一種提高百子蓮胚性愈傷組織保存效果的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高百子蓮胚性愈傷組織保存效果的方法，為采用含有碳納米材料的玻璃化溶液處理百子蓮胚性愈傷組織以提高其保存效果，具體包括：預(yù)培養(yǎng)、裝載液處理、玻璃化溶液處理和液氮保存步驟，其中所述玻璃化溶液含有0.1~0.5g/L碳納米管。本發(fā)明中公開的方法對百子蓮胚性愈傷組織的保存效果優(yōu)化顯著，通過添加碳納米管作為外源物質(zhì)對植物玻璃化超低溫保存起到促進作用。
【專利說明】一種提高百子蓮胚性愈傷組織保存效果的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物或其局部的保存領(lǐng)域，具體涉及一種提高百子蓮胚性愈傷組織保 存效果的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 超低溫保存是上世紀70年代發(fā)展起來的一項現(xiàn)代種質(zhì)資源離體保存技術(shù)。通常 在液氮中保存，被保存材料細胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長活動幾乎完全停止，處在相對穩(wěn)定的 生物學狀態(tài)，達到長期保存種質(zhì)的目的，超低溫保存是目前唯一不需要連續(xù)繼代的中長期 保存方式。玻璃化法超低溫保存是將細胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護 劑組成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下固化成非結(jié)晶的玻 璃化態(tài)，并以這種玻璃態(tài)在低溫下保存。玻璃化法因操作簡單快捷，成本低，適宜保存種類 廣泛，保存材料遺傳性穩(wěn)定，保存效果好等優(yōu)點，是近十年來用于優(yōu)良種質(zhì)資源中長期保存 的首選方法。
[0003] 百子蓮別名藍百合、非洲百合，為百子蓮科百子蓮屬多年生植物，原產(chǎn)于非洲南 部。因其植株挺拔，葉形秀美、葉色濃綠，花量大、色彩鮮艷而備受人們的喜愛，在國外已成 為常見的觀賞花卉，多用于庭院栽培和切花生產(chǎn)；此外，百子蓮還具有固沙護坡的生態(tài)作用 以及鎮(zhèn)痛等藥用。我國引入百子蓮的時間不長（2000年），且在上海的結(jié)實率低，多依賴于 國外進口種子繁殖，因此，通過體細胞胚胎發(fā)生的離體快速繁殖和百子蓮種質(zhì)資源的保存 對百子蓮優(yōu)質(zhì)種苗的需求至關(guān)重要。相關(guān)研究建立了百子蓮胚性愈傷組織超低溫保存體 系，保存后細胞的相對存活率達到了 56. 94%，但仍不足以滿足生產(chǎn)與科研的需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種新的提高百子蓮胚性 愈傷組織保存效果的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中植物及其組織中長期保存難以實現(xiàn)，以及超 低溫保存的植物或其組織恢復(fù)生長率低的缺點。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的或者其他目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0006] -種提高百子蓮胚性愈傷組織保存效果的方法，采用玻璃化法超低溫保存的方法 對百子蓮胚性愈傷組織進行保存，具體步驟如下：
[0007] 1)預(yù)培養(yǎng)：將百子蓮胚性愈傷組織置于預(yù)培養(yǎng)基上，在0?KTC下預(yù)培養(yǎng)1?4 天；
[0008] 2)裝載液處理：室溫下，將預(yù)培養(yǎng)處理后的百子蓮胚性愈傷組織在裝載液中浸泡 處理40?60分鐘后移除裝載液；
[0009] 3)玻璃化溶液處理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡脫水處理百子蓮胚性愈傷 組織40?60分鐘；
[0010] 4)液氮保存：保持百子蓮胚性愈傷組織在玻璃化溶液中浸泡的狀態(tài)，并置于液氮 中保存；
[0011] 所述玻璃化溶液為含有o. 1?o. 5g/L碳納米管的玻璃化冷凍保護液。
[0012] 優(yōu)選地，所述 MS 培養(yǎng)液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 ? 7H20， lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L煙酸，0? 5mg/L鹽酸批B多醇，0? lmg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨酸， 0. 83mg/L KI,6. 2mg/L H3BO3, 22. 3mg/L MnSO4 ? 4H20, 8. 6mg/L ZnSO4 ? 7H20, 0. 25mg/L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,余量為水。所述 MS 培養(yǎng)液 的pH為5. 8。
