一種利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法。該方法包括：(1)優(yōu)選出抗逆性好、生長快、莖稈粗、莖高長、分蘗多、纖維含量低、藥效成分含量高的不同產(chǎn)地的霍山石斛品種作為多倍體培育原植株親本；(2)對不同品種原植株種子在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌播種，獲得2倍體原球莖；(3)制備不同品種2倍體原球莖的原生質(zhì)體，進(jìn)行細(xì)胞融合；(4)對檢測出的四倍體植株進(jìn)行無性組培，獲得四倍體植株幼苗；(5)對四倍體植株幼苗進(jìn)行常規(guī)煉苗馴化和栽培至開花；(6)把四倍體植株與二倍體植株人工授粉雜交，結(jié)實，即得三倍體霍山石斛種子。(7)對三倍體種子無菌播種、培養(yǎng)，獲得大量三倍體幼苗。
【專利說明】一種利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蘭科石斛屬藥用植物生物育種方法，特別涉及一種利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]霍山石斛(學(xué)名11110811811611860.2.61: 8.了.011611?)在國際上有“藥界大熊貓”之稱的野生霍山石斛，史稱霍石斛，俗稱米斛，距今已有200多年的歷史。原產(chǎn)于我國安徽大別山等地，是國家現(xiàn)代中藥重大專項200多個瀕危稀缺品種中首位保護(hù)品種。是藥用石斛中的極品，也是霍山縣獨有的、擁有原產(chǎn)地地理標(biāo)志的名貴中藥材，歷史上被譽(yù)為“中華九大仙草之首”、“健康軟黃金”?！渡褶r(nóng)本草》、《本草綱目》均有記載?；羯绞械亩嗵?、生物堿類物質(zhì)有清咽利嗓，保肝明目、降糖降脂、延年益壽之功效。本品能大幅度提高人體內(nèi)300(延緩衰老的主要物質(zhì))，在增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、延緩衰老和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡等方面有明顯作用，從而達(dá)到保健保健的功效。
[0003]多倍體育種是植物新品種培育的重要手段，多倍體育種起源于20世紀(jì)初，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于植物新品種的培育中。多倍體由于基因組倍性的增加，往往表現(xiàn)出形態(tài)上的巨大性和抗性增強(qiáng)等特點。其中三倍體還具有不育特點，即可作為永久雜種，也有利于商業(yè)保護(hù)。
[0004]通過基因組三倍化，可以獲得具有多倍體和雜交種雙重優(yōu)勢的三倍體，其優(yōu)勢表現(xiàn)出具有巨大性和不可替代性，可以提高霍山石斛藥材產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性。三倍體霍山石斛則具有產(chǎn)量和質(zhì)量上的雙重優(yōu)勢。
[0005]國家“十一五”和“十二五”計劃均提出“種質(zhì)資源的挖掘、保存、創(chuàng)新和新品種的定向培育”的任務(wù)。為貫徹、落實這項任務(wù)，我們倡導(dǎo)應(yīng)用“基因組多倍化與融合雜交相結(jié)合”的方法，實現(xiàn)種質(zhì)資源的創(chuàng)新和新品種的定向培育的目的。目前僅有三倍體鐵皮石斛和春石斛蘭的培育方法已公開并授權(quán)，迄今為止，三倍體霍山石斛(染色體核型指數(shù)為211=31=57)及培育方法還未見有公開報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法，該方法培育出的三倍體霍山石斛與二倍體霍山石斛相比，其主要形態(tài)性狀基本相同，但其莖、葉、花表現(xiàn)出明顯的增大，產(chǎn)量與多糖含量顯著提高，抗逆性增強(qiáng)。本發(fā)明產(chǎn)生的三倍體霍山石斛具有多倍體和雜交種的雙重優(yōu)勢。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法，包括以下步驟:
(1)優(yōu)選出抗逆性好、生長快、莖桿粗、莖高長、分蘗多、纖維含量低、藥效成分含量高的不同產(chǎn)地的霍山石斛品種作為多倍體培育的源植株親本；
(2)對不同品種原植株種子在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌播種，獲得2倍體原球莖；
(3)制備不同品種2倍體原球莖的原生質(zhì)體，進(jìn)行細(xì)胞原生質(zhì)體融合，并培養(yǎng)成愈傷組織；
(4)對檢測出的四倍體愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)分化，獲得四倍體植株幼苗；
(5)對四倍體植株幼苗進(jìn)行常規(guī)煉苗馴化和栽培至開花；
(6)把四倍體植株與二倍體植株人工授粉雜交，結(jié)實，即得三倍體霍山石斛種子；
(7)對三倍體種子無菌播種、培養(yǎng)，獲得大量三倍體幼苗。
