殺蟲(chóng)蛋白的用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種殺蟲(chóng)蛋白的用途，所述控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法包括：將二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)與Cry2Ab蛋白接觸。本發(fā)明通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)產(chǎn)生能夠殺死二點(diǎn)委夜蛾的Cry2Ab蛋白來(lái)控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)。與現(xiàn)有技術(shù)使用的農(nóng)業(yè)防治方法和化學(xué)防治方法相比，本發(fā)明對(duì)植物進(jìn)行全生育期、全植株的保護(hù)以防治二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的侵害，且無(wú)污染、無(wú)殘留，效果穩(wěn)定、徹底，簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟(jì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】殺蟲(chóng)蛋白的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種殺蟲(chóng)蛋白的用途，特別是涉及一種Cry2Ab蛋白質(zhì)通過(guò)在植物中 表達(dá)來(lái)控制二點(diǎn)委夜蛾為害植物的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 二點(diǎn)委夜蛾（Athetis 1印igone)屬鱗翅目夜蛾科，為雜食性害蟲(chóng)，目前發(fā)現(xiàn)其主 要危害玉米作物，主要分布于我國(guó)黃淮海夏玉米種植區(qū)，在境外主要分布于日本、朝鮮、俄 羅斯、歐洲等地。二點(diǎn)委夜蛾主要在玉米氣生根處的土壤表層處危害玉米根部，咬斷玉米地 上莖桿或淺表層根，受危害的玉米田輕者玉米植株?yáng)|倒西歪，重者造成缺苗斷壟，玉米田中 出現(xiàn)大面積空白地，危害嚴(yán)重地塊甚至毀種。
[0003] 玉米是中國(guó)主要的糧食作物，2011年7月9日，中央電視臺(tái)新聞聯(lián)播首次報(bào)道二 點(diǎn)委夜蛾在中國(guó)的發(fā)生情況，2011年秋季至2012年5月31日，國(guó)家玉米產(chǎn)業(yè)體系病蟲(chóng)防 控研究室通過(guò)多次田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)2012年度二點(diǎn)委夜蛾的越冬種群數(shù)量較大，蟲(chóng)口基數(shù)偏 高，一代幼蟲(chóng)種群密度大，在黃淮海夏玉米苗期有繼續(xù)暴發(fā)為害的可能。為了防治二點(diǎn)委夜 蛾，人們目前主要采用的防治方法有：農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治。
[0004] 農(nóng)業(yè)防治是對(duì)整個(gè)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中多個(gè)因素的綜合協(xié)調(diào)管理，調(diào)控作物、害蟲(chóng)、環(huán) 境因素、創(chuàng)造一個(gè)有利于作物生長(zhǎng)而不利于二點(diǎn)委夜蛾發(fā)生的農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，如及時(shí)清除 玉米苗基部麥秸、雜草等覆蓋物至遠(yuǎn)離植株的玉米大行間并裸露出地面，以便于后續(xù)用藥 劑能直接接觸到二點(diǎn)委夜蛾。因農(nóng)業(yè)防治必須服從作物布局和增產(chǎn)的要求，應(yīng)用有一定的 局限性，不能作為應(yīng)急措施，在二點(diǎn)委夜蛾爆發(fā)時(shí)就顯得無(wú)能為力。
[0005] 化學(xué)防治即農(nóng)藥防治，是利用化學(xué)殺蟲(chóng)劑來(lái)殺滅害蟲(chóng)，是二點(diǎn)委夜蛾綜合治理的 重要組成部分，它具有快速、方便、簡(jiǎn)便和高經(jīng)濟(jì)效益的特點(diǎn)，特別是二點(diǎn)委夜蛾大發(fā)生的 情況下，是必不可少的應(yīng)急措施，它可以一定程度地在二點(diǎn)委夜蛾造成危害前降低蟲(chóng)口密 度。目前化學(xué)防治方法主要有毒餌法、毒土法、灌藥法和噴施農(nóng)藥等。但化學(xué)防治也有其局 限性，如使用不當(dāng)往往會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物發(fā)生藥害、害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性，以及殺傷天敵、污染環(huán)境， 使農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞和農(nóng)藥殘留對(duì)人、畜的安全構(gòu)成威脅等不良后果；且因二點(diǎn)委夜 蛾喜潮濕、陰暗環(huán)境，一般躲藏于麥秸等覆蓋物或者土表之下，使得化學(xué)農(nóng)藥很難直接接觸 二點(diǎn)委夜蛾蟲(chóng)體而使得防治效果不佳。
[0006] 為了解決農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，科學(xué)家們經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn) 將編碼殺蟲(chóng)蛋白的抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲(chóng)害。 Cry2Ab殺蟲(chóng)蛋白是眾多殺蟲(chóng)蛋白中的一種，是由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的不溶性伴孢結(jié)晶蛋 白。
[0007] Cry2Ab蛋白被昆蟲(chóng)攝入進(jìn)入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲(chóng)中腸的堿性pH環(huán) 境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉(zhuǎn)變成活性片段；活性片段和昆蟲(chóng)中 腸上皮細(xì)胞膜上表面上受體結(jié)合，插入腸膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)穿孔病灶，破壞細(xì)胞膜內(nèi)外的 滲透壓變化及pH平衡等，擾亂昆蟲(chóng)的消化過(guò)程，最終導(dǎo)致其死亡。
[0008] 已證明轉(zhuǎn)Cry2Ab基因的植株可以抵抗玉米螟、棉鈴蟲(chóng)等鱗翅目（Lepidoptera)害 蟲(chóng)的侵害，然而，至今尚無(wú)關(guān)于通過(guò)產(chǎn)生表達(dá)Cry2Ab蛋白的轉(zhuǎn)基因植株來(lái)控制二點(diǎn)委夜蛾 對(duì)植物危害的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲(chóng)蛋白的用途，首次提供了通過(guò)產(chǎn)生表達(dá)Cry2Ab蛋 白的轉(zhuǎn)基因植株來(lái)控制二點(diǎn)委夜蛾對(duì)植物危害的方法，且有效克服現(xiàn)有技術(shù)農(nóng)業(yè)防治和化 學(xué)防治等技術(shù)缺陷。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，包括將二點(diǎn)委 夜蛾害蟲(chóng)與Cry2Ab蛋白接觸。
[0011] 進(jìn)一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的植物細(xì)胞中，所述二點(diǎn) 委夜蛾害蟲(chóng)通過(guò)攝食所述植物細(xì)胞與所述Cry2Ab蛋白接觸。
[0012] 更進(jìn)一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中，所述 二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)通過(guò)攝食所述轉(zhuǎn)基因植物的組織與所述Cry2Ab蛋白接觸，接觸后所述二 點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)生長(zhǎng)受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以?shí)現(xiàn)對(duì)二點(diǎn)委夜蛾危害植物的控制。
[0013] 所述轉(zhuǎn)基因植物處于任意生育期。
[0014] 所述轉(zhuǎn)基因植物的組織為根、葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
[0015] 所述對(duì)二點(diǎn)委夜蛾危害植物的控制不因種植地點(diǎn)和/或種植時(shí)間的改變而改變。
[0016] 所述植物為玉米、花生或大豆。
[0017] 所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述Cry2Ab蛋白的多核苷酸的植物。
[0018] 優(yōu)選地，所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。所 述Cry2Ab蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
[0019] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述植物還可以包含至少一種不同于編碼所述Cry2Ab 蛋白的第二種核苷酸。
[0020] 進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸編碼Cry類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、Vip類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、蛋白酶 抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過(guò)氧化物酶。
[0021] 優(yōu)選地，所述第二種核苷酸編碼CrylA. 105蛋白。
[0022] 更進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸具有SEQ ID Ν0:3所示的核苷酸序列。
[0023] 可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中重要基因的dsRNA。
[0024] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種Cry2Ab蛋白質(zhì)控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的用 途。
