一種高效解磷菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種自主篩選的高效解磷細(xì)菌及其菌劑的制備方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該解磷細(xì)菌菌株被命名為Bacillus subtilis JT-1，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，已經(jīng)于2014年8月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC M 2014367。該解磷菌能夠?qū)㈦y溶性無機(jī)磷轉(zhuǎn)化為可供植物直接吸收利用的優(yōu)質(zhì)磷素化合物，可提高土壤中難溶性磷的生物有效性和磷肥利用效率，節(jié)肥增產(chǎn)，且在培育和發(fā)揮土壤生態(tài)肥力、保持農(nóng)業(yè)生態(tài)平衡方面具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。CCTCC M 20143672014.08.05
【專利說明】一種高效解磷菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效解磷菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 磷是植物生長發(fā)育不可缺少的大量元素之一，是植物的重要組成成分，并以多種 方式參與植物體內(nèi)各種生理生化過程，對促進(jìn)植物的生長發(fā)育和新陳代謝起著重要的作 用，但是土壤中的磷絕大部分不能被植物直接吸收。據(jù)調(diào)查，中國有74%的耕地土壤缺磷， 土壤中95%的磷為無效形式，植物很難吸收利用，其中難溶性有機(jī)磷一般占土壤全磷的 20% -50%，占難溶性土壤磷總量的10% -85%。施入的磷肥本季節(jié)利用效率為5% -25%， 大部分磷與土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+結(jié)合形成難溶性磷酸鹽。大量使用化肥明顯造成土壤 板結(jié)、土壤保水力下降、草地退化、荒漠化嚴(yán)重等不良后果。因此，提高磷的利用率一直是農(nóng) 學(xué)、土壤學(xué)、生態(tài)環(huán)境和微生物學(xué)研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。
[0003] 解磷微生物是土壤中能夠?qū)o效磷轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的有效磷的一類特 殊微生物功能群體，在自然及農(nóng)業(yè)生態(tài)的磷素生物地化循環(huán)中起到了關(guān)鍵作用。解磷細(xì)菌 是解磷微生物中重要的一類，通過活化土壤磷元素或影響植物根系分泌物的種類和數(shù)量， 增加植物根系對K、Ca、Mg、Fe、Zn等營養(yǎng)元素的吸收，從而促進(jìn)植物的生長發(fā)育。解磷細(xì)菌 還通過分泌各種酶類或有機(jī)酸來活化土壤中的難溶態(tài)磷，并影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)。 大量研究表明，施用含有高效解磷細(xì)菌的微生物菌劑能顯著促進(jìn)植物生長、改善植株根際 環(huán)境。因此，高效解磷微生物的篩選及其制備對于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有降解土壤難溶無機(jī)磷，為植物提供可 以直接吸收的優(yōu)質(zhì)磷素的一種高效解磷菌Bacillus subtilis JT-I。
[0005] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述高效解磷菌的應(yīng)用。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種高效解磷菌，其分類命名為Bacillus subtilis JT-1，保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心（簡稱CCTCC)，保藏地址：武漢武漢大學(xué)，郵編：430072。菌種保藏號(hào)為CCTCC M 2014367,保藏日期為2014年8月5日。是發(fā)明人于湖北省宜昌杉樹埡磷礦地區(qū)的磷礦 土樣中選育的菌株。
[0008] 菌株JT-I具有下述性質(zhì)：
[0009] 1、菌落形態(tài)學(xué)特征：
[0010] 在蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上30°c培養(yǎng)2?3天后顯微鏡觀察到營養(yǎng)細(xì)胞為單細(xì)胞，桿 狀，0. 5?3X0. 5?3μ--，有橢圓形芽孢。在上述培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)12h菌體可以大量生 長。菌落呈白色，圓形，表面光滑，粘狀，中間凸起。
[0011] 2、生理與生化特性：
[0012] (1)培養(yǎng)溫度：25?38°C，最適溫度為30-32°C ;
[0013] (2)在ρΗ5·0?9.0范圍內(nèi)生長；
[0014] (3)革蘭氏染色：陽性；
[0015] ⑷VP反應(yīng)：陽性；
[0016] (5)淀粉水解試驗(yàn)：陽性；
[0017] (6)硝酸鹽還原反應(yīng)：陽性；
[0018] (7)檸檬酸利用：陽性；
[0019] (8)明膠液化：陽性；
[0020] (9)苯丙酸脫氨酶試驗(yàn)：陰性；
[0021] (IO)ER.:陰性；
[0022] (11)脲酶試驗(yàn)：陰性；
[0023] (12)丙酸鹽利用：陰性；
