后倒入量杯中沉淀15-20 分鐘后，把上層液裝入500毫升鹽水瓶中，每瓶裝量為200-250毫升。
[0075] (二）滅菌 用手提式高壓滅菌鍋，將懸浮液瓶裝鍋后擰緊螺旋，升溫火力應(yīng)該逐漸加大，氣壓達(dá)49 千帕（0.5千克/厘米2)時(shí)打開(kāi)排氣閥排出冷氣。待壓力表回零時(shí)，再關(guān)上排氣閥重新升 溫，當(dāng)氣溫升到147 (1. 5千克/厘米2)時(shí)保持40-60分鐘斷火冷卻待壓力表回零時(shí)，打開(kāi) 排氣閥，排出殘留蒸汽掀開(kāi)鍋蓋，取出滅菌液冷卻后待用。
[0076](三）接種培養(yǎng) 全過(guò)程都在無(wú)菌條件下進(jìn)行，有關(guān)操作辦法請(qǐng)參閱固體菌種，每只二級(jí)試管菌可接4-6 瓶懸浮液。
[0077] 將接好的懸浮液放在黑暗處，在20-28下培養(yǎng)5-7天，見(jiàn)瓶?jī)?nèi)懸浮液表面有白色菌 絲時(shí)搖晃瓶體，使瓶?jī)?nèi)菌絲與液體均勻，懸浮液大多都是在自然溫度下，培養(yǎng)，不是在恒溫 箱種，大多數(shù)出現(xiàn)白色菌絲搖晃不開(kāi)，這是正常現(xiàn)象，在搖晃時(shí)表面結(jié)塊的蟲草菌的分生孢 子就像花粉一樣肉眼看不到卻已進(jìn)入懸浮液，在此種現(xiàn)象出現(xiàn)后再經(jīng)4-5天后即可栽培使 用。
[0078] 說(shuō)明：懸浮液，優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)菌種時(shí)間短，易學(xué)，工序簡(jiǎn)便，成功率高，產(chǎn)量高，發(fā)菌 旺。
[0079] 缺點(diǎn)是：懸浮液菌種制作好后，一是菌種用量大，二是不易長(zhǎng)久保存。
[0080] 四、液體菌種制作 目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)菌種大多數(shù)都采用20世紀(jì)70年代延續(xù)下來(lái)的固體菌種，其費(fèi)用高，勞 動(dòng)強(qiáng)度大，周期長(zhǎng)，產(chǎn)量不穩(wěn)定，現(xiàn)在我們采用單級(jí)培養(yǎng)法又叫液體制種速成法，逐步實(shí)現(xiàn) 多級(jí)培養(yǎng)方法，來(lái)實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)周期短，無(wú)感染的高效菌種。
[0081] 單級(jí)培養(yǎng)是投資最小的液體菌種小型生產(chǎn)設(shè)備，全套設(shè)備也只不過(guò)百元左右，安 裝簡(jiǎn)便，器材易購(gòu)，此套裝裝置生產(chǎn)周期短，8-10天即可培養(yǎng)出第一批蟲草液體菌種，生產(chǎn) 量較大，根據(jù)需要1次可生產(chǎn)1000-2000毫升液體菌種，并可連續(xù)生產(chǎn)，栽培方便，只要把 液體菌種噴到培養(yǎng)基表面即可發(fā)菌快，是固體發(fā)菌時(shí)間一半，產(chǎn)量高，是固體菌產(chǎn)量的2 倍，并從根本上解決了感染時(shí)間，成功率高，用特制的過(guò)濾器完全杜絕了雜菌，酵母菌的感 染，成功率高達(dá)95%以上，用傳統(tǒng)方法種植蟲草需要6-8個(gè)月的時(shí)間，采用液體菌種，只需 50-60天，極大的縮短了蟲草生產(chǎn)周期。
[0082](一）、液體菌種培養(yǎng)基配方 1、蛋白胨12克、酵母粉25克、玉米粉10克、黃豆粉10克、磷酸二氫鉀0. 5克、硫酸鎂 〇. 3克、味精0. 1克、葡萄糖20克、食鹽0. 3克、維生素 B1100毫克、水1000毫升。
[0083] 2、葡萄糖10克、磷酸二氫鉀0. 5克、硫酸鎂1克、氯化鈣1克、氨基酸復(fù)合粉5克、 去皮土豆250克（煮汁）、蟬蛹20克、水1000毫升。