[0013] 優(yōu)選地，預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為含有0. 4?0. 8mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基。
[0014] 優(yōu)選地，預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為含有0. 5mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基。
[0015] 優(yōu)選地，所述 MS 固體培養(yǎng)基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/ L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20, 440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 *7H20, lOOmg/L 肌醇，0. 5mg/L 煙酸，0. 5mg/L 鹽酸批咳醇，0. lmg/L 鹽酸硫胺素，2mg/L 甘氨酸，〇.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4 .41^0,8. 6mg/L ZnSO4 *71120,0.2511^/ L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,30g/L 蔗糖，lOg/L 瓊脂 粉，余量為水。所述MS固體培養(yǎng)基的pH為5. 8。
[0016] 更優(yōu)選地，在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的方法為：將百子蓮胚性愈傷組織在0?KTC下置 于預(yù)培養(yǎng)基上1?4天；
[0017] 更優(yōu)選地，在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的方法為：將百子蓮胚性愈傷組織在4°C下置于預(yù) 培養(yǎng)基上2天。
[0018] 優(yōu)選地，所述裝載液為含有1?2mol/L丙三醇、0? 3?0? 5mol/L鹿糖和5? IOmmol/L KNO3 的 MS 培養(yǎng)液。
[0019] 優(yōu)選地，所述裝載液為含有2mol/L丙三醇、0. 4mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS 培養(yǎng)液。
[0020] 優(yōu)選地，上述步驟2)中，室溫下，將百子蓮胚性愈傷組織在裝載液中浸泡處理60 分鐘后移除裝載液。
[0021] 優(yōu)選地，上述步驟3)中，在0°C下使用玻璃化溶液浸泡脫水處理百子蓮胚性愈傷 組織40分鐘。
[0022] 優(yōu)選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞 砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 5g/L碳納米管的MS培養(yǎng)液。
[0023] 優(yōu)選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞 砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 3g/L碳納米管的MS培養(yǎng)液。
[0024] -種百子蓮胚性愈傷組織的解凍及再培養(yǎng)方法，所述百子蓮胚性愈傷組織為采用 如上述所述方法保存的百子蓮胚性愈傷組織，所述百子蓮胚性愈傷組織的解凍及再培養(yǎng)方 法為將百子蓮胚性愈傷組織從液氮中取出，先水浴解凍，然后去除玻璃化溶液后用洗滌液 洗滌，最后轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)。
[0025] 優(yōu)選地，水浴解凍的條件為在30?40°C的水浴中解凍60?120s。
[0026] 更優(yōu)選地，水浴解凍的條件為在40°C的水浴中解凍90s。
[0027] 優(yōu)選地，所述洗滌液為含有I. 2mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培養(yǎng)液，洗滌工 藝為：用洗滌液在室溫下將百子蓮胚性愈傷組織浸泡10?30分鐘。
[0028] 更優(yōu)選地，洗滌工藝為：用洗滌液在室溫下將百子蓮胚性愈傷組織處理30分鐘， 每10分鐘更換一次洗滌液。
[0029] 優(yōu)選地，所述恢復(fù)培養(yǎng)基為含有I. 0?3. Omg/L毒莠定和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。
[0030] 優(yōu)選地，所述恢復(fù)培養(yǎng)基為含有I. 5mg/L毒莠定和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。
[0031] 優(yōu)選地，所述百子蓮胚性愈傷組織的制備方法參考文獻：藍百合快速繁殖技術(shù)的 研究，范現(xiàn)麗，上海交通大學碩士學位論文，2009。