[0008]步驟(1)中所述霍山石斛為分布在大別山山系的不同產(chǎn)地具有優(yōu)良性狀的品種，其中高緯度、高海拔地區(qū)的品種具有抗逆性強(qiáng)、莖桿粗、藥效成分含量高的特點，低緯度、低海拔地區(qū)的品種具有生長速度快、莖高長、分蘗多、纖維含量低的特點。
[0009]步驟(2)中所述培養(yǎng)為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，適合脫分化形成愈傷組織的培養(yǎng)基均可。優(yōu)選大量元素減半的1/213培養(yǎng)基，調(diào)整蔗糖濃度為5%-8%，優(yōu)選添加10-15%的椰乳，2,4-0 0.2-2.0 ^/1,嫩八0.2-2.0呢/1 ；培養(yǎng)溫度在25-181的晝夜溫差范圍內(nèi)，光照時間10-12小時，光照強(qiáng)度2000-30001^^,色溫在4500-55001
[0010]步驟(3)中所述原生質(zhì)體的制備方法優(yōu)選酶解法制備，細(xì)胞融合辦法優(yōu)選電擊融合法。
[0011]步驟(4)中所述四倍體為異源雙二倍體或同源雙二倍體；其中異源雙二倍體具有雜交優(yōu)勢，因為這是由不同品種的個體細(xì)胞間的融合而成，這不同于利用秋水仙素及其功能類似物通過抑制細(xì)胞有絲分裂的方法制備的四倍體，這種辦法制備的四倍體僅僅是同源雙二倍體；所述檢測染色體倍數(shù)為常規(guī)染色鏡檢辦法，選取染色體數(shù)目211=41=76的幼苗，是培育成功的四倍體。
[0012]步驟￠)中所述四倍體植株與二倍體植株人工授粉雜交，四倍體植株與二倍體植株可以互為父本和母本。
[0013]本發(fā)明包括上述任何一項培育方法得到的三倍體霍山石斛。
[0014]本發(fā)明有益效果:
本方法采用細(xì)胞融合的辦法將具有不同優(yōu)良性狀的霍山石斛品種的不同個體融合構(gòu)建出四倍體(異源雙二倍體或同源雙二倍體)植株，再把四倍體植株與二倍體植株雜交獲得三倍體霍山石斛植株。育種過程既是染色體基因組增倍過程，也是融合雜交的過程。選育出的三倍體霍山石斛與二倍體霍山石斛石斛相比，其主要形態(tài)性狀基本相同，但其莖、葉、花表現(xiàn)出明顯的增大，產(chǎn)量與多糖含量顯著提高，抗逆性增強(qiáng)。本發(fā)明產(chǎn)生的三倍體霍山石斛具有多倍體和雜交種的雙重優(yōu)勢。

【具體實施方式】
[0015]下面以實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員對本
【發(fā)明內(nèi)容】
的技術(shù)特征所作的等同替換，或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0016]為方便描述，以下實施例中用“品種八”表示高緯度、高海拔地區(qū)的染色體核型指數(shù)為2==38的霍山石斛品種，該品種具有抗逆性強(qiáng)、莖桿粗、藥效成分含量高的特點；用“品種8”表示低緯度、低海拔地區(qū)的染色體核型指數(shù)為2==38的霍山石斛品種，該品種具有生長速度快、莖桿長、分蘗多、纖維含量低的特點。
[0017]實施例1
(1)將品種八和品種8的植株按常規(guī)方法種植栽培；
(2)對不同品種原植株種子在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌播種，獲得品種八和品種8植株的2倍體原球莖，固體培養(yǎng)基為大量元素減半的1/213培養(yǎng)基，添加0.2^/1 2，4-0和0.2^/1嫩八，調(diào)整蔗糖濃度為5%，添加10%的椰乳，培養(yǎng)溫度在25-18 V的晝夜溫差范圍內(nèi)，光照時間10-12匕，光照強(qiáng)度2000-3000 [狀，色溫在4500-5500 X；
(3)制備品種八和品種8植株2倍體的原生質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞融合，原生質(zhì)體的制備方法為酶解法制備，細(xì)胞融合辦法采用電擊法；
(4)對融合細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至愈傷組織，取愈傷組織細(xì)胞染色壓片，鏡檢驗證染色體倍數(shù)，對檢測出的四倍體(異源雙二倍體或同源雙二倍體)融合細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，獲得四倍體植株幼苗。培養(yǎng)溫度在25-181的溫差范圍內(nèi)，光照時間10-12小時，光照強(qiáng)度2000-30001狀，色溫在 4500-5500匕；
(5)對四倍體植株幼苗進(jìn)行常規(guī)煉苗馴化和栽培管理至開花；
(6)以四倍體植株為母本與二倍體植株為父本人工授粉雜交，結(jié)實，即得三倍體霍山石斛種子；
(7)對三倍體種子無菌播種、培養(yǎng)，獲得大量三倍體幼苗；
(8)三倍體霍山石斛幼苗進(jìn)行常規(guī)煉苗馴化和栽培按管理至成株。成株具有抗逆性強(qiáng)、莖桿粗、莖高長、分蘗多、生長速度快、纖維含量低、藥效成分含量高的特點，其中總多糖含量達(dá)23%。
[0018]實施例2
(1)將品種八和品種8的植株按常規(guī)方法種植栽培；