[0025] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的植物的方法， 包括向所述植物的基因組中引入編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列。
[0026] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的植物種子的方 法，包括將由所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，從而產(chǎn)生含有編碼Cry2Ab蛋白的 多核苷酸序列的種子。
[0027] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的植物的方法， 包括：
[0028] 種植至少一粒植物種子，所述植物種子的基因組中包括編碼Cry2Ab蛋白的多核 苷酸序列；
[0029] 使所述植物種子長(zhǎng)成植株；
[0030] 使所述植株在人工接種二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)和/或二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)自然發(fā)生危害的 條件下生長(zhǎng)，收獲與其他不具有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的 植物損傷的植株。
[0031] 本發(fā)明中所述的"接觸"，是指昆蟲(chóng)和/或害蟲(chóng)觸碰、停留和/或攝食植物、植物器 官、植物組織或植物細(xì)胞，所述植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞既可以是其體內(nèi)表達(dá) 殺蟲(chóng)蛋白，還可以是所述植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的表面具有殺蟲(chóng)蛋白和/或 具有產(chǎn)生殺蟲(chóng)蛋白的微生物。
[0032] 本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"控制"和/或"防治"是指二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)與Cry2Ab蛋白接觸，接觸 后二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)生長(zhǎng)受到抑制和/或?qū)е滤劳觥＿M(jìn)一步地，二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)通過(guò)攝食植 物組織與Cry2Ab蛋白接觸，接觸后全部或部分二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)生長(zhǎng)受到抑制和/或?qū)е滤?亡。抑制是指亞致死，即尚未致死但能引起生長(zhǎng)發(fā)育、行為、生理、生化和組織等方面的某種 效應(yīng)，如生長(zhǎng)發(fā)育緩慢和/或停止。同時(shí)，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培 養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，含有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的控制二 點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的植物和/或植物種子，在人工接種二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)和/或二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng) 自然發(fā)生危害的條件下，與非轉(zhuǎn)基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，具體表現(xiàn)包 括但不限于改善的莖桿抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增產(chǎn)等。Cry2Ab蛋白對(duì)二點(diǎn) 委夜蛾的"控制"和/或"防治"作用是可以獨(dú)立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治" 二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的物質(zhì)的存在而減弱和/或消失。具體地，轉(zhuǎn)基因植物（含有編碼Cry2Ab 蛋白的多核苷酸序列）的任何組織同時(shí)和/或不同步地，存在和/或產(chǎn)生，Cry2Ab蛋白和 /或可控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的另一種物質(zhì)，則所述另一種物質(zhì)的存在既不影響Cry2Ab蛋白 對(duì)二點(diǎn)委夜蛾的"控制"和/或"防治"作用，也不能導(dǎo)致所述"控制"和/或"防治"作用完 全由所述另一種物質(zhì)實(shí)現(xiàn)，而與Cry2Ab蛋白無(wú)關(guān)。通常情況下，在大田，二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)攝 食植物組織的過(guò)程短暫且很難用肉眼觀察到，因此，在人工接種二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)和/或二 點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)自然發(fā)生危害的條件下，如轉(zhuǎn)基因植物（含有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序 列）的任何組織存在死亡的二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)、和/或在其上停留生長(zhǎng)受到抑制的二點(diǎn)委夜 蛾害蟲(chóng)、和/或與非轉(zhuǎn)基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，即為實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的 方法和/或用途，即通過(guò)二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)與Cry2Ab蛋白接觸以實(shí)現(xiàn)控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的 方法和/或用途。
[0033] 在本發(fā)明中，Cry2Ab蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個(gè)或多個(gè)Cry 類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)和/或Vip類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過(guò)一種的殺蟲(chóng)毒素在同一株轉(zhuǎn)基因 植物中共同表達(dá)可以通過(guò)遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物 (第1親本）可以通過(guò)遺傳工程操作表達(dá)Cry2Ab蛋白質(zhì)，第二種植物（第2親本）可以通 過(guò)遺傳工程操作表達(dá)Cry類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)和/或Vip類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。通過(guò)第1親本和第2親 本雜交獲得表達(dá)引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0034] RNA干擾（RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。因此在本 發(fā)明中可以使用RNAi技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉目標(biāo)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中特定基因的表達(dá)。
[0035] 二點(diǎn)委夜蛾（Athetis lepigone)與棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera Hubner)雖然 同屬鱗翅目夜蛾科，但是二點(diǎn)委夜蛾與棉鈴蟲(chóng)在生物學(xué)上是清晰的、截然不同的兩個(gè)物種， 至少存在以下主要區(qū)別：
[0036] 1、食性不同。二點(diǎn)委夜蛾除嚴(yán)重威脅夏玉米外，還對(duì)花生和大豆也造成危害；而棉 鈴蟲(chóng)是棉花蕾鈴期重要鉆蛀性害蟲(chóng)，主要蛀食蕾、花、鈴，也取食嫩葉。
[0037] 2、分布區(qū)域不同。目前二點(diǎn)委夜蛾主要在黃淮海夏玉米區(qū)的河北、山東、河南、山 西、江蘇、安徽共6省47個(gè)地（市）297個(gè)縣（市、區(qū)）暴發(fā)危害；而棉鈴蟲(chóng)廣泛分布在中國(guó) 及世界各地，中國(guó)棉區(qū)和蔬菜種植區(qū)均有發(fā)生，黃河流域棉區(qū)、長(zhǎng)江流域棉區(qū)受害較重；近 年來(lái)，新疆棉區(qū)也時(shí)有發(fā)生。
[0038] 3、為害習(xí)性不同。二點(diǎn)委夜蛾在河北省部分夏玉米，尤其以小麥套播的玉米田發(fā) 生重，主要以幼蟲(chóng)躲在玉米幼苗周?chē)乃辂溄障禄蛟?-5厘米的表土層危害玉米苗，一般 一株有蟲(chóng)1-2頭，多的達(dá)10-20頭；在玉米幼苗3-5葉期的地塊，幼蟲(chóng)主要咬食玉米莖基部， 形成3-4毫米圓形或橢圓形孔洞，切斷營(yíng)養(yǎng)輸送，造成地上部玉米心葉萎蔫枯死；在玉米苗 較大（8-10葉期）的地塊幼蟲(chóng)主要咬斷玉米根部，包括氣生根和主根，造成玉米倒伏，嚴(yán)重 者枯死。危害株率一般在1%-5%，嚴(yán)重地塊達(dá)15%-20%。而棉鈴蟲(chóng)初齡幼蟲(chóng)取食嫩葉， 其后為害蕾、花、鈴，多從基部蛀入蕾、鈴，在內(nèi)取食，并能轉(zhuǎn)移為害，轉(zhuǎn)移時(shí)間多在夜間和清 晨；受害幼蕾苞葉張開(kāi)、脫落，被蛀青鈴易受污染而腐爛；老熟幼蟲(chóng)吐絲下垂，多數(shù)入土作 土室化蛹，以蛹越冬。
[0039] 4、形態(tài)特征不同。
[0040] 1)卵的形態(tài)不同：二點(diǎn)委夜蛾的卵成饅頭狀，上有縱脊，初產(chǎn)黃綠色，后土黃色； 而棉鈴蟲(chóng)的卵呈半球形，約0. 5毫米，頂部微隆起，表面布滿(mǎn)縱橫紋，縱紋從頂部看有12條， 中部2縱紋間夾有1-2條短紋且多2-3岔，所以從中部看有26-29條縱紋，乳白色。
