一種水蓑衣愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種水蓑衣愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，包括無(wú)菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織的增殖、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)等步驟。本發(fā)明方法可以大規(guī)模培養(yǎng)水蓑衣細(xì)胞，生產(chǎn)次生代謝物，克服化學(xué)方法合成不經(jīng)濟(jì)、受自然條件和人為條件影響等缺點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)周期短，增殖率高。
【專利說(shuō)明】 一種水蓑衣愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組培條件下水蓑衣懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，屬于植物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]ifM^，HygropHila salicifolia (Vahl),草本,又名穿心蛇、魚(yú)骨草,味甘、微苦，可入藥。爵床科水蓑衣屬，以全草入藥。全年可采，鮮用，或洗凈曬干。功能主治:清熱解毒，化瘀止痛。用于咽喉炎，乳腺炎，吐血，衄血，百日咳；外用治骨折，跌打損傷，毒蛇咬傷。產(chǎn)廣東、廣西、海南、臺(tái)灣、香港、福建、江西、浙江、安徽、湖南、湖北、四川、云南等省區(qū)。生于溪溝邊或洼地等潮濕處。亞洲東南部至東部舊本琉球有分布。目前主要的采收方式是野外采集，主要的繁殖方式是自然繁殖，目前關(guān)于其研究尚少，組培技術(shù)應(yīng)用于水蓑衣的繁殖亦無(wú)人研究。組培方法可以縮短培養(yǎng)周期，克服時(shí)間和空間的局限。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供水蓑衣細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的快速繁殖方法，可以大規(guī)模培養(yǎng)水蓑衣細(xì)胞，生產(chǎn)次生代謝物，克服化學(xué)方法合成不經(jīng)濟(jì)，受自然條件和人為條件影響等缺點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)周期短，增殖率高。
[0004]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案:
取水蓑衣的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污潰，流水沖洗35min，超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理14min,無(wú)菌水沖洗5_7遍,滅菌處理過(guò)的水蓑衣葉片接入培養(yǎng)基配方為改良MS+KT0.5mg/L+2，4-D2.0mg/L+硫代硫酸鈉100mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光強(qiáng)ΙΟΟΟΙχ，溫度23。。，濕度70%_80%，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織接入培養(yǎng)基配方為MS+KT0.2mg/L+2，4-D0.2mg/L+葉酸0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，PH5.8，光強(qiáng)15001x，溫度23°C，濕度70%_80%，增殖后分散性好的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D0.3mg/L+KT0.5mg/L+6mg/L苯丙氨酸中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，每10ml三角瓶接種30ml液體懸浮細(xì)胞，PH5.8，光照20001x，溫度25°C，20天后稱重，檢測(cè)次生代謝物含量。
[0005]采用本發(fā)明制備的水蓑衣懸浮細(xì)胞，增殖率高，操作簡(jiǎn)單，能耗少。
[0006]下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于下列實(shí)施方式。

【具體實(shí)施方式】
[0007]實(shí)施例1
取水蓑衣的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污潰，流水沖洗35min，超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理14min,無(wú)菌水沖洗5_7遍,滅菌處理過(guò)的水蓑衣葉片接入培養(yǎng)基配方為改良MS+KT0.5mg/L+2，4-D2.0mg/L+硫代硫酸鈉100mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光強(qiáng)ΙΟΟΟΙχ，溫度23。。，濕度70%_80%，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織接入培養(yǎng)基配方為MS+KT0.2mg/L+2，4-D0.2mg/L+葉酸0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，PH5.8，光強(qiáng)15001x，溫度23°C，濕度70%_80%，增殖后分散性好的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D0.2mg/L+KT0.4mg/L+5mg/L苯丙氨酸中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，每10ml三角瓶接種30ml液體懸浮細(xì)胞，PH5.8，光照20001x，溫度25V,20天后稱重，檢測(cè)次生代謝物含量。
[0008]實(shí)施例2
取水蓑衣的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污潰，流水沖洗35min，超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理14min,無(wú)菌水沖洗5_7遍,滅菌處理過(guò)的水蓑衣葉片接入培養(yǎng)基配方為改良MS+KT0.5mg/L+2，4-D2.0mg/L+硫代硫酸鈉100mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光強(qiáng)ΙΟΟΟΙχ，溫度23。。，濕度70%_80%，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織接入培養(yǎng)基配方為MS+KT0.2mg/L+2，4-D0.2mg/L+葉酸0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，PH5.8，光強(qiáng)15001x，溫度23°C，濕度70%_80%，增殖后分散性好的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D0.3mg/L+KT0.6mg/L+6mg/L苯丙氨酸中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，每10ml三角瓶接種30ml液體懸浮細(xì)胞，PH5.8，光照20001x，溫度25V,20天后稱重，檢測(cè)次生代謝物含量。