[0084] 3、磷酸二氫鉀0. 05克、維生素 B11150毫克、蛋白胨15克、葡萄糖25克、酵母粉10 克、硫酸鎂〇. 05克、食鹽8克、水1000毫升。裝瓶滅菌 選用上述配方，按所需要量（此處以1000毫升培養(yǎng)料為例）稱好各種原料，放入鍋內(nèi)， 加水1300毫升加熱煮沸5-10分鐘，冷卻，沉淀1小時(shí)，取上層清夜裝入廣口瓶?jī)?nèi)，裝量為瓶 的7/10,加入3-6滴食用油為消泡劑，防止通氣時(shí)培養(yǎng)液產(chǎn)生氣泡沫，將瓶口用代替棉塞塞 好，放在鍋內(nèi)，進(jìn)行高壓滅菌，高壓147千帕下滅菌40-60分鐘，滅菌結(jié)束自然冷卻到30°C以 下，準(zhǔn)備接種。
[0085] (二）、接種培養(yǎng) 按無(wú)捆操作要求，在接種箱內(nèi)接入二級(jí)種和栽培種即可，具體操作要領(lǐng)與母種制作相 同。
[0086] 接種后放在20°C _25°C的條件下靜止培養(yǎng)2天，觀察液基表面無(wú)異色，清晰即可通 氣，先啟動(dòng)小通氣量，吹氧3天，再啟動(dòng)大氣量吹氧3-4天，這樣通氧攪拌較好，培養(yǎng)過(guò)程中， 每天至少檢查一次，觀察液基是否出現(xiàn)混濁，如出現(xiàn)混濁說(shuō)明被感染，應(yīng)廢掉，如果液基內(nèi) 清晰有小菌絲片出現(xiàn)為正常，待菌絲片直徑達(dá)〇. 3-1毫米貨菌絲球充滿液基，說(shuō)明液體菌 種制作完成。
[0087] 注：液體菌種，可以有效地降低成本，發(fā)菌速度快，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)發(fā)菌均勻，缺點(diǎn)是：液 體菌種制作好后必須及時(shí)使用，暫時(shí)不用，在常溫下（30°C以下）一般可放置2-3天，最長(zhǎng)時(shí) 間不得超過(guò)7天，時(shí)間太長(zhǎng)容易老化和變質(zhì)。
[0088] 五、北冬蟲夏草人工栽培 (一）、按培養(yǎng)基配方制作培養(yǎng)基 1、炒大米93%，葡萄糖2%，蛋白胨2%，檸檬酸0.3%，硫酸鎂0.2%，蠶蛹粉2. 5%，另 加維生素 B10. 01%。
[0089] 2、高粱米85 %，蠶蛹粉10 %，蔗糖2 %，蛋白胨2 %，磷酸二氫鉀0. 1 %，硫酸鎂 〇. 1%，酵母粉0.8%，另加維生素 B10. 01%。
[0090] 3、小米95%，葡萄糖3. 5%，酵母膏1.2%，磷酸二氫鉀0. 1 %，硫酸鎂0.2%，另加 維生素 B10. 01%。
[0091] 4、高粱米45%，玉米渣40%，小米10%，蔗糖2%，蛋白胨2%，酵母粉0.8%，磷酸 二氫鉀0. 1%，硫酸鎂0. 1%。
[0092] 5、大米50 %，麥麩25 %，玉米粉10 %，葡萄糖（或蔗糖）2 %，木屑（闊葉樹(shù)木 為宜）10%，蠶蛹粉（可用中藥店僵蠶代替）2%，尿素0. 1%，硫酸鎂0.9%，另加維生素 B10. 01%。
[0093] (二）、拌料裝瓶 上述培養(yǎng)基任選一種，稱取等量拌料均勻，含水量必須保持在60 % -65 %，PH值5-7、分 別裝入500毫升罐頭瓶中，每瓶可裝干料50克左右，營(yíng)養(yǎng)料水分另計(jì)，爾后可用聚乙稀或聚 丙稀薄膜封口。
[0094] (三）、滅菌 滅菌有兩種方法：一種是高壓滅菌；一種是常壓滅菌。這里只談常壓滅菌，常壓滅菌有 利于大行生產(chǎn)，容量大，滅菌時(shí)間必須保持在8-10小時(shí)即可，開(kāi)始低溫在50°C下進(jìn)行3-4小 時(shí)（如升溫快，溫度過(guò)高會(huì)引起瓶子暴破），爾后進(jìn)行高溫l〇〇°C大火燒至4-6小時(shí)，滅菌完 后進(jìn)行出鍋冷卻，冷卻后準(zhǔn)備接種，接種溫度不得超過(guò)20°C。
[0095](四）、接種 在無(wú)菌的條件下進(jìn)行操作，首先具備一個(gè)煤球火爐把火燒旺，用消過(guò)毒的注射器在火 焰上方抽取液體菌種，以每瓶5-10毫升均勻地注射入滅過(guò)菌的培養(yǎng)瓶種，接種完畢，將培 養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。