[0041] 2)幼蟲(chóng)的形態(tài)不同：二點(diǎn)委夜蛾的老熟幼蟲(chóng)體長(zhǎng)20mm左右，體色灰黃色，頭部褐 色，幼蟲(chóng)14-18mm長(zhǎng)，黃灰色或黑褐色，比較明顯的特征是個(gè)體節(jié)有一個(gè)倒三角的深褐色斑 紋，腹部背面有兩條褐色背側(cè)線，到胸節(jié)消失；而棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)共有6齡，有時(shí)5齡（取食豌豆 苗，向日葵花盤(pán)的），老熟6齡蟲(chóng)長(zhǎng)約40-50mm，頭黃褐色有不明顯的斑紋，幼蟲(chóng)體色多變，分 4個(gè)類(lèi)型：a)體色淡紅，背線、亞背線褐色，氣門(mén)線白色，毛突黑色；b)體色黃白，背線、亞背 線淡綠，氣門(mén)線白色，毛突與體色相同；c)體色淡綠，背線、亞背線不明顯，氣門(mén)線白色，毛 突與體色相同；d)體色深綠，背線、亞背線不太明顯，氣門(mén)淡黃色；氣門(mén)上方有一褐色縱帶， 是由尖銳微刺排列而成；幼蟲(chóng)腹部第1、2、5節(jié)各有2個(gè)毛突特別明顯。
[0042] 3)蛹的形態(tài)不同：二點(diǎn)委夜蛾的蛹長(zhǎng)IOmm左右，化蛹初期淡黃褐色，逐漸變?yōu)楹?色，老熟幼蟲(chóng)入土做一絲質(zhì)土繭包被內(nèi)化蛹；而棉鈴蟲(chóng)的蛹長(zhǎng)17-20mm，紡錘形，赤褐至黑 褐色，腹末有一對(duì)臀刺，刺的基部分開(kāi)；氣門(mén)較大，圍孔片呈筒狀突起較高，腹部第5-7節(jié)的 點(diǎn)刻半圓形，較粗而稀；入土 5-15cm化蛹，外被土苗。
[0043] 4)成蟲(chóng)的形態(tài)不同：二點(diǎn)委夜蛾成蟲(chóng)體長(zhǎng)10-12mm，翅展20mm，雌蟲(chóng)會(huì)略大于雄 蟲(chóng)，頭、胸、腹灰褐色，前翅灰褐色，有暗褐色細(xì)點(diǎn)，內(nèi)線、外線暗褐色，環(huán)紋為一黑點(diǎn)，腎紋 小，有黑點(diǎn)組成的邊緣，外側(cè)中凹，有一白點(diǎn)，外線波浪型，翅外緣有一列黑點(diǎn)，后翅白色微 褐，端區(qū)暗褐色，腹部灰褐色，雄蛾外生殖器的抱器瓣端半部寬，背緣凹，中部有一鉤狀突 起，陽(yáng)莖內(nèi)有刺狀陽(yáng)莖針；而棉鈴蟲(chóng)成蟲(chóng)為灰褐色中型蛾，體長(zhǎng)15-20_，翅展31-40_，復(fù) 眼球形，綠色；雌蛾赤褐色至灰褐色，雄蛾青灰色，棉鈴蟲(chóng)的前后翅，可作為夜蛾科成蟲(chóng)的模 式，其前翅外橫線外有深灰色寬帶，帶上有7個(gè)小白點(diǎn)，腎紋，環(huán)紋暗褐色，后翅灰白，沿外 緣有黑褐色寬帶，寬帶中央有2個(gè)相連的白斑，后翅前緣有1個(gè)月牙形褐色斑。
[0044] 5、生長(zhǎng)習(xí)性和發(fā)生規(guī)律不同。二點(diǎn)委夜蛾幼蟲(chóng)一共6齡，幼蟲(chóng)期約18天，幼蟲(chóng)的 抗逆性較強(qiáng)；二點(diǎn)委夜蛾成蟲(chóng)有兩個(gè)明顯的蛾峰：7月初前出現(xiàn)第1個(gè)蛾峰，7月中下旬到 8月上中旬出現(xiàn)第2個(gè)蛾峰；成蟲(chóng)具有較強(qiáng)的生殖能力：平均單雌產(chǎn)卵量可達(dá)300-500粒， 產(chǎn)卵可持續(xù)3-7天，而卵的孵化率接近100% ;棉田倒茬玉米田比重茬玉米田發(fā)生嚴(yán)重，麥 糠麥秸覆蓋面積大比沒(méi)有麥秸麥糠覆蓋的嚴(yán)重，播種時(shí)間晚比播種時(shí)間早的嚴(yán)重，田間濕 度大比濕度小的嚴(yán)重，二點(diǎn)委夜蛾喜陰濕環(huán)境，往往躲藏在麥秸或土中，給噴施農(nóng)藥造成了 極大的不便。而棉鈴蟲(chóng)發(fā)生的代數(shù)因年份因地區(qū)而異，在山東省萊州市每年發(fā)生4代，九月 下旬成長(zhǎng)幼蟲(chóng)陸續(xù)下樹(shù)入土，在苗木附近或雜草下5-lOcm深的土中化蛹越冬；立春氣溫回 升15°C以上時(shí)開(kāi)始羽化，4月下旬至5月上旬為羽化盛期，成蟲(chóng)出現(xiàn)第一代在6月中下旬， 第二代在7月中下旬，第三代在8月中下旬至9月上旬至10月上旬尚有棉鈴蟲(chóng)出現(xiàn)，成蟲(chóng) 有趨光性，羽化后即在夜間閃配產(chǎn)卵，卵散產(chǎn)，較分散，一頭雌蛾一生可產(chǎn)卵500-1000粒， 最高可達(dá)2700粒，卵多產(chǎn)在葉背面，也有產(chǎn)在正面、頂芯、葉柄、嫩莖上或農(nóng)作的、雜草等其 它植物上；幼蟲(chóng)孵化后有取食卵殼習(xí)性，初孵幼蟲(chóng)有群集限食習(xí)性，二三頭、三五頭在葉片 正面或背面，頭向葉緣排列、自葉緣向內(nèi)取食，結(jié)果葉片被吃光，只剩主脈和葉柄，或成網(wǎng)狀 枯萎，造成干葉；1-2齡幼蟲(chóng)沿柄下行至銀杏苗頂芽處自一側(cè)蛀食或沿頂芽處下蛀入嫩枝， 造成頂梢或頂部簇生葉死亡，危害十分嚴(yán)重；3齡前的幼蟲(chóng)食量較少，較集中，隨著幼蟲(chóng)生 長(zhǎng)而逐漸分散，進(jìn)入4齡食量大增，可食光葉片，只剩葉柄；幼蟲(chóng)7-8月份為害最盛；棉鈴蟲(chóng) 有轉(zhuǎn)移危害的習(xí)性，一只幼蟲(chóng)可危害多株苗木；各齡幼蟲(chóng)均有食掉蛻下舊皮留頭殼的習(xí)性， 給鑒別蟲(chóng)齡造成一定困難，蟲(chóng)齡不整齊；棉鈴蟲(chóng)發(fā)生的最適宜溫度為25-28°C，相對(duì)濕度 70-90%;第二代、第三代為害最為嚴(yán)重，嚴(yán)重地片蟲(chóng)口密度達(dá)98頭/百葉，蟲(chóng)株率60-70%， 個(gè)別地片達(dá)100%，受害葉片達(dá)1/3以上，影響葉產(chǎn)量20%，質(zhì)量下降至少1個(gè)等級(jí)，苗木生 長(zhǎng)量影響很大。
[0045] 綜上所述，二點(diǎn)委夜蛾與棉鈴蟲(chóng)雖然同屬鱗翅目夜蛾科，但是僅在外部形態(tài)和為 害習(xí)性上就存在諸多方面的不同，且二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，無(wú)法交配產(chǎn)生后代。因此，可確定 二點(diǎn)委夜蛾與棉鈴蟲(chóng)是兩種不同的害蟲(chóng)，從而說(shuō)明二者中腸上皮細(xì)胞膜上表面上與Bt毒 素結(jié)合的受體也是不同的，但是某一類(lèi)殺蟲(chóng)晶體蛋白只能與特定的受體蛋白結(jié)合，即Bt毒 素對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)專(zhuān)一性強(qiáng)，可見(jiàn)將Cry2Ab蛋白用于控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法是非顯而易 見(jiàn)的。
[0046] 本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物 細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。
[0047] 本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整"基因"，在所需宿主細(xì)胞中編碼 蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置 于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。
[0048] 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與 另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。由于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了 DNA的其它互補(bǔ)鏈。這樣，本發(fā)明 包括對(duì)序列表中示例的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的"編碼鏈"指與反義 鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補(bǔ)鏈，它 作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實(shí)際上是從DNA的"反義"鏈轉(zhuǎn)錄的。"有義"或"編碼"鏈有 一系列密碼子（密碼子是三個(gè)核苷酸，一次讀三個(gè)可以產(chǎn)生特定氨基酸），其可作為開(kāi)放閱 讀框（ORF)閱讀來(lái)形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當(dāng)功能的RNA和 PNA (肽核酸）。
[0049] 本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明Cry2Ab基因雜交。任何常規(guī) 的核酸雜交或擴(kuò)增方法都可以用于鑒定本發(fā)明Cry2Ab基因的存在。核酸分子或其片段在 一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個(gè)核酸分子能形成反 平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說(shuō)這兩個(gè)核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個(gè)核 酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱(chēng)其中一個(gè)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的"互補(bǔ)物"。本發(fā) 明中，當(dāng)一個(gè)核酸分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)核酸分子的對(duì)應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則稱(chēng)這 兩個(gè)核酸分子顯示出"完全互補(bǔ)性"。如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從 而使它們?cè)谥辽俪Ｒ?guī)的"低度嚴(yán)格"條件下退火且彼此結(jié)合，則稱(chēng)這兩個(gè)核酸分子為"最低 程度互補(bǔ)"。類(lèi)似地，如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們?cè)诔Ｒ?guī)的 "高度嚴(yán)格"條件下退火且彼此結(jié)合，則稱(chēng)這兩個(gè)核酸分子具有"互補(bǔ)性"。從完全互補(bǔ)性中 偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個(gè)分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個(gè)核酸分 子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ)性，以使得在所采用的特定 溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0050] 本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格條件下能夠 和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性雜交。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件， 例如，大約在45°C條件下用6. OX氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)處理，然后在50°C條件下用 2. 0 X SSC洗滌，這些條件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選 自低度嚴(yán)格條件的約2. 0 X SSC、50°C到高度嚴(yán)格條件的約0. 2 X SSC、50°C。此外，洗滌步驟 中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴(yán)格條件的約65°C。溫度條 件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個(gè)保持不變而另一個(gè)變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本 發(fā)明所述嚴(yán)格條件可為在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下與SEQIDN0 :2發(fā)生特異性 雜交，然后用2XSSC、0. 1% SDS和1XSSC、0. 1% SDS各洗膜1次。
