水稻OsSRFP1基因的抗冷性基因工程應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻OsSRFP1基因的抗冷性基因工程應(yīng)用。cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示的E3泛素連接酶基因OsSRFP1的抗冷性基因工程應(yīng)用，抑制所述的E3泛素連接酶基因OsSRFP1的表達(dá)，能夠提高水稻的抗冷性，利于水稻抗逆性遺傳改良。
【專利說明】水稻OsSRFPI基因的抗冷性基因工程應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水稻OsSRFPl基因的抗冷性基因工程應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 蛋白質(zhì)的泛素化修飾在細(xì)胞生命活動(dòng)過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在 植物中參與了植物的生長發(fā)育以及生物脅迫與非生物脅迫的響應(yīng)（Smalle et al.，2004; Vierstra，2009)。三種關(guān)鍵酶共同介導(dǎo)了蛋白質(zhì)的泛素化過程，包括泛素活化酶E1，泛素結(jié) 合酶E2和泛素連接酶E3。E3泛素連接酶可使其對(duì)特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，因此E3是在底 物蛋白的特異性選擇修飾過程中作用最為關(guān)鍵（Mazzucotelli et al.，2006)。E3泛素連 接酶是一個(gè)種類繁多的蛋白大家族，水稻中存在數(shù)百個(gè)不同類型的E3泛素連接酶基因，在 水稻的生命過程中發(fā)揮了重要而廣泛的調(diào)控功能。Song等（Song et al.，2007)克隆和鑒 定了一個(gè)控制水稻谷粒寬度及重量的主效QTL基因-GW2, GW2編碼一個(gè)RING泛素連接酶， gw2突變體增加了細(xì)胞數(shù)量，導(dǎo)致形成較大的小穗外殼，加速了谷物奶狀營養(yǎng)物填充率，形 成增大的谷粒寬度、重量及產(chǎn)量。GW2可能通過降解靶蛋白來負(fù)調(diào)控細(xì)胞分裂。相似的控制 水稻谷粒寬度及重量主效QTL基因 qSW5/GW5,可能在種子發(fā)育過程中通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂參 與泛素-蛋白酶體降解途徑（Shomura et al.，2008 ;Weng et al.，2008)。OsDSGl 為 RING 泛素連接酶，酵母雙雜交檢測證實(shí)OsDSGl與0sABI3互作，缺失OsDSGl的T-DNA突變體種 子延遲萌發(fā)，表明OsDSGl為ΑΒΑ在種子萌發(fā)的主要調(diào)節(jié)因子（Park et al.，2010)。OsBBIl 編碼一個(gè)RING泛素連接酶，通過改變細(xì)胞壁的厚度和次生代謝物來調(diào)控對(duì)稻瘟病菌的抗 性（Li et al·，2011)。Park 等（Park et al·，2012)證實(shí)稻癌病菌通過 AvrPiz-t 抑制水稻 RING泛素連接酶APIP6介導(dǎo)的針對(duì)病原體的免疫防衛(wèi)反應(yīng)。蛋白互作檢測表明AvrPiz-t 抑制APIP6的泛素連接酶活性，而APIP6能泛素化AvrPiz-t。在抗白葉枯病研究中，Wang 等（Wang et al.，2006)分離和鑒定了水稻抗白葉枯病基因 Xa21產(chǎn)物的互作蛋白XB3。XB3 編碼一個(gè)450個(gè)氨基酸、含有RING鋅指結(jié)構(gòu)域的泛素連接酶，作為XA21的蛋白激酶底物。
[0003] 在響應(yīng)非生物脅迫應(yīng)答中，也發(fā)現(xiàn)了一些E3泛素連接酶調(diào)控植物的逆境響應(yīng)。 OsDISl編碼一個(gè)RING泛素連接酶，OsDISl表達(dá)受干旱上調(diào)，超表達(dá)OsDISl的轉(zhuǎn)基因水稻 植株減少了干旱耐性，而RNA沉默OsDISl的轉(zhuǎn)基因植株增加了干旱耐性。OsDISl可能通過 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)逆境相關(guān)基因及蛋白泛素化修飾負(fù)調(diào)控水稻干旱耐性。OsSDIRl為一個(gè)RING泛素 連接酶（Gao et al.，2011)，OsSDIRl表達(dá)受干旱和鹽誘導(dǎo)，包含OsSDIRl的轉(zhuǎn)基因水稻植 株比對(duì)照植株表現(xiàn)更強(qiáng)的干旱耐性。與此相似，包含超表達(dá)RING泛素連接酶基因 OsRDCPl 和OsCTRl的轉(zhuǎn)基因水稻植株增加了干旱耐性（Bae et al.，2011;Lim et al.，2014)，而過 表達(dá)OsHCll的轉(zhuǎn)基因植株增強(qiáng)了高溫耐性（Lim et al.，2013)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于公開水稻RING環(huán)型E3泛素連接酶基因 OsSRFPl基因的抗冷性 基因工程應(yīng)用，抑制表達(dá)該基因可以提高植物的抗冷性，利于水稻抗逆性遺傳改良。
