一種云南栘依懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種云南栘依懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)等步驟，本發(fā)明方法所制備的云南栘依懸浮細(xì)胞克服了生境的局限，生長分裂速度快，操作可控，有助于獲得大量的藥用代謝產(chǎn)物。
【專利說明】一種南栘依懸淳細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及云南栘依懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快繁方法，屬于植物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 云南栘依，又稱：西南栘棍，桃姨（云南土名），ofe/araja· (Franch.) Schneid.，薔薇科，常綠喬木，高5?10米，小枝粗壯，幼時有黃白色絨毛，漸脫落，紅褐色或 紫褐色。葉片披針形或卵狀披針形，長5?8厘米，寬2?3厘米，先端急尖或漸尖，基部闊 楔形或近圓形，全緣或稍有淺鈍鋸齒，下面密生黃白色絨毛；葉柄長約1厘米，密生絨毛。花 3?5朵叢生于小枝頂端；花梗短粗或近于無梗，果期伸長，密生絨毛；花白色，直徑2. 5? 8厘米；萼筒鐘狀，外面密生黃白色絨毛。梨果較大，卵形或矩圓形，直徑2?3厘米，萼裂 片宿存；果柄較長。產(chǎn)云南、四川、貴州。生山谷、溪旁、灌或路旁雜木林中，海拔1000-3000 米。在云南騰沖一帶極為常見，當(dāng)?shù)厝私?jīng)常當(dāng)山楂來食用，作為健胃消食和行氣散淤之用， 目前，國內(nèi)對此研究和報道很少，懸浮細(xì)胞具有操作簡單可控，生產(chǎn)成本低，繁殖率高等優(yōu) 點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種云南栘依懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，由該 方法所制備得到的云南栘依懸浮細(xì)胞生長分裂速度快，操作可控，有助于獲得大量的藥用 代謝產(chǎn)物，克服生境的局限。
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下方案來實現(xiàn)的： 取云南栘依幼嫩的葉片，在漂白粉中浸泡2min，毛刷去除表面被毛和污垢，流水沖洗 lOmin，超凈工作臺上0. 1%氯化汞溶液消毒llmin，同時均勻搖動，無菌水沖洗6-7遍，吸水 紙吸去表面水分，消毒處理過的葉片接種入B5+KIU 4mg/L+6-BA0· 5mg/L+IBA0. 2mg/L+3%蔗 糖+0. 65%瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，光照強(qiáng)度8001x，光期7h，暗期17h，誘導(dǎo)出來的 嫩綠松散的云南栘依愈傷組織接入B 5+L 5mg/L2,4-D+lmol/L蛋白胨+100mg/L水解酪蛋白 +lmol/L蔗糖進(jìn)行懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，pH5. 6,光照30001x，溫度25°C，接種量為40%，振蕩速度 為llOr/min，培養(yǎng)10天后用80目的不銹鋼篩對懸浮液進(jìn)行過濾，除去大的細(xì)胞團(tuán)，15天繼 代1次。
[0005] 采用本發(fā)明制備的云南栘依懸浮細(xì)胞生長分裂速度快，操作可控，有助于獲得大 量的藥用次生代謝產(chǎn)物，克服生境的局限。
[0006] 下面將結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不 局限于下列實施方式。

【具體實施方式】 [0007] 實施例1 取云南栘依幼嫩的葉片，在漂白粉中浸泡2min，毛刷去除表面被毛和污垢，流水沖洗 lOmin，超凈工作臺上0. 1%氯化汞溶液消毒llmin，同時均勻搖動，無菌水沖洗6-7遍，吸水 紙吸去表面水分，消毒處理過的葉片接種入Β5+ΚΤ0· 3mg/L+6-BA0. 5mg/L+IBA0. 2mg/L+3%蔗 糖+0. 65%瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，光照強(qiáng)度8001x，光期7h，暗期17h，誘導(dǎo)出來的 嫩綠松散的云南栘依愈傷組織接入B 5+L 5mg/L2,4-D+lmol/L蛋白胨+100mg/L水解酪蛋白 +lmol/L蔗糖進(jìn)行懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，pH5. 6,光照30001x，溫度25°C，接種量為40%，振蕩速度 為llOr/min，培養(yǎng)10天后用80目的不銹鋼篩對懸浮液進(jìn)行過濾，除去大的細(xì)胞團(tuán)，15天繼 代1次。