[0051] 因此，具有抗蟲(chóng)活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明SEQ ID NO:2雜交的序列包括在本 發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40 % -50 %同源，大約60 %、65 %或70 %同源，甚 至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 更大的序列同源性。
[0052] 本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定 示例的蛋白質(zhì)的殺蟲(chóng)活性特征的部分和/片段（包括與全長(zhǎng)蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端缺 失）、變體、突變體、取代物（有替代氨基酸的蛋白質(zhì)）、嵌合體和融合蛋白。所述"變體"或 "變異"是指編碼同一蛋白或編碼有殺蟲(chóng)活性的等價(jià)蛋白的核苷酸序列。所述"等價(jià)蛋白" 是指與權(quán)利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的生物活性的蛋白。
[0053] 本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的"片段"或"截短"是指涉及的原始DNA或 蛋白序列（核苷酸或氨基酸）的一部分或其人工改造形式（例如適合植物表達(dá)的序列），前 述序列的長(zhǎng)度可存在變化，但長(zhǎng)度足以確保（編碼）蛋白質(zhì)為昆蟲(chóng)毒素。
[0054] 使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以修飾基因和容易的構(gòu)建基因變異體。例如，本領(lǐng)域熟知制造點(diǎn) 突變的技術(shù)。又例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5605793描述了在隨機(jī)斷裂后使用DNA重裝配產(chǎn)生其它分 子多樣性的方法?？梢允褂蒙虡I(yè)化核酸內(nèi)切酶制造全長(zhǎng)基因的片段，并且可以按照標(biāo)準(zhǔn)程 序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點(diǎn)誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切 除核苷酸。還可以使用多種限制性?xún)?nèi)切酶獲取編碼活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接 獲得這些毒素的活性片段。
[0055] 本發(fā)明可以從B. t.分離物和/或DNA文庫(kù)衍生出等價(jià)蛋白和/或編碼這些等價(jià) 蛋白的基因。有多種方法獲取本發(fā)明的殺蟲(chóng)蛋白。例如，可以使用本發(fā)明公開(kāi)和要求保護(hù) 的殺蟲(chóng)蛋白的抗體從蛋白質(zhì)混合物鑒定和分離其它蛋白。特別地，抗體可能是由蛋白最恒 定和與其它B.t.蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通過(guò)免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測(cè) 定（ELISA)或western印跡方法使用這些抗體專(zhuān)一地鑒定有特征活性的等價(jià)蛋白?？墒褂?本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)程序容易的制備本發(fā)明中公開(kāi)的蛋白或等價(jià)蛋白或這類(lèi)蛋白的片段的抗體。然 后可以從微生物中獲得編碼這些蛋白的基因。
[0056] 由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn) 生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。 這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述"基本上相同的"序列是指有氨基酸取 代、缺失、添加或插入但實(shí)質(zhì)上不影響殺蟲(chóng)活性的序列，亦包括保留殺蟲(chóng)活性的片段。
[0057] 本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸 變化為：小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺 失，通常約1-30個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個(gè)甲硫氨酸 殘基；小的連接肽，例如約20-25個(gè)殘基長(zhǎng)。
[0058] 保守取代的實(shí)例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代：堿性氨基酸（如精氨酸、賴(lài)氨 酸和組氨酸）、酸性氨基酸（如谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸（如谷氨酰胺、天冬酰胺）、 疏水性氨基酸（如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）、芳香氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨 酸），以及小分子氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸）。通常不改變特定 活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N. Neurath和R. L. Hi 11 在1979年紐約學(xué)術(shù)出版社（Academic Press)出版的《Protein》中進(jìn)行了描述。最常見(jiàn)的 互換有 Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thu/Ser，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/ Phe，Ala/Pro, Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu 和 Asp/Gly，以及它們相反的 互換。
[0059] 對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)地，這種取代可以在對(duì)分子功能起重要作用 的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對(duì)于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇 不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變進(jìn)行 鑒定（如參見(jiàn)，Cunningham 和 Wells，1989, Science244 :1081-1085)。后一技術(shù)是在分子 中每一個(gè)帶正電荷的殘基處引入突變，檢測(cè)所得突變分子的抗蟲(chóng)活性，從而確定對(duì)該分子 活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)也可以通過(guò)其三維結(jié)構(gòu)的分析來(lái)測(cè) 定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等技術(shù)測(cè)定（參見(jiàn)，如de Vos 等，1992, Science 255 :306-312 ;Smith 等，1992, J. Mol. Biol 224:899-904 ;Wlodaver 等， 1992, FEBS Letters 309 :59-64)。
[0060] 在本發(fā)明中，Cry2Ab蛋白包括但不限于Cry2Ab蛋白，或者與上述蛋白的氨基酸序 列具有至少70%同源性且對(duì)二點(diǎn)委夜蛾具有殺蟲(chóng)活性的殺蟲(chóng)片段或功能區(qū)域。
[0061] 因此，與序列1所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明 中。這些序列與本發(fā)明序列類(lèi)似性/相同性典型的大于60 %，優(yōu)選的大于75%，更優(yōu)選的 大于80%，甚至更優(yōu)選的大于90%，并且可以大于95%。也可以根據(jù)更特定的相同性和/ 或類(lèi)似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有49%、 50 %,51 %,52 %,53 %,54 %,55 %,56 %,57 %,58 %,59 %,60 %,61 %,62 %,63 %,64 %, 65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %,77 %,78 %,79 %, 80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %, 95%、96%、97%、98%或99%的相同性和/或類(lèi)似性。
[0062] 本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、終止子，增強(qiáng)子，前導(dǎo)序列， 內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述Cry2Ab蛋白的調(diào)節(jié)序列。