[0005] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示的E3泛素連接酶基因 OsSRFPl的抗冷性基因工程 應(yīng)用，其特征在于抑制所述的E3泛素連接酶基因 OsSRFPl的表達(dá)，能夠提高水稻的抗冷性。
[0007] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，優(yōu)選將針對(duì)E3泛素連接酶基因 OsSRFPl的RNAi載體導(dǎo)入水 稻，能夠提高水稻的抗冷性。
[0008] 所述的針對(duì)E3泛素連接酶基因 OsSRFPl的RNAi載體通過以下方法構(gòu) 建：選取了 OsSRFPl基因中位于SEQ ID NO. 1的第518到730位，長度為213bp 的特異核苷酸序列作為干涉載體插入?yún)^(qū)段，以質(zhì)粒pMD18T-〇sSRFPl的DNA為 摸板利用引物 RNAi-ZFIPlFl:GGATCCTCGATGCCTATCTTTGACA(SEQ ID N0.8)、 RNAi-ZFIPIRl:GGTACCAGCAGGGAGCACCGGGGCA(SEQ ID Ν0·9)通過 BamH I 和Κρη I酶切位點(diǎn)將該序列反向插入PTCK303植物干涉表達(dá)載體，同時(shí)利用引 物 RNAi-ZFIPlF2:GAGCTCTCGATGCCTATCTTTGACA(SEQ ID N0.10)、RNAi-ZFIPlR2: ACTAGTAGCAGGGAGCACCGGGGCA(SEQ ID NO. 11)以質(zhì)粒 pMD18T-〇sSRFPl 的 DNA 為摸板通過 Sac I和Spe I酶切位點(diǎn)將該序列正向插入pTCK303植物干涉表達(dá)載體，從而獲得該基因 的干涉表達(dá)載體。
[0009] 有益效果
[0010] 1、本發(fā)明公開了一種抑制表達(dá)水稻OsSRFPl基因的抗冷性基因工程應(yīng)用。該基因 來自水稻（Oryza sativa L.)，抑制表達(dá)該基因可以提高水稻的抗冷性，利于水稻抗逆性遺 傳改良。
[0011] 2、本發(fā)明人提供的OsSRFPl基因功能是參與植物的抗冷應(yīng)答反應(yīng)，定量反轉(zhuǎn)錄聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time RT-PCR)分析表明OsSRFPl基因在高鹽（100mM NaCl)、冷（4°C )、 氧化脅迫（100mM H202)和脫落酸（ΑΒΑ)誘導(dǎo)條件下表達(dá)增強(qiáng)。
[0012] 3、利用本發(fā)明OsSRFPl基因作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，其中可用任何一種 啟動(dòng)子例如花椰菜花葉病毒（CAMV)35S啟動(dòng)子、Ubiquitin啟動(dòng)子、Actin啟動(dòng)子或其它 啟動(dòng)子，該表達(dá)載體中必要時(shí)可包括增強(qiáng)子，不論是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子。為了降低 OsSRFPl基因的表達(dá)量，可以采用RNA干涉、microRNA定向調(diào)控或者TALEN技術(shù)、CRISPR技 術(shù)降低或者阻斷OsSRFPl基因的表達(dá)，從而達(dá)到提高水稻抗逆性的功能。為了簡化轉(zhuǎn)化細(xì) 胞的鑒定可使用選擇性標(biāo)記包括對(duì)抗生素抗性的酶，對(duì)除草劑具有抗性的酶，也可利用顏 色變化（例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發(fā)光（例如熒光素酶）來識(shí)別的化合物的酶類， 也可用無標(biāo)記選擇。所用的表達(dá)載體可使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體等。轉(zhuǎn)化方法 可用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法或其它方法轉(zhuǎn)化植物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖lpCAMBIA1304-0sSRFPl轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建
[0014] A.載體pCAMBIA1304示意圖；B. 1:通過Nco I和BstP I雙酶切重組質(zhì)粒 pCAMBIA1304-0sSRFPl 的瓊脂糖電泳圖，M:DNA marker DL2000 plus.