[0096] (五）、培養(yǎng)室培養(yǎng) 培養(yǎng)瓶進(jìn)室前，必須先提前進(jìn)行消毒，消毒之后，即可把接過(guò)種的瓶子放在床架上，每 個(gè)瓶稍留一點(diǎn)空間，以利于通風(fēng)散熱，同時(shí)室內(nèi)必須保持適宜溫度，一般情況下15-25天菌 絲可以長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，并形成子實(shí)體原基，45天-60天即可成熟，蟲草培養(yǎng)管理可分為兩個(gè)階 段。
[0097] 1、溫度：北冬草菌絲在6°C -30°C均可生長(zhǎng)，6°C以下停止生長(zhǎng)，30°C以上生長(zhǎng) 停滯，甚是死亡，適宜溫度為15°C -25°C，菌絲發(fā)育初期階段，室溫為15°C -20°C，后期為 23°C -25°C，超過(guò)25°C不易形成子座。
[0098] 2光線：菌絲階段，管線黑暗菌絲發(fā)育較快，但光強(qiáng)則不易生出子座，而且生長(zhǎng)緩 慢，過(guò)早進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，影響產(chǎn)量和質(zhì)量，必須等菌絲長(zhǎng)滿瓶面扎到瓶底才能見(jiàn)光。
[0099] 3、濕度：蟲草在瓶?jī)?nèi)密封生長(zhǎng)，空氣濕度影響不大，但長(zhǎng)時(shí)間干燥，也會(huì)使瓶?jī)?nèi)水 分慢慢蒸發(fā)，影響后期菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體形成，為此，要適當(dāng)在室內(nèi)地面噴水加濕，前期濕 度保持在65%左右，過(guò)濕易生雜菌，不易形成子座。
[0100] 4、氧氣：北蟲草菌絲階段呼吸量較小，室內(nèi)無(wú)需通風(fēng)，無(wú)需特殊條件管理，在 15-25天菌絲即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，北蟲草的生長(zhǎng)也即將由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，此階段 放瓶的位置不能亂動(dòng)，因?yàn)橐粍?dòng)溫度變化影響生長(zhǎng)。
[0101] 5、長(zhǎng)勢(shì)：菌絲長(zhǎng)滿瓶后，并出現(xiàn)鼓包突起，開(kāi)始見(jiàn)光轉(zhuǎn)色出草轉(zhuǎn)色期，每天早上 6-8點(diǎn)鐘通風(fēng)見(jiàn)光，待菌絲全部由白色轉(zhuǎn)為黃色后，每天可以適當(dāng)增加散射光，轉(zhuǎn)色初期，溫 度以21 °C左右為好，轉(zhuǎn)色完成后，溫度保持在23°C左右，濕度保持在85 %以上，轉(zhuǎn)色期每天 光照不得少于10小時(shí)。見(jiàn)黃即止，光不能連續(xù)照，轉(zhuǎn)色期需2-8天，轉(zhuǎn)色后即開(kāi)始在料面上 形成小米狀原基（即菌蕾）。
[0102] (六）、后期管理 1、當(dāng)大部分料面形成原基時(shí)，溫度可保持在23°C左右，濕度為85-90%，濕度太大易誘 發(fā)培養(yǎng)基產(chǎn)生過(guò)多氣生菌絲對(duì)子實(shí)體生長(zhǎng)不利，濕度太小容易使培養(yǎng)基過(guò)早失去水份而影 響產(chǎn)量，為保持適宜濕度，可噴霧水于地面，每天3-4天。
[0103] 2、子實(shí)體生長(zhǎng)階段管理 ⑴溫度：形成蟲草子實(shí)體的最佳溫度為20°c -25°c，因此，本階段盡能控溫，以利于子 實(shí)體形成與生長(zhǎng)，控溫在25°C以下，超過(guò)28°C不能長(zhǎng)處子座。
[0104] (2)光線：當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿后即可增加自然光照，菌絲見(jiàn)光后由白色逐漸變?yōu)榻埸S色 或桔黃色，菌絲分泌色素后培養(yǎng)基表面即會(huì)出現(xiàn)米粒狀桔黃色菌蕾，菌蕾伸長(zhǎng)后即為子實(shí) 體，轉(zhuǎn)身后不能連續(xù)光照，連續(xù)光照不能生成子實(shí)體。