(2)對不同品種原植株種子在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌播種，獲得品種八和品種8植株的2倍體原球莖，固體培養(yǎng)基為大量元素減半的1/213培養(yǎng)基，添加0.2^/1 2，4-0和0.2^/1嫩八，調(diào)整蔗糖濃度為6%，添加15%的土豆汁，培養(yǎng)溫度在25-18 V的晝夜溫差范圍內(nèi)，光照時間10-12卜，光照強(qiáng)度2000-3000 [狀，色溫在4500-5500 X；
(3)制備品種八和品種8植株2倍體的原生質(zhì)體，進(jìn)行細(xì)胞融合，原生質(zhì)體的制備方法為酶解法制備，細(xì)胞融合辦法采用電擊法；
(4)對融合細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至愈傷組織，取愈傷組織細(xì)胞染色壓片，鏡檢驗證染色體倍數(shù)，對檢測出的四倍體(異源雙二倍體或同源雙二倍體)融合細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，獲得四倍體植株幼苗。培養(yǎng)溫度在25-181的溫差范圍內(nèi)，光照時間10-12小時，光照強(qiáng)度2000-30001狀，色溫在 4500-5500匕；
(5)對四倍體植株幼苗進(jìn)行常規(guī)煉苗馴化和栽培管理至開花；
(6)以四倍體植株為父本與二倍體植株為母本人工授粉雜交，結(jié)實，即得三倍體霍山石斛種子；
(7)對三倍體種子無菌播種、培養(yǎng)，獲得大量三倍體幼苗；
(8)三倍體霍山石斛幼苗進(jìn)行常規(guī)煉苗馴化和栽培按管理至成株。成株具有抗逆性強(qiáng)、莖桿粗、莖高長、分蘗多、生長速度快、纖維含量低、藥效成分含量高的特點，其中總多糖含量達(dá)22%。
【權(quán)利要求】
1.一種利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)優(yōu)選出抗逆性好、生長快、莖桿粗、莖高長、分蘗多、纖維含量低、藥效成分含量高的不同產(chǎn)地的霍山石斛品種作為多倍體培育的源植株親本； (2)對不同品種源植株種子在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌播種，獲得2倍體原球莖； (3)制備不同品種2倍體原球莖的原生質(zhì)體，進(jìn)行細(xì)胞原生質(zhì)體融合，并培養(yǎng)成愈傷組織； (4)對檢測出的四倍體愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)分化，獲得四倍體植株幼苗； (5)對四倍體植株幼苗進(jìn)行常規(guī)煉苗馴化和栽培至開花； (6)把四倍體植株與二倍體植株人工授粉雜交，結(jié)實，即得三倍體霍山石斛種子；(7)對三倍體種子無菌播種、培養(yǎng)，獲得大量三倍體幼苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于:步驟(I)中所述霍山石斛為分布在大別山山系的不同產(chǎn)地具有優(yōu)良性狀的品種，其中高緯度、高海拔地區(qū)的品種具有抗逆性強(qiáng)、莖桿粗、藥效成分含量高的特點，低緯度、低海拔地區(qū)的品種具有生長速度快、莖高長、分蘗多、纖維含量低的特點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于:步驟(2)中所述培養(yǎng)為在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，適合誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基均可，優(yōu)選大量元素減半的1/2MS培養(yǎng)基，調(diào)整蔗糖濃度為5%-8%，優(yōu)選添加10-15%的椰乳，2，4-D 0.2-2.0 mg/L, NAA 0.2-2.0 mg/L ;培養(yǎng)溫度在25_18°C的晝夜溫差范圍內(nèi)，光照時間10-12小時，光照強(qiáng)度2000-3000Lux，色溫在4500_5500k。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于:步驟(3)中所述原生質(zhì)體的制備方法優(yōu)選酶解法制備，原生質(zhì)體融合辦法優(yōu)選電擊融合法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于:步驟(4)中所述四倍體為異源雙二倍體或同源雙二倍體；所述檢測染色體倍數(shù)為常規(guī)染色鏡檢辦法，選取染色體數(shù)目2n=4x=76的幼苗，是培育成功的四倍體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用四倍體植株與二倍體植株雜交育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于:步驟￠)中所述四倍體植株與二倍體植株在花期人工授粉雜交，四倍體植株與二倍體植株可以互為父本和母本。
7.權(quán)利要求1-6中任何一項所述培育方法得到的三倍體霍山石斛。
【文檔編號】A01H1/02GK104396722SQ201410343441
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】鄧輝, 陳存武, 陳乃富, 張莉, 戴軍 申請人:皖西學(xué)院