一種生物復(fù)合型木霉抑制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于防治食用菌木霉污染的微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種生物復(fù)合型木霉抑制劑及其制備方法。本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有防治木霉的藥劑存在防治效果低、殘留量大和成本高的問題。本發(fā)明技術(shù)方案為：一種生物復(fù)合型木霉抑制劑，它是由枯草芽孢桿菌ACCC11088和涇陽鏈霉菌ACCC40041分別進(jìn)行單菌種發(fā)酵培養(yǎng)制成發(fā)酵液，然后將兩種發(fā)酵液按照重量比為1～5：5～1的比例混合均勻制成生物復(fù)合型木霉抑制劑；或者將兩種發(fā)酵液的菌體過濾后剩余的濾液按照重量比為1～5：5～1的比例混合均勻制成生物復(fù)合型木霉抑制劑。本發(fā)明具有治愈率高、環(huán)保無害的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于防治食用菌木霉污染的微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種生物復(fù)合型木 霉抑制劑及其制備方法。 一種生物復(fù)合型木霉抑制劑及其制備方法

【背景技術(shù)】
[0002] 木霉引起的綠霉病是食用菌生產(chǎn)過程中最大的威脅，生產(chǎn)上通常采用化學(xué)藥劑防 治，一旦在出菇期采用不得當(dāng)?shù)霓r(nóng)藥防治，就會(huì)造成農(nóng)藥的殘留。且長(zhǎng)時(shí)間使用單一化學(xué)藥 劑會(huì)使病害抗性增強(qiáng)，防治效果降低，且殘留量大，對(duì)人體健康構(gòu)成威脅，并且污染環(huán)境。近 年來國(guó)內(nèi)外開發(fā)代替化學(xué)農(nóng)藥的植物提取物如木醋液、植物熏蒸物、小桐子提取物一類提 取物質(zhì)控制木霉危害，雖然抑菌效果較好，但以上成品制造成本高、產(chǎn)率較低。因此利用微 生物防治木霉具有較好的應(yīng)用前景。目前已有用來防治木霉的微生物菌株以及抗生素，如 枯草芽孢桿菌、納他霉素等。雖然微生物對(duì)木霉的抑制效果較好，但是將能夠抑制木霉的微 生物菌株復(fù)配從而達(dá)到更好的抑制效果，并沒有報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有防治木霉的藥劑存在的防治效果低、殘留量大和制造成 本高的技術(shù)問題，提供一種生物復(fù)合型木霉抑制劑及其制備方法。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0005] -種生物復(fù)合型木霉抑制劑，它是由枯草芽孢桿菌ACCC11088和涇陽鏈霉菌 ACCC40041分別進(jìn)行單菌種發(fā)酵培養(yǎng)制成發(fā)酵液，然后將兩種發(fā)酵液按照重量比為1?5 : 5?1的比例混合均勻制成生物復(fù)合型木霉抑制劑；或者將兩種發(fā)酵液的菌體過濾后剩余 的濾液按照重量比為1?5 :5?1的比例混合均勻制成生物復(fù)合型木霉抑制劑；其中生物 復(fù)合型木霉抑制劑中枯草芽孢桿菌ACCC11088的菌數(shù)為0. 5億/mL?40億/mL，涇陽鏈霉 菌ACCC40041的菌數(shù)為0. 5億/mL?20億/mL。
[0006] 本發(fā)明生物復(fù)合型木霉抑制劑的制備方法包括如下步驟：
[0007] (1)單菌種發(fā)酵液的制備：
[0008] 枯草芽孢桿菌ACCC11088發(fā)酵液的制備：將枯草芽孢桿菌ACCC11088在無菌條件 下接種到液體培養(yǎng)基中，在30°C、180r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)，鏡檢80%形成芽孢制成，其中 所述的液體培養(yǎng)基為：各組分在1. 0L蒸餾水中的含量為：蛋白胨9?llg，牛肉膏3?5g， 氯化鈉4. 5?5. 5g，PH調(diào)至7. 2?7. 4之間；