[0063] 所述啟動(dòng)子為植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子，所述的"植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子"是指確保 與其連接的編碼序列在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子。植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為組成型 啟動(dòng)子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子的示例包括但不限于，來(lái)源于花椰菜花葉病毒的 35S啟動(dòng)子、玉米Ubi啟動(dòng)子、水稻G0S2基因的啟動(dòng)子等。備選地，植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子 可為組織特異的啟動(dòng)子，即該啟動(dòng)子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的 表達(dá)水平高于植物的其他組織（可通過(guò)常規(guī)RNA試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定），如PEP羧化酶啟動(dòng)子。備 選地，植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表 達(dá)模式的啟動(dòng)子是指當(dāng)植物經(jīng)受機(jī)械或由昆蟲(chóng)啃食引起的創(chuàng)傷時(shí)，啟動(dòng)子調(diào)控下的編碼序 列的表達(dá)較正常生長(zhǎng)條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子的示例包括但不限于，馬鈴薯和 西紅柿的蛋白酶抑制基因 （Pin I和pin II )和玉米蛋白酶抑制基因（MPI)的啟動(dòng)子。 [0064] 所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽（又稱(chēng)分泌信號(hào)序列或?qū)蛐蛄校┦侵笇?dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細(xì)胞器 或細(xì)胞區(qū)室，對(duì)受體蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽 序列靶向葉綠體，或者利用'KDEL'保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的 CTPP靶向液泡。
[0065] 所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列（腦心肌炎 病毒5'非編碼區(qū)）；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒）前導(dǎo)序列；人 類(lèi)免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)（BiP);苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序 列（AMV RNA4);煙草花葉病毒（TMV)前導(dǎo)序列。
[0066] 所述增強(qiáng)子包含但不限于，花椰菜花葉病毒（CaMV)增強(qiáng)子、玄參花葉病毒（FMV) 增強(qiáng)子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒（CERV)增強(qiáng)子、木薯脈花葉病毒（CsVMV)增強(qiáng)子、紫茉莉花葉病 毒（MMV)增強(qiáng)子、夜香樹(shù)黃化曲葉病毒（CmYLCV)增強(qiáng)子、木爾坦棉花曲葉病毒（CLCuMV)、鴨 跖草黃斑駁病毒（CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒（PCLSV)增強(qiáng)子。
[0067] 對(duì)于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛 素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子1、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。對(duì)于雙子葉植物應(yīng)用而言， 所述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-I內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和"超級(jí)泛素"內(nèi) 含子。
[0068] 所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號(hào)序列，包括但不限 于，來(lái)源于農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶（NOS)基因的多聚腺苷酸 化信號(hào)序列、來(lái)源于蛋白酶抑制劑II (pin II )基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列、來(lái)源于豌豆 ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列和來(lái)源于α-微管蛋白（a-tubulin)基因的 多聚腺苷酸化信號(hào)序列。
[0069] 本發(fā)明中所述"有效連接"表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對(duì) 相連序列來(lái)說(shuō)需要的功能。在本發(fā)明中所述"有效連接"可以為將啟動(dòng)子與感興趣的序列 相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并 且想要獲得該蛋白的表達(dá)時(shí)"有效連接"表示：?jiǎn)?dòng)子與所述序列相連，相連的方式使得得 到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋 白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起 始密碼子。備選地，如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的 表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得5'非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動(dòng)子相連 結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開(kāi)放讀碼框的關(guān)系是符合 讀碼框的?？梢?有效連接"的核酸序列包括但不限于：提供基因表達(dá)功能的序列（即基因 表達(dá)元件，例如啟動(dòng)子、5'非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3'非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位 點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子）、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列（即T-DNA邊界序列、位點(diǎn)特 異性重組酶識(shí)別位點(diǎn)、整合酶識(shí)別位點(diǎn)）、提供選擇性功能的序列（即抗生素抗性標(biāo)記物、 生物合成基因）、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列（即多接 頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列）和提供復(fù)制功能的序列（即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序 列、著絲粒序列）。
[0070] 本發(fā)明中所述的"殺蟲(chóng)"是指對(duì)農(nóng)作物害蟲(chóng)是有毒的。更具體地，目標(biāo)昆蟲(chóng)是二點(diǎn) 委夜蛾害蟲(chóng)。
[0071] 本發(fā)明中Cry2Ab蛋白對(duì)二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)具有毒性。本發(fā)明中的植物，特別是玉 米，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含編碼Cry2Ab蛋白的核苷酸序列，二點(diǎn)委 夜蛾害蟲(chóng)通過(guò)攝食植物組織與該蛋白接觸，接觸后二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)生長(zhǎng)受到抑制和/或?qū)?致死亡。同時(shí)，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或 生成。此外，該植物可基本消除對(duì)化學(xué)或生物殺蟲(chóng)劑的需要（所述化學(xué)或生物殺蟲(chóng)劑為針 對(duì)Cry2Ab蛋白所靶向的二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)劑）。
[0072] 植物材料中殺蟲(chóng)晶體蛋白（ICP)的表達(dá)水平可通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)所描述的多種方法 進(jìn)行檢測(cè)，例如通過(guò)應(yīng)用特異引物對(duì)組織內(nèi)產(chǎn)生的編碼殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的mRNA進(jìn)行定量，或直 接特異性檢測(cè)產(chǎn)生的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的量。
[0073] 可以應(yīng)用不同的試驗(yàn)測(cè)定植物中ICP的殺蟲(chóng)效果。本發(fā)明中目標(biāo)昆蟲(chóng)主要為二點(diǎn) 委夜蛾。
[0074] 本發(fā)明中，所述Cry2Ab蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。 除了包含Cry2Ab蛋白的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼第二種殺蟲(chóng)核苷酸、編碼 選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。
[0075] 此外，包含編碼本發(fā)明Cry2Ab蛋白的核苷酸序列的表達(dá)盒在植物中還可以與至 少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質(zhì)一起表達(dá)，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺 膦抗性基因（如bar基因、pat基因）、苯敵草抗性基因（如pmph基因）、草甘膦抗性基因 (如EPSPS基因）、溴苯腈（bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對(duì)除草劑茅草枯的抗 性基因、對(duì)氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑（如PPT)的抗性基因，從而獲得既具 有高殺蟲(chóng)活性、又具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
