一種凍存液及其用途和保藏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種本發(fā)明提供了一種用于保藏干細(xì)胞的凍存液，該凍存液由二甲基亞砜和生長培養(yǎng)基混合得到，所述生長培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑含有抗人血管內(nèi)皮生長因子的抗體、抗人類表皮生長因子受體1的抗體、抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽。本發(fā)明還提供了所述的生長培養(yǎng)基在保藏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的用途。本發(fā)明還提供了一種保藏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法包括：將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮于如上所述的凍存液中，然后在零下200℃至零下70℃的溫度中保藏。通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠大幅度地提升保藏后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外的擴增能力。
【專利說明】一種凍存液及其用途和保藏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種用于保藏干細(xì)胞的凍存液、該凍 存液的用途和保藏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力及多向分化潛能的未分化或低分化的細(xì)胞。在一 定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能分為三類：全能干細(xì)胞、多 能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞。
[0003] 間充質(zhì)干細(xì)胞以一種多能干細(xì)胞，是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的 中胚層和外胚層。間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫 調(diào)控和自我復(fù)制等特點而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo) 條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連 續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引 起的組織器官損傷修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞由于其來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，并且具有較強的分 化潛能和可自體移植等優(yōu)點，具有較高的臨床應(yīng)用價值。
[0004] 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多能干細(xì)胞。從人臍帶中 分離出的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，其細(xì)胞含量和增殖能力均優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并且免疫 原性比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞低，此外還具有取材方便，無倫理學(xué)爭議等優(yōu)點，因此在間充質(zhì)干 細(xì)胞中具有更高的臨床應(yīng)用價值。
[0005] 在實際臨床應(yīng)用中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的足夠數(shù)量是保證干細(xì)胞治療的必要因 素。在體外對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴增是增加臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量的必要途徑。但 是，目前臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞只能在體外傳代15-20代，并且傳代后3天以上才能達(dá)到80%以 上的融合度，此外在傳代15代以后還會出現(xiàn)丟失分化潛能的現(xiàn)象。因此，現(xiàn)有的培養(yǎng)臍帶 間充質(zhì)干細(xì)胞的方法存在擴增能力差的缺陷。此外，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在凍存以后，擴增能 力會出現(xiàn)下降。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在凍存以后，擴增能力會出現(xiàn)下降的缺 陷，提供一種用于保藏干細(xì)胞的凍存液、該凍存液的用途和保藏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加特定的抗體和ATP，能夠大幅度地 提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴增能力，并且，在凍存液中也添加特定的抗體和ATP，能夠大幅 度地提高凍存后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴增能力，由此得到了本發(fā)明。
[0008] 一方面，本發(fā)明提供了一種用于保藏干細(xì)胞的凍存液，該凍存液由二甲基亞砜和 生長培養(yǎng)基混合得到，二甲基亞砜和所述生長培養(yǎng)基的體積比為（0.05-0.4) : 1;所述生 長培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑含有抗人血管內(nèi)皮生長因子的抗體、抗人 類表皮生長因子受體1的抗體、抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉 鹽。
[0009] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種保藏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法包括：將 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮于如上所述的凍存液中，然后在零下200°C至零下70°C的溫度中保 藏。
[0010] 再一方面，本發(fā)明還提供了如上所述的凍存液在保藏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的用 途。
[0011] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠大幅度地提升凍存后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外 的擴增能力。例如，本發(fā)明能夠?qū)龃婧蟮哪殠чg充質(zhì)干細(xì)胞的體外傳代數(shù)提高到25-40 代，并且傳代后40-60小時內(nèi)能達(dá)到80%以上的融合度，此外在傳代20代以后也不會出現(xiàn) 丟失分化潛能的現(xiàn)象。