[0009] 涇陽鏈霉菌ACCC40041發(fā)酵液的制備：涇陽鏈霉菌ACCC40041在無菌條件下接種 到高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基中，在28°c、180r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵進(jìn)行5?7天制成，其 中所述高氏I號(hào)培養(yǎng)基為：各組分在1. 0L蒸餾水中的含量為：可溶性淀粉：18?23g，硝酸 鉀lg，磷酸氫二鉀〇. 4?0. 6g，七水硫酸鎂0. 4?0. 6g，氯化鈉0. 4?0. 6g，七水硫酸亞鐵 0.018，？!1調(diào)至7.4?7.6之間；
[0010] (2)復(fù)合木霉抑制劑的制備：
[0011] 將步驟⑴制備得到的枯草芽孢桿菌ACCC11088發(fā)酵液和涇陽鏈霉菌ACCC40041 發(fā)酵液按照重量比為1?5 :5?1的比例混合制成；
[0012] 或者是將枯草芽孢桿菌ACCC11088發(fā)酵液和涇陽鏈霉菌ACCC40041發(fā)酵液分別過 濾，取各自的濾液按照重量比為1?5 :5?1的比例混合制成。
[0013] 本發(fā)明復(fù)合木霉抑制劑由兩種有益微生物復(fù)合而成，分別是中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心保存的枯草芽孢桿菌ACCC11088和涇陽鏈霉菌ACCC40041。它 們能夠在食用菌菌絲生長(zhǎng)初期有效的抑制食用菌木霉的生長(zhǎng)，同時(shí)不會(huì)抑制食用菌菌絲的 生長(zhǎng)，且對(duì)人畜無毒無害。
[0014] 為進(jìn)一步表明本發(fā)明生物復(fù)合型木霉抑制劑的效果，本發(fā)明做了如下實(shí)驗(yàn)：
[0015] 一、從發(fā)病的平菇、香菇和金針菇的栽培料中分離木霉真菌，為木霉拮抗實(shí)驗(yàn)提供 病原菌，具體步驟如下：
[0016] 1、從發(fā)病的平菇、香菇和金針菇栽培料或子實(shí)體上挑取木霉孢子于PDA平板上， 置于26°C培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)好的平板，選擇生長(zhǎng)數(shù)量多的、綠色菌落進(jìn)行純化，挑取菌絲劃線 于PDA平板上，26°C培養(yǎng)，待得到純的菌落后，接種于PDA斜面試管，保存于4°C冰箱中；純 化的木霉菌在PDA培養(yǎng)基上于26°C黑暗培養(yǎng)，每天觀察菌落的形態(tài)特征和顏色，測(cè)量菌落 直徑并挑取菌絲及孢子制片，于顯微鏡下觀察分生孢子梗分枝方式、產(chǎn)孢細(xì)胞和孢子的形 態(tài)；
[0017] 2、經(jīng)分尚純化，從香燕上分尚出一株木霉菌編號(hào)為XG，從平燕上分尚出兩株木霉 菌編號(hào)為M3, M5,從金針菇上分離出一株木霉菌編號(hào)為JZG，各菌株的特征為如下：
[0018] XG:在PDA平板上，菌落初呈白色絨狀，后期出現(xiàn)輪狀的菌絲密實(shí)產(chǎn)孢區(qū)，顏色為 綠色至深綠色，分生孢子梗呈環(huán)狀排列，次級(jí)分枝單個(gè)或以2-3個(gè)為一組，大角度伸出，分 枝彎曲或波狀，瓶梗基部縊縮，中部較寬，從中部以上變窄形成長(zhǎng)頸，分生孢子呈球形，表面 有刺。
[0019] M3 :菌絲生長(zhǎng)快，背面無色至淡黃色，菌落初呈白色，后變成綠色，后期在菌落中 間有一圈明顯的產(chǎn)孢區(qū)，分生孢子梗分枝多，分枝角度大，瓶梗細(xì)長(zhǎng)，對(duì)生、輪生于孢子梗 上，末端瓶梗較長(zhǎng)，分生孢子呈橢圓形或卵圓形。
[0020] M5 :菌落初呈白色，后變成綠色，后期在菌落中間有一圈明顯的產(chǎn)孢區(qū)，分生孢子 梗分枝多，分枝角度大，瓶梗細(xì)長(zhǎng)，對(duì)生、輪生于孢子梗上，分生孢子呈短柱狀。
[0021] JZG :菌絲生長(zhǎng)很快，背面無色或暗黃色。菌落初呈白色絨狀，后變?yōu)榫G色至深綠 色，后期出現(xiàn)輪狀的菌絲密實(shí)產(chǎn)孢區(qū)，分生孢子梗分枝少，次級(jí)分枝單個(gè)或2-3個(gè)為一組， 大角度伸出，分枝略呈彎曲狀。
[0022] 二、食用菌感染木霉治療實(shí)驗(yàn)
[0023] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0024] 1、栽培袋的制備
[0025] 將平菇栽培原料棉籽皮和玉米芯經(jīng)過簡(jiǎn)單的發(fā)酵處理后（約5天左右），裝袋，并 接種平菇菌種，待平菇菌絲體生長(zhǎng)至3?5cm左右時(shí)備用。