[0032] 更優(yōu)選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亞砜、0. 4mol/L蔗糖和0. lg/L碳納米管的MS培養(yǎng)液；或所述玻璃化溶液為含有300g/L丙 三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 3g/L碳納米管的MS培養(yǎng)液。 [0033] 更優(yōu)選地，為了證明本發(fā)明中方法的保存效果，采用相對成活率來統(tǒng)計，具體地， 在恢復(fù)培養(yǎng)30天后利用氯化三苯四氮唑（縮寫為TTC)法統(tǒng)計百子蓮胚性愈傷組織相對成 活率，并輔以熒光素二乙酸酯（縮寫為FDA)染色法觀察。
[0034] 根據(jù)納米科學原理，向冷凍保護劑中添加納米材料能夠有效提高冷凍保護劑的粘 度和熱導率，改變冰晶的形成狀況、減少對細胞的傷害。本發(fā)明對百子蓮胚性愈傷組織在玻 璃化超低溫條件下保存，先進行預(yù)培養(yǎng)，然后依次用裝載液、玻璃化溶液處理，最后在液氮 中超低溫保存，其中玻璃化溶液又為添加了碳納米管的玻璃化溶液，這種外源物質(zhì)的添加 配合方法中的其他工藝，能夠有效的提高百子蓮胚性愈傷組織的保存效果。按照本發(fā)明公 開的保存方法，采用濃度為〇. 1?〇. 5g/L的碳納米管作為外源物質(zhì)使用時，百子蓮胚性愈 傷組織玻璃化超低溫保存后的恢復(fù)生長率顯著提高，本發(fā)明中公開的方法對百子蓮胚性愈 傷組織的保存效果優(yōu)化顯著，通過添加碳納米管作為外源物質(zhì)對植物玻璃化超低溫保存起 到促進作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1為實施例中實驗組和對照組中百子蓮胚性愈傷組織超低溫保存恢復(fù)生長的 FDA染色照片。
[0036] 圖1中從左到右分別為對照組超低溫保存后的百子蓮胚性愈傷組織、實驗組組1 超低溫保存后的百子蓮胚性愈傷組織、實驗組組2超低溫保存后的百子蓮胚性愈傷組織、 實驗組組3超低溫保存后的百子蓮胚性愈傷組織。如圖1所示，亮度越大表示熒光強度越 強，細胞活力越高。

【具體實施方式】
[0037] 以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
[0038] 本發(fā)明實施例中所用的百子蓮胚性愈傷組織由花梗誘導，具體方法參照《藍百合 快速繁殖技術(shù)的研究》，范現(xiàn)麗，上海交通大學碩士學位論文，2009。
[0039] 本發(fā)明實施例中實驗試劑的配方如下：
[0040] I) MS 培養(yǎng)液為：MS 培養(yǎng)液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 ? 7H20， lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L煙酸，0? 5mg/L鹽酸批B多醇，0? lmg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨酸， 0. 83mg/L KI,6. 2mg/L H3BO3, 22. 3mg/L MnSO4 ? 4H20, 8. 6mg/L ZnSO4 ? 7H20, 0. 25mg/L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,余量為水，所述 MS 培養(yǎng)液 的pH為5. 8。
[0041] 2)MS 固體培養(yǎng)基為：MS 固體培養(yǎng)基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/ L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20, 440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 *7H20, lOOmg/L 肌醇，0. 5mg/L 煙酸，0. 5mg/L 鹽酸批咳醇，0. lmg/L 鹽酸硫胺素，2mg/L 甘氨酸，〇.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4 .41^0,8. 6mg/L ZnSO4 *71120,0.2511^/ L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,30g/L 蔗糖，lOg/L 瓊脂 粉，余量為水，所述MS固體培養(yǎng)基的pH為5. 8。
[0042] 3)預(yù)培養(yǎng)基為含有0. 5mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。
[0043] 4)裝載液為：含有2mol/L丙三醇、0. 4mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培養(yǎng)液。
[0044] 5)玻璃化溶液為：含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞砜、 0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 5g/L碳納米管的MS培養(yǎng)液。