[0076] 本發(fā)明中，將外源DNA導(dǎo)入（引入）植物，如將編碼所述Cry2Ab蛋白的基因或表 達(dá)盒或重組載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā) 射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
[0077] 本發(fā)明提供了一種殺蟲(chóng)蛋白的用途，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0078] 1、內(nèi)因防治?，F(xiàn)有技術(shù)主要是通過(guò)外部作用即外因來(lái)控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的危 害，如農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治；而本發(fā)明是通過(guò)植物體內(nèi)產(chǎn)生能夠殺死二點(diǎn)委夜蛾的Cry2Ab 蛋白來(lái)控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的，即通過(guò)內(nèi)因來(lái)防治。
[0079] 2、無(wú)污染、無(wú)殘留?，F(xiàn)有技術(shù)使用的化學(xué)防治方法雖然對(duì)控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的 危害起到了一定作用，但同時(shí)也對(duì)人、畜和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)了污染、破壞和殘留；使用本 發(fā)明控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，可以消除上述不良后果。
[0080] 3、全生育期防治?，F(xiàn)有技術(shù)使用的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法都是階段性的，而 本發(fā)明是對(duì)植物進(jìn)行全生育期的保護(hù)，轉(zhuǎn)基因植物（Cry2Ab蛋白）從發(fā)芽、生長(zhǎng)，一直到開(kāi) 花、結(jié)果，都可以避免遭受二點(diǎn)委夜蛾的侵害。
[0081] 4、全植株防治?，F(xiàn)有技術(shù)使用的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法大多是局部性的，如 葉面噴施；而本發(fā)明是對(duì)整個(gè)植株進(jìn)行保護(hù)，如轉(zhuǎn)基因植物（Cry2Ab蛋白）的根、葉片、莖 桿、雄穗、雌穗、花藥、花絲等都是可以抵抗二點(diǎn)委夜蛾侵害的。
[0082] 5、效果穩(wěn)定?，F(xiàn)有技術(shù)使用的噴施農(nóng)藥的方法需要直接噴施到作物表面，容易造 成噴施不均勻或漏噴等情況；本發(fā)明是使所述Cry2Ab蛋白在植物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)量基 本上穩(wěn)定一致，且本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物（Cry2Ab蛋白）的防治效果在不同地點(diǎn)、不同時(shí)間、不 同遺傳背景也都是穩(wěn)定一致的。
[0083] 6、簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟(jì)。由于二點(diǎn)委夜蛾特殊的隱蔽發(fā)生與危害特征，導(dǎo)致對(duì)其危害 的監(jiān)測(cè)和防治較為困難，大大地增加了種植成本；本發(fā)明只需種植能夠表達(dá)Cry2Ab蛋白的 轉(zhuǎn)基因植物即可，而不需要采用其它措施，從而節(jié)省了大量人力、物力和財(cái)力。
[0084] 7、效果徹底?，F(xiàn)有技術(shù)使用的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其效果是不徹底的，只 起到減輕作用；而本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物（Cry2Ab蛋白）對(duì)初孵二點(diǎn)委夜蛾幼蟲(chóng)的防治效果基 本為百分之百，且對(duì)極個(gè)別可能存活幼蟲(chóng)發(fā)育進(jìn)度造成極大的抑制，都是明顯的發(fā)育不良， 且已停止發(fā)育，很難再對(duì)玉米造成危害，而轉(zhuǎn)基因植物大體上只受到輕微損傷。
[0085] 下面通過(guò)附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0086] 圖1為本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白的用途的含有Cry2Ab核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T 構(gòu)建流程圖；
[0087] 圖2為本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白的用途的含有Cry2Ab核苷酸序列的重組表達(dá)載體 DBN100033構(gòu)建流程圖；
[0088] 圖3為本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白的用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種二點(diǎn)委夜蛾的葉片損傷圖。

【具體實(shí)施方式】
[0089] 下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白的用途的技術(shù)方案。
[0090] 第一實(shí)施例、Cry2Ab基因的獲得和合成
[0091] 1、獲得Cry2Ab核苷酸序列
[0092] Cry2Ab殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列（634個(gè)氨基酸），如序列表中SEQ ID NO: 1所 示；編碼相應(yīng)于所述Cry2Ab殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列的Cry2Ab核苷酸序列（1905個(gè)核苷 酸），如序列表中SEQ ID NO:2所示。
[0093] 2、獲得CrylA. 105核苷酸序列
[0094] 編碼CrylA. 105殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列（1177個(gè)氨基酸）的CrylA. 105核苷酸 序列（3534個(gè)核苷酸），如序列表中SEQ ID NO: 3所示。
[0095] 3、合成上述核苷酸序列
[0096] 所述Cry2Ab核苷酸序列（如序列表中SEQ ID NO: 2所示）和所述CrylA. 105核 苷酸序列（如序列表中SEQ ID N0:3所示）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的 所述Cry2Ab核苷酸序列（SEQ ID N0:2)的5'端還連接有NcoI酶切位點(diǎn)，所述Cry2Ab核 苷酸序列（SEQ ID NO:2)的3'端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)；合成的所述CrylA. 105核苷酸 序列（SEQ ID NO: 3)的5'端還連接有NcoI酶切位點(diǎn)，所述CrylA. 105核苷酸序列（SEQ ID NO: 3)的3'端還連接有HindIII酶切位點(diǎn)。
[0097] 第二實(shí)施例、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0098] 1、構(gòu)建含有Cry2Ab基因的重組克隆載體
[0099] 將合成的Cry2Ab核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega，Madison, USA, CAT : A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，得到重組克隆載體 DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示（其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；Π 表示噬菌體Π 的復(fù)制起點(diǎn)；LacZ為L(zhǎng)acZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動(dòng)子；T7為T(mén)7RNA聚合酶啟 動(dòng)子；Cry2Ab為Cry2Ab核苷酸序列（SEQ ID N0:2) ;MCS為多克隆位點(diǎn)）。
[0100] 然后將重組克隆載體DBN01-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞 (Transgen，Bei jing，China，CAT :CD501)，其熱激條件為：50 μ 1 大腸桿菌 Tl 感受態(tài) 細(xì)胞、1〇μ 1質(zhì)粒DNA(重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37 °C振蕩培養(yǎng)1小 時(shí)（IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng)），在表面涂有IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）和 X-gal (5-溴-4-氯-3- Π 引哚-β -D-半乳糖苷）的氨節(jié)青霉素（100暈克/升）的LB平板 (胰蛋白胨1(^/1，酵母提取物58/1，似(：11(^/1，瓊脂158/1，用似0!1調(diào)？!1至7.5)上生長(zhǎng) 過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨 芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37 °C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒： 將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心lmin，去上清液，沉淀菌體用100 μ 1冰預(yù)冷的溶液I (25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，pH8.0)懸浮；加入200μ 1新配制的溶 液II (0. 2Μ NaOH，1 % SDS (十二烷基硫酸鈉）），將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;力口 入150 μ 1冰冷的溶液III (3M醋酸鉀，5M醋酸），立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度 4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后室溫放置 5min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度（V/V)為70%的 乙醇洗滌后晾干；加入 30μ1 含 RNase (20yg/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl，ImM EDTA，PH8.0) 溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0101] 提取的質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和XhoI酶切鑒定后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明重 組克隆載體DBNOl-T中插入的所述Cry2Ab核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO: 2所示的核 苷酸序列，即Cry2Ab核苷酸序列正確插入。