[0026] 2、各種拮抗菌株的制備
[0027] 分別配制普通、高氏液體培養(yǎng)基，在28°C下?lián)u瓶培養(yǎng)，菌液培養(yǎng)完成后備用。
[0028] 3、病原菌返接
[0029] 將M5、M3、XG和JZG病原菌活化后，用移液槍吸取0. 1ml定量的注入到菌袋中，培 養(yǎng)2?3天后備用。
[0030] 4、病原菌治療
[0031] 待病原菌生長(zhǎng)到3?8cm時(shí)，用注射器吸取枯草芽孢桿菌ACCC11088+涇陽鏈霉菌 ACCC40041原液、10倍稀釋液和過濾液的菌液注入病原菌部位，保證拮抗菌液接觸到病原 菌，測(cè)定各處理的治愈率。
[0032] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：原液處理組對(duì)四個(gè)木霉病原菌治愈率達(dá)到88%、93%、90%、91 %;十倍 稀釋液處理組對(duì)四個(gè)木霉病原菌治愈率達(dá)到75%、81%、84%、84% ;菌體過濾液處理組對(duì) 四個(gè)木霉病原菌治愈率達(dá)到85%、91%、90%、91% ;空白對(duì)照的治愈率為5%、5%、10%、 9%。具體數(shù)據(jù)見表1。
[0033] 上述實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明對(duì)平菇、香菇、金針菇的木霉抑制率達(dá)到85%?91 %。
[0034] 表1復(fù)配組合對(duì)XG、JZG、M3和M5病原菌的治療效果
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種生物復(fù)合型木霉抑制劑，其特征在于：它是由枯草芽孢桿菌ACCC11088和涇陽 鏈霉菌ACCC40041分別進(jìn)行單菌種發(fā)酵培養(yǎng)制成發(fā)酵液，然后將兩種發(fā)酵液按照重量比為 1?5 :5?1的比例混合均勻制成生物復(fù)合型木霉抑制劑；或者將兩種發(fā)酵液的菌體過濾 后剩余的濾液按照重量比為1?5 :5?1的比例混合均勻制成生物復(fù)合型木霉抑制劑；其 中生物復(fù)合型木霉抑制劑中枯草芽孢桿菌ACCC11088的菌數(shù)為0. 5億/mL?40億/mL，涇 陽鏈霉菌ACCC40041的菌數(shù)為0. 5億/mL?20億/mL。
2. 權(quán)利要求1所述的生物復(fù)合型木霉抑制劑的制備方法，其特征在于：包括如下步 驟： (1) 單菌種發(fā)酵液的制備： 枯草芽孢桿菌ACCC11088發(fā)酵液的制備：將枯草芽孢桿菌ACCC11088在無菌條件下接 種到液體培養(yǎng)基中，在30°C、180r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)，鏡檢80%形成芽孢制成，其中所述 的液體培養(yǎng)基為：各組分在1.0L蒸餾水中的含量為：蛋白胨9?llg，牛肉膏3?5g，氯化 鈉4. 5?5. 5g，PH調(diào)至L 2?L 4之間； 涇陽鏈霉菌ACCC40041發(fā)酵液的制備：涇陽鏈霉菌ACCC40041在無菌條件下接種到高 氏I號(hào)液體培養(yǎng)基中，在28°C、180r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵進(jìn)行5?7天制成，其中所 述高氏I號(hào)培養(yǎng)基為：各組分在1. 0L蒸餾水中的含量為：可溶性淀粉：18?23g，硝酸鉀 lg，磷酸氫二鉀〇. 4?0. 6g，七水硫酸鎂0. 4?0. 6g，氯化鈉0. 4?0. 6g，七水硫酸亞鐵 0· Olg，PH調(diào)至L 4?L 6之間； (2) 復(fù)合木霉抑制劑的制備： 將步驟（1)制備得到的枯草芽孢桿菌ACCC11088發(fā)酵液和涇陽鏈霉菌ACCC40041發(fā)酵 液按照重量比為1?5 :5?1的比例混合制成； 或者是將枯草芽孢桿菌ACCC11088發(fā)酵液和涇陽鏈霉菌ACCC40041發(fā)酵液分別過濾， 取各自的濾液按照重量比為1?5 :5?1的比例混合制成。
【文檔編號(hào)】A01N63/00GK104115873SQ201410350082
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】陳冬至, 楊麗麗, 楊文艷, 劉李玄牝 申請(qǐng)人:山西昌鑫生物農(nóng)業(yè)科技有限公司