[0105] (3)空氣濕度：子實(shí)體生長(zhǎng)階段要把室內(nèi)空氣濕度加大到85% -90%，以減少瓶?jī)?nèi) 水分散發(fā)，蟲草子實(shí)體形成要靠水份吸收營(yíng)養(yǎng)，使細(xì)胞膨大，從原基形成之后直到成熟蟲草 的細(xì)胞總數(shù)并沒(méi)有增加，其整個(gè)子實(shí)體的增大是每個(gè)細(xì)胞吸收水份及營(yíng)養(yǎng)而增大的結(jié)果， 為此，必須在營(yíng)養(yǎng)料中加足水份，才能使蟲草高產(chǎn)。
[0106] (4)氧氣：蟲草即使在密封的瓶中仍能正常生長(zhǎng)。也就是說(shuō)，它對(duì)氧氣的需求量較 小，為此，在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，盡量減少瓶?jī)?nèi)水份散發(fā)，無(wú)需去掉封口薄膜，當(dāng)瓶中子實(shí)體長(zhǎng)
【權(quán)利要求】
1. 北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是包括下列步驟：（1)母種制備；(2)母種轉(zhuǎn)原種 和栽培種；（3)懸浮液菌種或/液體菌種的制備；和（4)北冬蟲夏草菌種的人工栽培。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是所述的母種制備包括： (1)制作培養(yǎng)基；（2)試管母種制備；(3)試管母種的擴(kuò)大培養(yǎng)；(4)出草試驗(yàn)；和（5)組織 分離制作母種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，其中所述⑴母種制備制備 包括：將斜面菌種活化后分割成豌豆大小，每2?3塊接種到一瓶液體培養(yǎng)基中，于25°C、 100 r/min振蕩培養(yǎng)7天得等級(jí)為1的種，將培養(yǎng)好的等級(jí)為1的種以8% ( V/V)接種量接 種到相同的液體培養(yǎng)基中，在所述等級(jí)為1的種相同條件下培養(yǎng)20天，分別將各菌株胞外 液經(jīng)0. 40 μ m膜過(guò)濾后進(jìn)行蟲草素含量測(cè)定，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，篩選得到所需母種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，其中所述⑵試管母 種制備包括采用冬蟲夏草的組織直接切取蟲草菌核內(nèi)部的一小塊菌索，0.2%升汞溶液和 0. 1% ΚΝ03溶液分別表面消毒3min，無(wú)菌水沖洗3?5次，無(wú)菌條件下切去外層、避開(kāi)腸道， 切取內(nèi)部黑色菌索〇. 4 cm左右，將菌索分別接種到8個(gè)基本培養(yǎng)基中，在三角瓶中進(jìn)行1? 8倍的擴(kuò)大培養(yǎng)，然后于生化培養(yǎng)箱中20°C靜置培養(yǎng)120 h ;以及其中，在培養(yǎng)基中加入占培 養(yǎng)基總重量的0. 001%重量的吲哚基丙酸，并維持培養(yǎng)基的pH為約6. 7。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是： 所述的母種轉(zhuǎn)原種和栽培種包括：（1)培養(yǎng)基的配制；和（2)母種轉(zhuǎn)管擴(kuò)大； 所述的懸浮液菌種制備包括：（1)培養(yǎng)基配制、（2)滅菌、和（3)接種培養(yǎng)； 所述的液體菌種制作包括：（1)液體菌種培養(yǎng)基配方、和（2)接種培養(yǎng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是所述的北冬 蟲夏草菌種人工栽培包括：（1)按培養(yǎng)基配方制作培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方選自以下5種中的任 一種或多種：①炒大米93%，葡萄糖2 %，蛋白胨2%，檸檬酸0. 