[0015] 圖2重組質(zhì)粒pTCK303-0sSRFPl的構(gòu)建
[0016] A.載體pTCK303-0sSRFPl示意圖；B.重組質(zhì)粒pTCK303-0sSRFPl雙酶切的瓊脂 糖電泳圖，1:通過BamH I和Κρη I雙酶切重組質(zhì)粒pTCK303-0sSRFPl的瓊脂糖電泳圖， 2:通過Sac I和Spe I雙酶切重組質(zhì)粒pTCK303-0sSRFPl的瓊脂糖電泳圖，M:DNA marker DL2000 plus.
[0017] 圖30sSRFPl過量及干涉抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株的鑒定
[0018] (A) qRT-PCR 鑒定 OsSRFPl 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。（B) qRT-PCR 鑒定 OsSRFPl-RNAi 干 涉抑制轉(zhuǎn)基因株系。橫軸是株系名，縱軸是表達(dá)量。
[0019] 圖4、抑制表達(dá)水稻OsSRFPl基因提高轉(zhuǎn)基因水稻的耐冷性。
[0020] (A)4葉期陽性O(shè)sSRFPl過表達(dá)、RNAi干涉抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和對(duì)照植株 (WT)4°C冷處理表型圖，經(jīng)室溫恢復(fù)后存活率顯著優(yōu)于對(duì)照組的株系即為耐冷性增強(qiáng)的水 稻轉(zhuǎn)基因株系。（B)4°C冷處理后轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系的存活率統(tǒng)計(jì)。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 選用水稻品種"中花11"，待水稻幼苗長至3葉期后，用4°C進(jìn)行處理，6小時(shí)后 立即取葉片置于液氮中冷凍保存，取部分葉片，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP 管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)，勻漿后移至1. 5mL EP管中，抽提總RNA，用甲醛 變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測定RNA含量。以獲得的總RNA為模 板，按照美國Promega公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一 鏈。設(shè)計(jì)兩端引物：上游引物：F1 :ATGGAGCTCGACGACGCG(SEQ ID N0. 2);下游引物：R1 : TTAAGCAGGGAGCACCGG (SEQ ID NO. 3)，采用 RT-PCR 方法進(jìn)行 cDNA 克隆。PCR 擴(kuò)增使用 Primestar HS DNA 聚合酶（Takara, Dalian, China)。PCR 程序如下：98°C預(yù)變性 5 分鐘， 98°C變性5s，58°C復(fù)性10s，72°C延伸50s，30個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，將PCR產(chǎn)物加入普通 Tag酶30min，克隆至pMD18-T載體，獲得質(zhì)粒pMD18T-〇sSRFPl，測序后獲得具有完整編碼 區(qū)的水稻E3泛素連接酶基因 OsSRFPl的cDNA序列SEQ ID N0. 1。
[0023] OsSRFPl的0RF全長783bp，BioXM軟件分析表明OsSRFPl共編碼260個(gè)氨基酸， 使用BioXM軟件（版本2. 6)估算其等電點(diǎn)pi = 6. 87,分子量MW = 29. 86KDa。以O(shè)sSRFPl 搜索GenBank中現(xiàn)有水稻基因組（包括粳稻和秈稻）數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)OsSRFPl為單拷貝基因。
[0024] 實(shí)施例2
[0025] 設(shè)計(jì)引物（上游引物：F2 :AGATGCTGAAGCACGACAAGTTC(SEQ ID N0. 4)，下游引物： R2 :AGTCGTTGCACACGATCCATCC (SEQ ID NO. 5))，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 分析 OsSRFPl 基因在 水稻幼苗中的表達(dá)，以水稻actin基因 Racl(McElroy et al，1990)的表達(dá)為內(nèi)參，結(jié)果表 明，OsSRFPl基因的表達(dá)在4°C處理6h后顯著增強(qiáng)，其表達(dá)量約為對(duì)照的8倍；OsSRFPl基 因的表達(dá)在100mM NaCl處理6h后顯著增強(qiáng)，其表達(dá)量約為對(duì)照的4倍；OsSRFPl基因的表 達(dá)在100mM H202處理lh后即表達(dá)量增加，6h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，其表達(dá)量約為對(duì)照的10 倍；在脫落酸ΑΒΑ處理?xiàng)l件下，OsSRFPl基因的表達(dá)在lh處理后即表達(dá)量增加，12h時(shí)表達(dá) 量達(dá)到最高，其表達(dá)量約為對(duì)照的8倍。本發(fā)明的水稻OsSRFPl基因?yàn)樗局械氖状螆?bào)道， 有望應(yīng)用于植物尤其是單子葉植物的抗冷性遺傳改良。