[0024] 3、1防rDNA序列分析：
[0025] 測得16S rDNA大部分序列1418bp，如SEQ ID No :1所示。將所測序列從GeneBank 數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)種進(jìn)行比較，構(gòu)建16S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：菌 株與枯草芽孢桿菌達(dá)到100%同源。所以認(rèn)定本發(fā)明使用的是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，具體為枯草芽抱桿菌 Bacillus subtilis JT-1。
[0026] 上述高效解磷菌在土壤解磷中的應(yīng)用。
[0027] 上述高效解磷菌可與有機(jī)肥混合使用，也可以單獨(dú)使用，改善根際微生物環(huán)境，促 進(jìn)植物生長，減少化肥用量。
[0028] 將高效解磷菌按如下方法制備成菌劑用于土壤的解磷：
[0029] 將斜面保存的解磷菌活化,接種于活化培養(yǎng)基上,培養(yǎng)18?24h ;挑取活化培養(yǎng)基 上的菌種，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30?35°C,培養(yǎng)12?24h，得發(fā)酵液用于土壤的解磷，或者 將發(fā)酵液進(jìn)行干燥處理得到干燥物用于土壤的解磷。
[0030] 其中，所述的活化培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：碳源IO-IOOg/ L，氮源 l_40g/L，無機(jī)鹽 0· 01-50g/L，溶劑為水，pH5. 0 ?9. 0。
[0031] 其中，所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、檸檬酸、甘油、 淀粉和糖蜜中的任意一種或幾種的組合；所述的氮源為酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉 米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH 4) 2S04、NH4C1、(NH4)2HPOjP NH4NO3中的任意一種或幾種的 組合；所述的無機(jī)鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽、磷酸氫二鹽和鹽酸鹽中的一種或幾種 的組合。
[0032] 上述高效解磷菌制備成顆粒劑、粉劑、溶液、懸浮液或棒劑用于土壤解磷。
[0033] 本發(fā)明的高效解磷菌在30°C，150rpm條件下振蕩培養(yǎng)7d，可將5. Og/L Ca3(PO4)2 解磷，水溶性磷含量為682. 43-725. 28mg/L。
[0034] 有益效果：本發(fā)明的高效解磷菌及其制備得到的菌劑具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0035] 1.本發(fā)明從土壤中篩選出具有降解難溶性無機(jī)磷（如Ca2+、Fe2+、Fe 3+、Al3+等離 子結(jié)合形成難溶性磷酸鹽）的解磷菌Bacillus subtilis JT-1，并以解磷菌Bacillus subtilis JT-I為菌種發(fā)酵培養(yǎng)制備得到解磷菌劑，該解磷菌及其菌劑能夠?qū)㈦y溶性無機(jī) 磷轉(zhuǎn)化為可供植物直接吸收利用的優(yōu)質(zhì)磷素化合物，可提高土壤中難溶性磷的生物有效性 和磷肥利用效率，節(jié)肥增產(chǎn)，而且可改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，對充分發(fā)揮土壤 生態(tài)肥力、保持農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的平衡等均具有極其重要意義和應(yīng)用價(jià)值。
[0036] 2.本發(fā)明提供的解磷菌及其菌劑，不僅能增加土壤中的有效磷，而且能促進(jìn)植物 對其他營養(yǎng)元素的吸收，解磷菌可以吸附植物根系周圍的鋅、銅、鈣等營養(yǎng)元素，改善植物 營養(yǎng)；而且還可分泌生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)根系生長；并且解磷菌接種后，在植物根際大量生 長繁殖，在一段時(shí)間內(nèi)成為植物根際的優(yōu)勢菌，從而可抑制或減少病原微生物的繁殖機(jī)會(huì)， 提高植物的抗病能力。
[0037] 3.本發(fā)明提供的解磷菌劑可將土壤中難溶性無機(jī)磷降解為植物可以利用的可溶 性無機(jī)磷，向土壤中直接釋放優(yōu)質(zhì)磷肥料，故不存在生產(chǎn)過程中向環(huán)境排放污染物，解磷微 生物是一種真正意義上的環(huán)保型肥料；且本發(fā)明提供的解磷菌劑的制備方法，生產(chǎn)工藝簡 單，生產(chǎn)效率高，能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，具有良好的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)和社會(huì)效應(yīng)。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價(jià)形 式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0039] 實(shí)施例1 :
[0040] 按如下步驟制備本發(fā)明所述解磷菌劑：