[0102] 按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBNOl-T的方法，將合成的所述CrylA. 105核苷酸序 列連入克隆載體pGEM-Τ上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，CrylA. 105為CrylA. 105核 苷酸序列（SEQ ID NO: 3)。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體DBN02-T中所述CrylA. 105核苷 酸序列正確插入。
[0103] 2、構(gòu)建含有Cry2Ab基因的重組表達(dá)載體
[0104] 用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和表達(dá)載體 DBNBC-Ol (載體骨架：pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供）），將切下的Cry2Ab核苷酸序列 片段插到表達(dá)載體DBNBC-Ol的NcoI和SpeI位點(diǎn)之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本 領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN100033,其構(gòu)建流程如圖2所示（Kan :卡 那霉素基因 ；RB :右邊界；Ubi :玉米Ubiquitin(泛素）基因啟動(dòng)子（SEQ ID N0:4) ;Cry2Ab : Cry2Ab核苷酸序列（SEQ ID N0:2) ;Nos :胭脂堿合成酶基因的終止子（SEQ ID N0:5) ;PMI : 磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因 （SEQ ID N0:6) ;LB:左邊界）。
[0105] 將重組表達(dá)載體DBN100033用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條 件為：5(^1大腸桿菌11感受態(tài)細(xì)胞、1(^1質(zhì)粒0嫩（重組表達(dá)載體08附00033)，421： 水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)（IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng)）；然后在含50mg/L卡那霉素 (Kanamycin)的LB固體平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L， 用NaOH調(diào)pH至7. 5)上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基 (胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5) 中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和 SpeI酶切后鑒定，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100033在NcoI 和SpeI位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，即Cry2Ab核苷酸 序列。
[0106] 按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100033的方法，將NcoI和SpeI、NcoI和HindIII 分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和DBN02-T切下的所述Cry2Ab核苷酸序列和CrylA. 105 核苷酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-Ol，得到重組表達(dá)載體DBN100076。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組 表達(dá)載體DBN100076中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示核 苷酸序列，即Cry2Ab核苷酸序列和Cry 1A. 105核苷酸序列，所述Cry2Ab核苷酸序列和所述 CrylA. 105核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動(dòng)子和Nos終止子。
[0107] 3、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0108] 對(duì)己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100033和DBN100076用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿 菌 LBA4404(Invitrgen，Chicago, USA，CAT :18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100 μ L 農(nóng)桿菌 LBA4404、3 μ L質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體）；置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化 后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，涂于 含50mg/L的利福平（Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin)的LB平板上直至 長(zhǎng)出陽(yáng)性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶AhdI和XhoI對(duì)重組表達(dá) 載體DBN100033和DBN100076酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100033和 DBN100076結(jié)構(gòu)完全正確。
[0109] 第三實(shí)施例、轉(zhuǎn)入Cry2Ab基因的玉米植株的獲得及驗(yàn)證
[0110] 1、獲得轉(zhuǎn)入Cry2Ab基因的玉米植株
[0111] 按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無(wú)菌培養(yǎng)的玉米品種綜31 (Z31)的幼胚與第 二實(shí)施例中3所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實(shí)施例中2構(gòu)建的重組表達(dá)載體DBN100033 和DBN100076中的T-DNA (包括玉米Ubiquitin基因的啟動(dòng)子序列、Cry2Ab核苷酸序列、 CrylA. 105核苷酸序列、PMI基因和Nos終止子序列）轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入 Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入Cry2Ab-CrylA. 105核苷酸序列的玉米植株；同時(shí)以 野生型玉米植株作為對(duì)照。
[0112] 對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，簡(jiǎn)要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮 液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)ry2Ab核苷酸序列和/或CrylA. 105核苷酸序列傳遞至幼 胚之一的至少一個(gè)細(xì)胞（步驟1 :侵染步驟），在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液 (OD66tl = 0· 4-0. 6,侵染培養(yǎng)基（MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖68. 5g/L、葡 萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D)lmg/L，pH5.3))中以啟動(dòng) 接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)期（3天）（步驟2:共培養(yǎng)步驟）。優(yōu)選地，幼胚在侵染 步驟后在固體培養(yǎng)基（MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖IOg/ L、乙酰丁香酮（AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D)lmg/L、瓊脂 8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)。 在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個(gè)選擇性的"恢復(fù)"步驟。在"恢復(fù)"步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基（MS 鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D) lmg/L、瓊脂 8g/L，pH5. 8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素（頭孢霉素），不添加植物轉(zhuǎn)化 體的選擇劑（步驟3 :恢復(fù)步驟）。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒(méi)有選擇劑的固體培養(yǎng)基上 培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，接種的幼胚在含選擇劑（甘露糖）的 培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長(zhǎng)著的轉(zhuǎn)化愈傷組織（步驟4 :選擇步驟）。優(yōu)選地，幼胚在有選擇 劑的篩選固體培養(yǎng)基（MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12. 5g/ L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D)lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生 長(zhǎng)。然后，愈傷組織再生成植物（步驟5:再生步驟），優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 的愈傷組織在固體培養(yǎng)基（MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基）上培養(yǎng)以再生植物。