[0026] 實(shí)施例3
[0027] 根據(jù)水稻OsSRFPl基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并 在上游引物上引入Nco I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物引入了 BstP I限制性內(nèi)切酶 位點(diǎn)：上游引物：0sSRFP10E-F :CCATGGAGCTCGACGACGCGTCTC(SEQ ID NO. 6)，下游引物： 0sSRFP10E-R :GGTGACCTTAAGCAGGGAGCACCG(SEQ ID NO. 7)，以實(shí)施例 1 中獲得的 PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將OsSRFPl的cDNA克隆至中間載體pMD18-T，通過Nco I和BstP I酶切位點(diǎn)進(jìn)一步克隆到植物雙元表達(dá)載體pCambial304 (圖1)，獲得OsSRFPl基因過表達(dá) 載體 pCAMBIA1304-0sSRFPl。
[0028] 同時(shí)利用在線RNAi革巴定位點(diǎn)預(yù)測軟件（http://bioinfo· clontech. com/ rnaidesigner ；http://www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder. htmL), 選取 了 OsSRFPl基因中位于SEQ ID NO. 1的自5'端起第518bp到730bp長度為213bp的 特異核苷酸序列作為干涉載體插入?yún)^(qū)段，以質(zhì)粒pMD18T-〇sSRFPl的DNA為模板，利 用引物 RNAi-ZFIPlFl:GGATCCTCGATGCCTATCTTTGACA(SEQ ID N0.8)、RNAi-ZFIPlRl: GGTACCAGCAGGGAGCACCGGGGCA (SEQ ID NO. 9)通過 BamH I 和 Κρη I 酶切位點(diǎn)將該序列 反向插入PTCK303植物干涉表達(dá)載體，同時(shí)以質(zhì)粒pMD18T-〇sSRFPl的DNA為模板，利 用引物 RNAi-ZFIPlF2:GAGCTCTCGATGCCTATCTTTGACA(SEQ ID N0.10)、RNAi-ZFIPlR2: ACTAGTAGCAGGGAGCACCGGGGCA(SEQ IDNO. 11)通過 Sac I 和 Spe I 酶切位點(diǎn)將該序列正 向插入PTCK303植物干涉表達(dá)載體，從而獲得該基因的干涉表達(dá)載體pTCK303-0sSRFPl (圖 2)。
[0029] 將獲得的OsSRFPl過表達(dá)和RNAi干涉抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入水 稻，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR，以及RT-PCR驗(yàn)證：
[0030] 取轉(zhuǎn)基因水稻葉片，提取總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。用OsSRFPl基因 qRT-PCR特異引 物 F3:AGATGCTGAAGCACGACAAGTTC(SEQ ID N0.12)、R3:AGTCGTTGCACACGATCCATCC(SEQ ID N0·13)及內(nèi)參18srRNA基因引物18srRNA-F:ATGGTGGTGACGGGTGAC(SEQIDN0·14)、18sr RNA-R:AGTCGTTGCACACGATCCATCC(SEQ ID NO. 15)對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行 qRT-PCR 驗(yàn)證（圖 3)。
[0031] 經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證后進(jìn)行植物的耐逆性評(píng)價(jià)，轉(zhuǎn)基因植株的T3代和對(duì)照植株進(jìn)行耐 冷性分析：取轉(zhuǎn)基因水稻種子和野生型種子，30°C浸種直至露白，然后將發(fā)芽一致的18粒 種子分別播于蛭石與營養(yǎng)土 2:1的混合基質(zhì)中，培養(yǎng)4周后，置于4°C光照培養(yǎng)箱中處理， 當(dāng)表型出現(xiàn)明顯差異時(shí)，室溫恢復(fù)5d，統(tǒng)計(jì)存活率，電解質(zhì)滲透率。轉(zhuǎn)基因植株和野生型水 稻幼苗的低溫處理結(jié)果顯示，35S:0sSRFPl轉(zhuǎn)基因水稻植株（即轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-0sSRFPl 載體的轉(zhuǎn)基因植株）相對(duì)于WT對(duì)低溫更敏感，而35S:0sSRFPl-RNAi轉(zhuǎn)基因株系（即轉(zhuǎn) pTCK303-0sSRFPl載體的轉(zhuǎn)基因植株）更抗低溫（圖4)。