[0012] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細(xì)說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 附圖是用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0014] 圖1是測試實施例1中不同的生長培養(yǎng)基中生長的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線 圖。圖1中，1和2表示制備實施例1和2,3-6分別表示制備對比例1-4,橫坐標(biāo)表示生長 時間，縱坐標(biāo)表示550nm處測定各孔吸光光度值（D值）。

【具體實施方式】
[0015] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描 述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0016] 在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，使用的液體的體積數(shù)值為20°C下的數(shù)值； 使用的氣體的體積數(shù)值為20°C和1個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下的數(shù)值。
[0017] 本發(fā)明提供了一種用于保藏干細(xì)胞的凍存液，該凍存液由二甲基亞砜和生長培養(yǎng) 基混合得到，二甲基亞砜和所述生長培養(yǎng)基的體積比為（0.05-0.4) : 1;所述生長培養(yǎng)基 含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑含有抗人血管內(nèi)皮生長因子的抗體、抗人類表皮生 長因子受體1的抗體、抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明提供的凍存液，其中，人血管內(nèi)皮生長因子（human vascular endothelial growth factor，hVEGF)是指 NCBI 中基因登記號（NCBI Gene ID)為 7422 的基因的翻譯產(chǎn)物，其官方全稱（Official Full Name)為血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)，其常見的別稱還包括 VPF、VEGF 或 MVCD1。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明提供的凍存液，其中，人類表皮生長因子受體I (human epidermal growth factor receptorl，HERl)是指 NCBI 中基因登記號（NCBI Gene ID)為 1956 的基 因的翻譯產(chǎn)物，其官方全稱（Official Full Name)為表皮生長因子受體（epidermal growth factor rec印tor，EGFR)，其常見的別稱還包括 EGFR、ERBB、mENA、ERBBl 或 PIG61。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明提供的凍存液，其中，人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor rec印tor2, HER2)是指 NCBI 中基因登記號（NCBI Gene ID)為 2064 的基 因的翻譯產(chǎn)物，其官方全稱（Official Full Name)為v-erb-b2鳥成紅細(xì)胞白血病病毒癌基 因同源體 2 (v-erb_b2avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog2)，其常 見的別稱還包括 NEU、NGL、TKR1、CD340、HER-2、MLN19 或 HER-2/neu。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明提供的凍存液，其中，鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽 (guanosine-5 ^ -triphosphate trisodium salt)是指式（1)所不的化合物，其 CAS 號為 36051-31-7。

【權(quán)利要求】
1. 一種用于保藏干細(xì)胞的凍存液，該凍存液由二甲基亞砜和生長培養(yǎng)基混合得到，二 甲基亞砜和所述生長培養(yǎng)基的體積比為（0.05-0. 4) : 1;所述生長培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基 和添加劑，其特征在于：所述添加劑含有抗人血管內(nèi)皮生長因子的抗體、抗人類表皮生長因 子受體1的抗體、抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于：抗人血管內(nèi)皮生長因子的抗體的含 量為0. 01-0. 2ng/mL，抗人類表皮生長因子受體1的抗體的含量為0. 01-0. Ing/mL，抗人 類表皮生長因子受體2的抗體的含量為0. 05-0. 4ng/mL ;鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽的含量為 0?2_4ng/mL〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍存液，其特征在于：抗人血管內(nèi)皮生長因子的抗體的含 量為0. 05-0. Ing/mL，抗人類表皮生長因子受體1的抗體的含量為0. 03-0. 08ng/mL，抗人 類表皮生長因子受體2的抗體的含量為0. 1-0. 2ng/mL ;鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽的含量為 0?5_2ng/mL〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一所述的凍存液，其特征在于：所述抗人血管內(nèi)皮生長因 子的抗體為貝伐單抗；所述抗人類表皮生長因子受體1的抗體為西妥昔單抗，所述抗人類 表皮生長因子受體2的抗體為曲妥珠單抗。
5. 據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于：所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括DMEM培養(yǎng)基、MEM培 養(yǎng)基、IMHM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基中的至少一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于：所述生長培養(yǎng)基還含有5-20體積％的 血清。
7. 權(quán)利要求1-6中任意一項所述的凍存液在保藏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的用途。
8. -種保藏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：該方法包括：將臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞懸浮于權(quán)利要求1-6中任意一項所述的凍存液中，然后在零下200°C至零下70°C的溫度 中保減。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：相對于每mL的凍存液，臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞的用量為（1-5) X IO7個。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：凍存所用的降溫速率為0. 5-2°C /min。
【文檔編號】A01N1/02GK104304233SQ201410459778
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】安沂華, 董健伸 申請人:安沂華