[0008] 實施例2 取云南栘依幼嫩的葉片，在漂白粉中浸泡2min，毛刷去除表面被毛和污垢，流水沖洗 lOmin，超凈工作臺上0. 1%氯化汞溶液消毒llmin，同時均勻搖動，無菌水沖洗6-7遍，吸水 紙吸去表面水分，消毒處理過的葉片接種入Β5+ΚΤ0· 5mg/L+6-BAl. Omg/L+IBAO. 25mg/L+3% 蔗糖+0. 65%瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，光照強(qiáng)度8001x，光期7h，暗期17h，誘導(dǎo)出來 的嫩綠松散的云南栘依愈傷組織接入B 5+L 5mg/L2,4-D+lmol/L蛋白胨+100mg/L水解酪蛋 白+lmol/L蔗糖進(jìn)行懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，pH5. 6,光照30001x，溫度25°C，接種量為40%，振蕩 速度為ll〇r/min，培養(yǎng)10天后用80目的不銹鋼篩對懸浮液進(jìn)行過濾，除去大的細(xì)胞團(tuán)，15 天繼代1次。
[0009] 實施例3 取云南栘依幼嫩的葉片，在漂白粉中浸泡2min，毛刷去除表面被毛和污垢，流水沖洗 lOmin，超凈工作臺上0. 1%氯化汞溶液消毒llmin，同時均勻搖動，無菌水沖洗6-7遍，吸水 紙吸去表面水分，消毒處理過的葉片接種入Β5+ΚΤ0· 4mg/L+6-BAl. Omg/L+IBAO. 25mg/L+3% 蔗糖+0. 65%瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，光照強(qiáng)度8001x，光期7h，暗期17h，誘導(dǎo)出來 的嫩綠松散的云南栘依愈傷組織接入B 5+L 5mg/L2,4-D+lmol/L蛋白胨+100mg/L水解酪蛋 白+lmol/L蔗糖進(jìn)行懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，pH5. 6,光照30001x，溫度25°C，接種量為40%，振蕩 速度為ll〇r/min，培養(yǎng)10天后用80目的不銹鋼篩對懸浮液進(jìn)行過濾，除去大的細(xì)胞團(tuán)，15 天繼代1次。
【權(quán)利要求】
1. 一種云南栘依懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘 導(dǎo)、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，其主要步驟如下： (1) 采取云南栘依幼嫩的葉片，在超凈工作臺上對其進(jìn)行消毒處理； (2) 取步驟（1)消毒處理過的葉片接種入B5+KIU 3-0. 5mg/L+6-BA0. 5-L Omg/ L+IBAO. 2-0. 25mg/L+3%蔗糖+0. 65%瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，光照強(qiáng)度8001x，光 期7h，暗期17h; (3) 取步驟（2)中誘導(dǎo)出來的嫩綠松散的云南栘依愈傷組織接入B5+1.5mg/L2， 4-D+lmol/L蛋白胨+100mg/L水解酪蛋白+lmol/L鹿糖進(jìn)行懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，ρΗ5· 6,光照 30001χ，溫度 25°C ; 按照權(quán)利要求1所述的一種云南栘依懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，其特征在于：步 驟（1)中所述云南栘依無菌葉片的獲得為，取云南栘依幼嫩的葉片，在漂白粉中浸泡2min， 毛刷去除表面被毛和污垢，流水沖洗lOmin，超凈工作臺上0. 1%氯化汞溶液消毒llmin，同 時均勻搖動，無菌水沖洗6-7遍，吸水紙吸去表面水分。
2. 按照權(quán)利要求1所述的一種云南栘依懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，其特征在于： 步驟（3)中培養(yǎng)基中附加了蛋白胨和水解酪蛋白，可促進(jìn)懸浮細(xì)胞的生長分裂。
3. 按照權(quán)利要求1所述的一種云南栘依懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，其特征在于： 步驟（3)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法為接種量為40%，振蕩速度為110r/min，培養(yǎng)10天后用80目 的不銹鋼篩對懸浮液進(jìn)行過濾，除去大的細(xì)胞團(tuán)，15天繼代1次。
【文檔編號】A01H4/00GK104206276SQ201410463173
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】楊存 申請人:南京通澤農(nóng)業(yè)科技有限公司