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      一種中山杉品種136的離體繁殖方法

      文檔序號:261691閱讀:258來源:國知局
      一種中山杉品種136的離體繁殖方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中山杉品種136的離體繁殖方法,該方法包括以下步驟:(1)外植體選取及消毒的過程;(2)將1/2MS培養(yǎng)基進行改良;(3)將處理后的外植體切割并進行莖段初代誘導(dǎo)培養(yǎng),高壓靜電場HVEF處理;(4)將步驟(3)中所得不定芽進行繼代增殖培養(yǎng);(5)將步驟(4)中所得無根試管苗進行生根誘導(dǎo)培養(yǎng);(6)對步驟(5)中得到的無菌苗進行馴化煉苗并移栽。采用該發(fā)明的組織培養(yǎng)繁殖方法對中山杉136進行育苗,育苗時間短,且增殖率為88-93倍,生根率為89%,平均生根數(shù)為4.1條,煉苗成活率達到95%,能夠高效的得到中山杉136種苗,很大程度滿足了市場對中山杉136種苗的需求。
      【專利說明】—種中山杉品種136的離體繁殖方法

      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明涉及一種中山杉品種136 (Taxodium hybrids ‘zhongshanshal36’)的離體繁殖方法,屬于木本植物種苗繁殖的【技術(shù)領(lǐng)域】。

      【背景技術(shù)】
      [0002]中山杉(Taxodiumhybrids ‘zhongshansha,)為杉科(Taxodiaceae)落羽杉屬(Taxodium)。中山杉為半常綠高大喬木,樹體高大雄偉,樹型優(yōu)美,是落羽杉(T.distichum)、池杉(T.ascendens)、墨西哥落羽杉(T.mucronatum)三個樹種的優(yōu)良種間雜交種,由江蘇省中國科學(xué)院植物研究所多年選育而成。中山杉具有生長速度快,耐水濕,耐鹽堿,病蟲害少,抗風(fēng)性強等優(yōu)點,因此是優(yōu)良的灘涂鹽堿地的綠化樹種。
      [0003]由于中山杉的樹干紋理直,結(jié)構(gòu)細致,材質(zhì)輕柔,耐腐防蛀,因此廣泛用于建筑,橋梁,造船,家具等方面,所以杉樹在中國的建材市場占據(jù)廣闊的市場。
      [0004]20世紀80年代從落羽杉早X墨西哥落羽杉?雜交組合中選育出了第I代雜種落羽杉-中山杉302等速生、耐鹽堿無性系;90年代又從中山杉302早X墨西哥落羽杉古雜交組合中選育出了第2代中山杉136、9、146等無性系。其中中山杉302和136號先后被審(認)定為國家級林木良種。136、146號被江蘇省林業(yè)局認定為林木良種。9號被國家林業(yè)局授權(quán)新品種保護權(quán)。2004年“中山杉136”通過江蘇省林業(yè)局林木新品種審定委員會認定,目前已分別在江蘇和浙江建立中山杉良種苗木生產(chǎn)基地,得到了林業(yè)園林和公路等綠化部門的廣泛關(guān)注。
      [0005]中山杉136為中山杉二代無性系中較為突出的品種。一年四季的枝葉顏色比較豐富,呈現(xiàn)綠——紅(枝)——黃——紅(葉)的顏色變化趨勢,并且已經(jīng)作為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)術(shù)語以及常規(guī)的試驗材料在本領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。然而,有關(guān)中山杉二代品種,尤其涉及中山杉136的快速繁殖研究,國內(nèi)外報道較少。目前研究主要集中在扦插繁殖上,而扦插繁殖受母本材料來源的限制很大。母本材料具有大量插穗,是扦插快繁生產(chǎn)的前提條件,這對于雜交選育的木本植物新品種來說,顯然是不現(xiàn)實的。因此,通過組培快繁是解決中山杉新優(yōu)無性系擴繁的首選途徑。
      [0006]中山杉136是中山杉二代雜交種,如果采用種子播種繁殖,后代植株表型易產(chǎn)生分離,導(dǎo)致中山杉136的優(yōu)良性狀無法保存;扦插繁殖需要中山杉136提供大量的插條,因此繁殖材料受到極大的限制;嫁接繁殖需要大量砧木且技術(shù)要求高,人工成本高。利用組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)繁育中山杉136幼苗,僅需要少量的帶芽莖段為外植體,其優(yōu)點擴繁速度快,成本低,能夠在短時間內(nèi)提供大量優(yōu)質(zhì)的幼苗。發(fā)明專利CN 102283126 B公開了中山杉302 (中山杉136的母本)組織培養(yǎng)增殖方法,但是由于中山杉136是落羽杉屬F2代雜交種與中山杉302的基因型及植株的代謝產(chǎn)物存在不同,因此不能通過簡單地照搬用于中山杉136。