存活率統(tǒng)計(jì)顯示，冷處理3天恢 復(fù)后，相對(duì)于75%的野生型存活率，只有16%的35S:0sSRFPl轉(zhuǎn)基因水稻植株植株可以存 活；而冷處理7天恢復(fù)后，相對(duì)于20%的野生型存活率，85%的OsSRFPl-RNAi植株能快速 恢復(fù)正常生長（圖4)。隨著冷脅迫處理的進(jìn)行，分別取處理0h、5h、24h的樣進(jìn)行電解質(zhì)滲 透率的測定，結(jié)果顯示過表達(dá)株系的電解質(zhì)滲透率明顯大于野生型，而干涉抑制表達(dá)株系 的電解質(zhì)滲透率明顯小于野生型（圖4)，說明水稻植株在冷脅迫處理時(shí)，干涉抑制OsSRFPl 表達(dá)能更好的保持細(xì)胞膜的完整性，增強(qiáng)植株的抗性。以上結(jié)果表明OsSRFPl負(fù)調(diào)控水稻 中冷響應(yīng)過程。
[0032] 上述實(shí)施例表明本發(fā)明中克隆的水稻E3泛素連接酶基因 OsSRFPl，為水稻中首次 克隆的E3泛素連接酶基因。實(shí)施例2表明該基因與水稻的非生物脅迫密切相關(guān)。實(shí)施例 3表明抑制表達(dá)該基因后能夠提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗冷性，可以通過RNAi，microRNA調(diào)控、 TALEN或CRISPR等技術(shù)培養(yǎng)抑制或阻斷表達(dá)OsSRFPl基因的水稻轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行水稻的 抗冷性遺傳改良。
【權(quán)利要求】
1. cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示的E3泛素連接酶基因 OsSRFPl的抗冷性基因工程應(yīng) 用，其特征在于抑制所述的E3泛素連接酶基因 OsSRFPl的表達(dá)，能夠提高水稻的抗冷性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于將針對(duì)E3泛素連接酶基因 OsSRFPl的RNAi 載體導(dǎo)入水稻，抑制所述的E3泛素連接酶基因 OsSRFPl的表達(dá)，能夠提高水稻的抗冷性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的針對(duì)E3泛素連接酶基因 OsSRFPl 的RNAi載體通過以下方法構(gòu)建：選取了 OsSRFPl基因中位于SEQ ID NO. 1的第518到730 位，長度為213bp的特異核苷酸序列作為干涉載體插入?yún)^(qū)段，以質(zhì)粒pMD18T-〇sSRFPl的DNA 為模板，利用引物 RNAi-ZFIPIFl :SEQ ID NO. 8、RNAi-ZFIPIRl :SEQ ID NO. 9 進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 增，通過BamH I和Κρη I酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增的目的片段反向插入pTCK303植物干涉表達(dá)載 體；同時(shí)以質(zhì)粒 pMD18T-〇sSRFPl 的 DNA 為模板，利用引物 RNAi-ZFIPlF2 :SEQ ID NO. 10、 RNAi-ZFIPlR2 :SEQ ID NO. 11進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Sac I和Spe I酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增的目 的片段正向插入PTCK303植物干涉表達(dá)載體，從而獲得該基因的干涉表達(dá)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的質(zhì)粒pMD18T-〇sSRFPl通過以下方法 獲得： 1) 選用水稻品種"中花11"，待水稻幼苗長至3葉期后，用4°C進(jìn)行處理，5?8小時(shí)后 立即取葉片抽提總RNA，以獲得的總RNA為模板，按照美國Promega公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑 盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈； 2) 以上一步合成的cDNA第一鏈為模板，以引物F1:SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 2和引 物F2 :SEQ ID NO. 3通過PCR擴(kuò)增獲得E3泛素連接酶基因 OsSRFPlI的cDNA，將其克隆至 PMD18-T 載體，獲得質(zhì)粒 pMD18T-〇sSRFPl。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104195168SQ201410444392
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】黃驥, 張紅生, 方慧敏, 唐海娟, 鮑永美, 王州飛 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)