29%，硫酸鎂0. 2%，蠶蛹粉 2. 5%，維生素 B10. 01 %;②高粱米85%，蠶蛹粉10%，蔗糖1.99%，蛋白胨2%，磷酸二氫鉀 0. 1 %，硫酸鎂0. 1 %，酵母粉0. 8 %，另加維生素 B10. 01 % ;③小米95 %，葡萄糖3. 49 %，酵 母膏1.2%，磷酸二氫鉀0. 1%，硫酸鎂0.2%，另加維生素 B10. 01% ;④高粱米45%，玉米 渣40%，小米10%，蔗糖2%，蛋白胨2%，酵母粉0.8%，磷酸二氫鉀0. 1%，硫酸鎂0. 1% ; ⑤大米50 %，麥麩25 %，玉米粉9. 99 %，葡萄糖（或蔗糖）2 %、木屑10 %，蠶蛹粉2 %，尿素 0. 1 %，硫酸鎂0.9%，另加維生素 B10. 01 %; (2)拌料裝瓶；（3)滅菌；（4)接種；（5)培養(yǎng)室 培養(yǎng)；(6)后期管理；（7)采收。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是在所述的母 種制備中，制作培養(yǎng)基配方為兩種之一 ：（1)葡萄糖20克、瓊脂20克、去皮土豆200克（煮 汁）、水1000毫克（PDA培養(yǎng)基）；（2)燕麥片30克、瓊脂20克、水1000毫升；試管母種擴(kuò) 大培養(yǎng)基配方為下列三種之一 ：（1)蛋白胨10克，葡萄糖10克，含脂蠶蛹10克，全脂奶粉 10克，磷酸二氫鉀15克，瓊脂20克，水1000毫升；（2)葡萄糖10克，蛋白胨10克，酵母膏1 克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0.5克，瓊脂20克，生長(zhǎng)素5毫升，水1000毫升；(3)去皮土豆 200克（煮汁），葡萄糖20克（或蔗糖40克），磷酸二氫鉀1.5克，瓊脂20克，維生素 B110 克，增長(zhǎng)靈〇. 5克，水1000毫升。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6-7中任一項(xiàng)所述的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是母種轉(zhuǎn)原種 和栽培種的培養(yǎng)基為下列之一 ：（1)蔗糖10克，蛋白胨10克，瓊脂15克，硫酸鎂0. 5克，維 生素 B15片1000毫升；（2)葡萄糖20克，瓊脂20克，土豆200克（煮汁），維生素 B13片， 蛋白胨5克，磷酸二氫鉀（試劑）0.5克。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是懸浮液菌種 的培養(yǎng)基為下列之一 ：（1)磷酸二氫鉀3克，食鹽3克，維生素 B15片，葡糖糖15克，硫酸鎂 〇. 5克，味精0. 2克，黃豆粉15克，水1000毫升；（2)玉米粉12克，酵母粉3克，磷酸二氫鉀 1克，葡萄糖22克，黃豆粉10克，維生素 B1180-200毫，硫酸鎂0. 5克，水1000毫升；(3)葡 糖糖35克，蛋白胨25克，磷酸二氫鉀1克，食鹽2. 5克，維生素 B13片。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是液體菌種 制備的培養(yǎng)基為下列之一 ：（1)蛋白胨12克、酵母粉25克、玉米粉10克、黃豆粉10克、磷 酸二氫鉀0. 5克、硫酸鎂0. 3克、味精0. 1克、葡萄糖20克、食鹽0. 3克、維生素 B1100毫 克、水1000毫升；（2)葡萄糖10克、磷酸二氫鉀0. 5克、硫酸鎂1克、氯化鈣1克、氨基酸復(fù) 合粉5克、去皮土豆250克（煮汁）、蟬蛹20克、水1000毫升；（3)磷酸二氫鉀0. 05克、維 生素 B11150毫克、蛋白胨15克、葡萄糖25克、酵母粉10克、硫酸鎂0. 05克、食鹽8克、水 1000暈升。
【文檔編號(hào)】A01G1/04GK104054513SQ201410339251
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月17日
【發(fā)明者】宋顯和, 田野 申請(qǐng)人:宋顯和, 田野