      [0007]針對以上的現(xiàn)狀,本發(fā)明提供了一種中山杉136的離體繁殖方法,其操作簡單易行,大大提高了增殖率和增殖速度,從而獲得優(yōu)質(zhì)的中山杉種苗,從而解決了中山杉136在城市園林綠化,公路綠化,生態(tài)建設(shè)等方面的需求。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0008]本發(fā)明的目的在于解決中山杉136種苗的來源,并提供一種繁殖速度快,種苗優(yōu)質(zhì)的中山杉136離體繁殖方法。
      [0009]為達到上述目的,本發(fā)明提供了一種中山杉136的離體繁殖方法,具體步驟如下所述:
      [0010](I)外植體選取與消毒:選取春季中山杉136帶有腋芽剛萌動的枝條作為外植體,用自來水沖洗枝條,以去除枝條表面的污垢,然后去除多余的葉片,并進行消毒:①用中性洗衣粉洗滌,再流水沖洗2h,濾紙吸干表面水分;②在超凈工作臺上先用70%酒精浸泡20?30s,無菌水沖洗3次,每次振蕩3?5min ;③立即轉(zhuǎn)入1%。的升汞溶腋中消毒7-10min,最后用無菌水洗漆3?5次,每次振蕩3?5min。
      [0011](2)改良1/2MS培養(yǎng)基的制備:用Ca(NO3)2.4H20260mg/L代替原1/2MS培養(yǎng)基中的CaCl2.2&0,用K2S04560mg/L代替原1/2MS培養(yǎng)基中的KNO3,同時加入活性炭,濃度為:1500mg/L,其他組分均無變化。
      [0012](3)不定芽的誘導(dǎo):取步驟(I)中消毒后的外植體,切割成0.6-0.8cm長的莖段,每個莖段至少帶一腋芽,接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基,進行不定芽的誘導(dǎo),培養(yǎng)溫度為23±3°C,首先暗培養(yǎng)24h,然后光照培養(yǎng)20-25天(光照時間為14小時/天,光照強度為1500_20001χ),濕度為50%?65%。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良的1/2MS培養(yǎng)基,添加的激素劑量為:所述改良 1/2MS+6-BA0.8mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.5mg/L。
      [0013](4)高壓靜電場HVEF處理,利用高壓靜電場儀器,進行靜電場處理,強度為15KV/cm,時間30分鐘;
      [0014](5)繼代增殖:將經(jīng)高壓靜電場處理的不定芽接入繼代增殖培養(yǎng)基,進行繼代培養(yǎng)25-30天,培養(yǎng)溫度為23±3°C,光照時間為14小時/天,光照強度為1500_20001x,濕度為50%?65%。繼代增殖培養(yǎng)基為改良的1/2MS培養(yǎng)基,添加的激素劑量為:所述改良1/2MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.2mg/L+GA30.5mg/L ;
      [0015](6)生根培養(yǎng):將步驟(5)獲得的中山杉無根試管苗進行切繁(每株均有一個不定芽),接入生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)15-20天,培養(yǎng)溫度為23±3°C,光照時間為14小時/天,光照強度為1500-20001x ;所述的生根培養(yǎng)基為改良1/2MS培養(yǎng)基并添加激素NAA和 IBA:改良 1/2MS+NAA0.8mg/L+IBA0.3mg/L。
      [0016](7)無菌苗的煉苗:將步驟(6)產(chǎn)生的中山杉136帶根無菌苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開,室內(nèi)培養(yǎng)5-7天,然后移入采用多菌靈消毒的基質(zhì)中,組培苗上方使用帶孔PVC膜覆蓋保濕,煉苗容器采用50孔的穴盤,放在通風(fēng)陰涼處培養(yǎng)25-30天,培養(yǎng)到第15天將PVC膜移除,換用遮光率75%-80%的遮陽網(wǎng);所述的基質(zhì)成分為體積比2: I: I的泥炭土、蛭石、