[0009]實(shí)施例3
取水蓑衣的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污潰，流水沖洗35min，超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理14min,無(wú)菌水沖洗5_7遍,滅菌處理過(guò)的水蓑衣葉片接入培養(yǎng)基配方為改良MS+KT0.5mg/L+2，4-D2.0mg/L+硫代硫酸100mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光強(qiáng)ΙΟΟΟΙχ，溫度23。。，濕度70%_80%，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織接入培養(yǎng)基配方為MS+KT0.2mg/L+2，4-D0.2mg/L+葉酸0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，PH5.8，光強(qiáng)15001x，溫度23°C，濕度70%_80%，增殖后分散性好的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D0.3mg/L+KT0.4mg/L+6mg/L苯丙氨酸中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，每10ml三角瓶接種30ml液體懸浮細(xì)胞，PH5.8，光照20001x，溫度25V,20天后稱重，檢測(cè)次生代謝物含量。
[0010]實(shí)施例4
取水蓑衣的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污潰，流水沖洗35min，超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理14min,無(wú)菌水沖洗5_7遍,滅菌處理過(guò)的水蓑衣葉片接入培養(yǎng)基配方為改良MS+KT0.5mg/L+2，4-D2.0mg/L+硫代硫酸鈉100mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光強(qiáng)ΙΟΟΟΙχ，溫度23。。，濕度70%_80%，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織接入培養(yǎng)基配方為MS+KT0.2mg/L+2，4-D0.2mg/L+葉酸0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，PH5.8，光強(qiáng)15001x，溫度23°C，濕度70%_80%，增殖后分散性好的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D0.3mg/L+KT0.6mg/L+5mg/L苯丙氨酸中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，每10ml三角瓶接種30ml液體懸浮細(xì)胞，PH5.8，光照20001x，溫度25V,20天后稱重，檢測(cè)次生代謝物含量。
【權(quán)利要求】
1.一種水蓑衣愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，包括無(wú)菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織的增殖、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)等，主要步驟如下: (1)取水蓑衣的幼嫩葉片，按照常規(guī)的消毒方法對(duì)其進(jìn)行消毒處理； (2)將步驟(I)滅菌處理過(guò)的水蓑衣葉片接入培養(yǎng)基配方為改良MS+KT0.5mg/L+2,4-D2.0mg/L+硫代硫酸鈉100mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光強(qiáng) ΙΟΟΟΙχ，溫度 23。。，濕度 70%_80% ； (3)將步驟(2)誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織接入培養(yǎng)基配方為MS+KT0.2mg/L+2,4-D0.2mg/L+葉酸0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，PH5.8，光強(qiáng)15001x，溫度23°C，濕度 70%-80% ； (4)取步驟(3)增殖后分散性好的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D0.2-0.3mg/L+KT0.4-0.6mg/L+5-6mg/L苯丙氨酸中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，附加鹿糖30g/L,每10ml三角瓶接種30ml液體懸浮細(xì)胞，PH5.8，光照20001x，溫度25°C，20天后稱重，檢測(cè)次生代謝物含量。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種水蓑衣愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(I)中所述水蓑衣無(wú)菌葉片的獲得為:取水蓑衣的葉片，先在漂白粉中浸泡3min,毛刷去除表面污潰,流水沖洗35min,超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理14min,無(wú)菌水沖洗5-7遍。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種水蓑衣愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(2)中所述愈傷組織的誘導(dǎo)，在培養(yǎng)基中附加硫代硫酸鈉100mg/L，既可促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)，又可防止愈傷組織的褐化。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種水蓑衣愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(3)中加入了葉酸0.5mg/L進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，有助于懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種水蓑衣愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(4)加入了 5mg/L苯丙氨酸，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，還可以調(diào)節(jié)次生代謝物質(zhì)的合成。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104255465SQ201410463079
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】楊存 申請(qǐng)人:南京通澤農(nóng)業(yè)科技有限公司