[0041] 將4°C斜面保存的解磷菌Bacillus subtilis JT-I活化，接種于爺形培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 基（即活化培養(yǎng)基）上，培養(yǎng)18-24h。將長好的菌種轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30-35°C，培養(yǎng) 12-24h，得發(fā)酵液或發(fā)酵液干燥物，菌劑中的菌體數(shù)量可達(dá)到I X 101(l-9 X 1012CFU/g。
[0042] 所述茄形培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葡萄糖10g/L， (NH 4) 2S040. 5g/L，NaClO. 3g/L，MnSO4 · 4Η200· 03g/L，KH2P04lg/L，pH 為 6. 0-8. 0。
[0043] 以上所述的生產(chǎn)罐的發(fā)酵培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為0. 6-0. 8vvm，攪拌速度 為 180_200rpm。
[0044] 實(shí)施例2 :菌株的解磷能力測定。
[0045] 在500mL三角瓶中分別加入IOOmL無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為葡萄糖IOg/ L, (NH4) 2S04lg/L, MgSO4 · 7H200. 3g/L, NaClO. 3g/L, FeSO4 · 7H200. 03g/L, MnSO4 · 4H200. 03g/ L，Ca3 (PO4) 25. Og/L。再接種ImL菌懸液，同時(shí)做不接種對照（培養(yǎng)基中加入ImL無菌水）， 所有處理進(jìn)行3次重復(fù)。在30°C，150rpm分別振蕩培養(yǎng)7d，將培養(yǎng)液在6000rpm下離心 20min，通過鑰銻抗比色法測定解磷量（水溶性磷含量）為682. 43-725. 28mg/L，解磷率為 68. 2% -72. 5%。解磷菌JT-I具有較高的解磷能力。
[0046] 實(shí)施例3 :解磷菌劑可以提高農(nóng)作物產(chǎn)量。
[0047] 解磷菌劑的發(fā)酵制備基本同實(shí)施例1。
[0048] 以小區(qū)水稻為實(shí)驗(yàn)對象，試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理，不加解磷菌劑（Tl)和施加解磷菌劑 (T2)菌劑用量為30kg/hm 2,每個(gè)處理3次重復(fù)，小區(qū)長8m，寬3m，小區(qū)面積24m2,小區(qū)四周 設(shè)置保護(hù)行，2個(gè)處理除施加解磷菌劑不同外，其余施肥、澆水等管理措施均相同。
[0049] 表1.各處理對水稻的產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種高效解磷菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，菌株號(hào)為 JT-1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號(hào)為CCTCC Μ 2014367,保藏日期為2014 年8月5日。
2. 權(quán)利要求1所述的高效解磷菌在土壤解磷中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將高效解磷菌按如下方法制備成菌劑用 于土壤的解磷： 將斜面保存的解磷菌活化，接種于活化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18?24h ;挑取活化培養(yǎng)基上的 菌種，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30?35°C,培養(yǎng)12?24h，得發(fā)酵液用于土壤的解磷，或者將發(fā) 酵液進(jìn)行干燥處理得到干燥物用于土壤的解磷。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的活化培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，所述的 發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：碳源l〇-l〇〇g/L，氮源l-40g/L，無機(jī)鹽0. 01-50g/L，溶劑為水，pH5. 0? 9. 0 〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、 乳糖、木糖、果糖、乳酸、檸檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一種或幾種的組合；所述的氮 源為酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、（NH 4)2S04、NH4C1、 (冊14)2即04和ΝΗ4Ν03中的任意一種或幾種的組合；所述的無 機(jī)鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二 氫鹽、磷酸氫二鹽和鹽酸鹽中的一種或幾種的組合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，高效解磷菌制備成顆粒劑、粉劑、溶液、懸 浮液或棒劑用于土壤解磷。
7. 權(quán)利要求1所述的高效解磷菌在促進(jìn)植物生長、減少化肥用量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C05F11/08GK104263679SQ201410445552
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】徐虹, 馮小海, 殷文鋒, 許宗奇, 李莎 申請人:南京聚肽高科農(nóng)業(yè)有限公司