      珍珠巖。
      [0017]根長l-2cm、苗高3_4cm的組培苗經(jīng)室內(nèi)煉苗7天后移栽,成活率達95%。
      [0018]上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基,繼代增殖培養(yǎng)基,生根培養(yǎng)基中菌含有瓊脂7.0-8.0g/L,蔗糖30g/L, PH 值為:5.8-6.0。
      [0019]本發(fā)明中山杉136離體繁殖方法具有以下優(yōu)點:
      [0020]1.選取外植體時間
      [0021]木本植物外植體本身的生理狀況、休眠深度與植株再生能力是密切相關(guān)的。根據(jù)我們的試驗,選取春季中山杉136帶有剛萌動的腋芽枝條作為外植體利于腋芽的萌動,比其他時間容易得到成活率較高的外植體。
      [0022]2、MS 改良
      [0023]在原MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)時,外植體不定芽不易分化出枝梢,外植體上只爆芽而不伸長,將MS培養(yǎng)基改良后,改變了 NPK比例,用Ca (NO3) 2.4H20260mg/L代替原1/2MS培養(yǎng)基中的CaCl2.2H20,ffi K2S04560mg/L代替原1/2MS培養(yǎng)基中的KNO3.另外添加活性炭1500mg/L,能夠顯著促進不定芽的分化及生長(見表I),其中改良WPM為按照CN201110200456,中山杉品種302培養(yǎng)的方法進行改良(用Ca(NO3)2.4H20684mg/L和KN03380mg/L代替原WPM培養(yǎng)基中的 K2SO4 和 CaCl2.2H20)
      [0024]表I基本培養(yǎng)基的篩選
      [0025]
      J1E 本 jΜ25 天誘 VMrt 況__囊導(dǎo)寧(%》 》;' fili ?|| IQtcm)........._
      IMMS 不定芽分化出2-3羽*復(fù)葉.尤嫩技.Sft523-4
      1/2MS 臉—芽處分化IHI個不定芽,不伸K-1lS:狀.竭化6丨6-7
      MS不定芽分化IHl條羽狀復(fù)葉L無嫩枝,竭化SO 一5-b
      [0026]
      Λ良WPM 不定芽分化出丨-2?羽鈦1;冷.X索枝.584-5
      <tft|/2MS 生K ft好.分化出2-3.--的9?.^本不鶴化927-8
      [0027]3不定芽誘導(dǎo)生長周期中因受損傷、營養(yǎng)狀況、環(huán)境因子的限制和影響呈S型生長曲線,但是靜電場的處理影響了膜的通透性及其它極性分子的運動,改善了細胞的吸收和轉(zhuǎn)運物質(zhì)能力,從而能夠促進組織的生長,使得繼代延遲期縮短,很快進入對數(shù)生長期。利用靜電場處理,不同的強度和時間組合會產(chǎn)生不同的效果,如果處理電場強度過大,或處理時間過長,會使得植物細胞受到傷害甚至死亡,而電場強度過小或時間過短,又會造成處理效果不明顯,本申請發(fā)明人經(jīng)過大量實驗得出對中山杉136采用強度為15KV/cm,時間30分鐘的靜電場處理可以顯著改善生長狀況,鮮重增加明顯,單因子實驗表明,生長速度增加31.7%,大大促進了細胞的分裂和生長,縮短了離體培養(yǎng)的時間。
      [0028]4.一直以來對于如何利用植物組織培養(yǎng),分化,再生植株,提高植物的繁殖數(shù)量是組織培養(yǎng)研究工作者的研究重點,同時也是技術(shù)難點,其中激素的類別及濃度的使用更是培養(yǎng)基的重要組成部分。我們通過大量的試驗,篩選出中山杉136培養(yǎng)基類型:
      [0029]即誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:改良1/2MS+6-BA0.8mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.5mg/L ;
      [0030]繼代增殖培養(yǎng)基為:改良1/2MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.2mg/L+GA30.5mg/L ;
      [0031]生根培養(yǎng)基為:改良1/2MS+NAA0.8mg/L+IBA0.3mg/L。
      [0032]使用其培養(yǎng)基及特定激素水平能夠提高外植體的萌發(fā)率、誘導(dǎo)率