[0113] 篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基（MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干 酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，ρΗ5· 8)上，25°C 下培養(yǎng)分化。分化出來(lái)的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基（MS鹽2. 15g/L、MS維他命、干酪 素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、瓊脂8g/L，ρΗ5· 8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm 高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)16小時(shí)，再于20°C下培養(yǎng)8小時(shí)。
[0114] 2、用TaqMan驗(yàn)證轉(zhuǎn)入Cry2Ab基因的玉米植株
[0115] 分別取轉(zhuǎn)入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入Cry2Ab_CrylA. 105核苷酸序列 的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組 DNA，通過(guò)Taqman探針熒光定量PCR方法檢測(cè)Cry2Ab基因和CrylA. 105基因的拷貝數(shù)。同 時(shí)以野生型玉米植株作為對(duì)照，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。
[0116] 檢測(cè)Cry2Ab基因拷貝數(shù)的具體方法如下：
[0117] 步驟11、分別取轉(zhuǎn)入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Cry2Ab_CrylA. 105核苷 酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個(gè) 樣品取3個(gè)重復(fù)；
[0118] 步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具 體方法參考其產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)；
[0119] 步驟13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)測(cè)定上述樣品的基因組DNA濃 度；
[0120] 步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為 80-100ng/μ I ；
[0121] 步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過(guò)鑒定已知 拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型玉米植株的樣品作為對(duì)照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，取其平 均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是：
[0122] 以下引物和探針用來(lái)檢測(cè)Cry2Ab核苷酸序列：
[0123] 引物1(CF1):CTGATACCCTTGCTCGCGTC如序列表中SEQIDN0:7所示 ；
[0124] 引物 2(CR1) :CACTTGGCGGTTGAACTCCTC 如序列表中 SEQ ID N0:8 所示；
[0125] 探針 I(CPl) :CGCTGAGCTGACGGGTCTGCAAG 如序列表中 SEQ ID N0:9 所示；
[0126] 以下引物和探針用來(lái)檢測(cè)CrylA. 105核苷酸序列：
[0127] 引物 3(CF2) :GCGCATCCAGTTCAACGAC 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；
[0128] 引物 4(CR2) :GTTCTGGACGGCGAAGAGTG 如序列表中 SEQ ID N0:11 所示；
[0129] 探針 2 (CP2) :TGAACAGCGCCCTGACCACCG 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；
[0130] PCR反應(yīng)體系為：

【權(quán)利要求】
1. 一種控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，包括將二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)與Cry2Ab蛋 白接觸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白 存在于產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的植物細(xì)胞中，所述二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)通過(guò)攝食所述植物細(xì)胞 與所述Cry2Ab蛋白接觸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白 存在于產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中，所述二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)通過(guò)攝食所述轉(zhuǎn)基因 植物的組織與所述Cry2Ab蛋白接觸，接觸后所述二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)生長(zhǎng)受到抑制和/或?qū)е?死亡，以實(shí)現(xiàn)對(duì)二點(diǎn)委夜蛾危害植物的控制。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物 處于任意生育期。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物 的組織為根、葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述對(duì)二點(diǎn)委夜 蛾危害植物的控制不因種植地點(diǎn)和/或種植時(shí)間的改變而改變。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2至6任一項(xiàng)所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述植 物為玉米、花生或大豆。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2至7任一項(xiàng)所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述接 觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述Cry2Ab蛋白的多核苷酸的植物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述 Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白 的核苷酸序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2至10任一項(xiàng)所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述 植物還可以包含至少一種不同于編碼所述Cry2Ab蛋白的核苷酸的第二種核苷酸。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述第二種核 苷酸編碼Cry類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、Vip類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素 、α -淀粉酶或過(guò)氧 化物酶。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述第二種核 苷酸編碼Cry 1Α. 105蛋白。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述第二種核 苷酸具有SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述第二種核 苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中重要基因的dsRNA。
16. -種Cry2Ab蛋白質(zhì)控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的用途。
17. -種產(chǎn)生控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因 組中引入編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列。
18. -種產(chǎn)生控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的植物種子的方法，其特征在于，包括將由權(quán)利要求 17所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，從而產(chǎn)生含有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸 序列的種子。
19. 一種培養(yǎng)控制二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)的植物的方法，其特征在于，包括： 種植至少一粒植物種子，所述植物種子的基因組中包括編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸 序列； 使所述植物種子長(zhǎng)成植株； 使所述植株在人工接種二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)和/或二點(diǎn)委夜蛾害蟲(chóng)自然發(fā)生危害的條件 下生長(zhǎng)，收獲與其他不具有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的植物 損傷和/或具有增加的植物產(chǎn)量的植株。
【文檔編號(hào)】A01N47/44GK104255771SQ201410429197
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】丁德榮, 陶青, 張欣馨, 楊旭, 康越景 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心