      [0033]采用本發(fā)明的組織培養(yǎng)繁殖方法,最終增殖率為88-93倍;其中采用繼代增殖培養(yǎng)基,增殖倍數(shù)為8-9倍;采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基,不定芽誘導(dǎo)率為92 %,采用生根培養(yǎng)基,生根率為89%,平均生根數(shù)為4.1條;煉苗成活率達到95%。
      [0034]5.由于中山杉136外植體誘導(dǎo)的愈傷底部有褐化的現(xiàn)象,影響不定芽的再生。因此在試驗當(dāng)中我們在1/2MS培養(yǎng)基,添加適量的活性炭,用來吸附植株分泌的有害次級代謝產(chǎn)物,使植物保持旺盛的生長活力,一定程度的起到了遏制植株褐化的作用(見表2)。
      [0035]表2生根基本培養(yǎng)基的篩選
      [0036]

      【權(quán)利要求】
      1.一種中山杉品種136的離體繁殖方法,其包括如下步驟: (1)外植體選取與消毒:選取春季中山杉136帶有腋芽的枝條作為外植體,進行消毒處理; (2)改良1/2MS培養(yǎng)基的制備:用Ca(NO3)2.4H20260mg/L代替原1/2MS培養(yǎng)基中的CaCl2.2H20,用K2S04560mg/L代替原1/2MS培養(yǎng)基中的KNO3,同時加入活性炭,濃度為:1500mg/L,其他組分均無變化; (3)不定芽的誘導(dǎo):取步驟(I)中消毒后的外植體,切割成0.6-0.8cm長的莖段,每個莖段至少帶一腋芽,接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基,進行不定芽的誘導(dǎo),培養(yǎng)溫度為23±3°C,首先暗培養(yǎng)24h,然后光照培養(yǎng)20-25天(光照時間為14小時/天,光照強度為1500_20001χ),濕度為50%?65% ;其中,不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為所述改良1/2MS+6-BA0.8mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.5mg/L ; (4)高壓靜電場HVEF處理:利用高壓靜電場儀器,進行靜電場處理,強度為15KV/cm,時間30分鐘; (5)繼代增殖:將經(jīng)高壓靜電場處理的不定芽接入繼代增殖培養(yǎng)基,進行繼代培養(yǎng)25-30天,培養(yǎng)溫度為23±3°C,光照時間為14小時/天,光照強度為1500_20001x,濕度為50%?65% ;所述繼代增殖培養(yǎng)基為所述改良1/2MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.2mg/L+GA30.5mg/L ; (6)生根培養(yǎng):接入生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)15-20天,培養(yǎng)溫度為23±3°C,光照時間為14小時/天,光照強度為1500-20001X ;所述的生根培養(yǎng)基為所述改良1/2MS+NAA0.8mg/L+IBA0.3mg/L ; (J)無菌苗的煉苗:將步驟(6)產(chǎn)生的中山杉136帶根無菌苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開,室內(nèi)培養(yǎng)5-7天,然后移入采用多菌靈消毒的基質(zhì)中,所述基質(zhì)由體積比為2: I: I的泥炭土、蛭石以及珍珠巖組成。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述中山杉品種136的離體繁殖方法,其特征在于:所述步驟(I)中外植體的消毒過程:①用中性洗衣粉洗滌,再流水沖洗2h,濾紙吸干表面水分;②在超凈工作臺上先用70%酒精浸泡20?30s,無菌水沖洗3次,每次振蕩3?5min ;③立即轉(zhuǎn)入1%0的升萊溶液中消毒7-10min,最后用無菌水洗漆3?5次,每次振蕩3?5min。
      【文檔編號】A01G31/00GK104126492SQ201410384097
      【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
      【發(fā)明者】陸小清, 李乃偉, 李云龍, 王傳永, 陳紅, 蔡小龍 申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所
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