[0045] 6)洗滌液為含有I. 2mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培養(yǎng)液。
[0046] 7)恢復(fù)培養(yǎng)基為含有I. 5mg/L毒莠定和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。
[0047] 實施例
[0048] 1)將繼代培養(yǎng)20天的百子蓮胚性愈傷組織在含有0. 5mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng) 基上在4°C下低溫預(yù)培養(yǎng)2天；
[0049] 2)轉(zhuǎn)至裝載液中室溫浸泡處理60分鐘；
[0050] 3)轉(zhuǎn)入玻璃化溶液中在0°C條件下脫水處理40分鐘；
[0051] 4)最后置于液氮中超低溫保存。
[0052] 步驟3)結(jié)束后，無需除去玻璃化溶液，直接將浸泡于玻璃化溶液中的百子蓮胚性 愈傷組織置于液氮中超低溫保存。
[0053] 按照上述步驟將百子蓮胚性愈傷組織分為實驗組和對照組。
[0054] 實驗組的玻璃化溶液中分別含有0. Ig/L、0. 3g/L、0. 5g/L的碳納米管。
[0055] 具體地，實驗組組1的玻璃化溶液中含有0. lg/L的碳納米管；
[0056] 實驗組組2的玻璃化溶液中含有0. 3g/L的碳納米管；
[0057] 實驗組組3的玻璃化溶液中含有0. 5g/L的碳納米管；
[0058] 對照組中不同之處在于玻璃化溶液中不含有碳納米管，其他與實驗組相同。
[0059] 在液氮中保存1小時后取出，快速放入40°C水浴鍋中，解凍90s，并不時輕輕搖動； 將玻璃化溶液吸除，加入洗滌液，室溫處理30min，每隔IOmin換一次洗滌液；洗滌后的百子 蓮胚性愈傷組織移到恢復(fù)培養(yǎng)基培養(yǎng)30天后，計算并比較實驗組和對照組內(nèi)百子蓮胚性 愈傷組織的相對成活率。
[0060] 實驗組與對照組中百子蓮胚性愈傷組織的相對成活率見表1。
[0061] 表 1
[0062]

【權(quán)利要求】
1. 一種提高百子蓮胚性愈傷組織保存效果的方法，其特征在于，采用玻璃化超低溫保 存的方法對百子蓮胚性愈傷組織進行保存，具體步驟如下： 1) 預(yù)培養(yǎng)：將百子蓮胚性愈傷組織置于預(yù)培養(yǎng)基上，在〇?10°C下培養(yǎng)1?4天； 2) 裝載液處理：室溫下，將預(yù)培養(yǎng)處理后的百子蓮胚性愈傷組織在裝載液中浸泡處理 40?60分鐘后移除裝載液； 3) 玻璃化溶液處理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡脫水處理百子蓮胚性愈傷組織 40?60分鐘； 4) 液氮保存：保持百子蓮胚性愈傷組織浸泡在玻璃化溶液中的狀態(tài)，并將其置于液氮 中保存； 所述玻璃化溶液為含有〇. 1?〇. 5g/L碳納米管的玻璃化冷凍保護液。
2. 如權(quán)利要求1所述提高百子蓮胚性愈傷組織保存效果的方法，其特征在于，所述百 子蓮胚性愈傷組織預(yù)培養(yǎng)基為含有〇. 4?0. 8mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基。
3. 如權(quán)利要求1所述提高百子蓮胚性愈傷組織保存效果的方法，其特征在于，所述裝 載液為含有1?2mol/L丙三醇、0. 3?0. 5mol/L蔗糖和5?10mmol/L ΚΝ03的MS培養(yǎng)液。
4. 如權(quán)利要求1所述提高百子蓮胚性愈傷組織保存效果的方法，其特征在于，所述 玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞砜、0. 4mol/L蔗糖和 0. 1?0. 5g/L碳納米管的MS培養(yǎng)液。
5. -種百子蓮胚性愈傷組織的解凍及再培養(yǎng)方法，所述百子蓮胚性愈傷組織為采用如 權(quán)利要求1?4任一權(quán)利要求所述方法保存的百子蓮胚性愈傷組織，所述百子蓮胚性愈傷 組織的解凍及再培養(yǎng)方法為將百子蓮胚性愈傷組織從液氮中取出，先水浴解凍，然后去除 玻璃化溶液后用洗滌液洗滌，最后轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)。
6. 如權(quán)利要求5所述解凍及再培養(yǎng)方法，其特征在于，水浴解凍的條件為在30?40°C 的水浴中解凍60?120s。
7. 如權(quán)利要求5所述解凍及再培養(yǎng)方法，其特征在于，所述洗滌液為含有1. 0? 1. 5mol/L蔗糖和5?10mm〇l/L ΚΝ03的MS培養(yǎng)液洗漆，洗滌工藝為：用洗滌液在室溫下將 百子蓮胚性愈傷組織浸泡10?30分鐘。
8. 如權(quán)利要求5所述解凍及再培養(yǎng)方法，其特征在于，所述恢復(fù)培養(yǎng)基為含有1. 0? 3. Omg/L毒莠定和30g/L鹿糖的MS培養(yǎng)基。
【文檔編號】A01N3/00GK104255709SQ201410468246
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】張荻, 任麗, 陳冠群, 岳建華, 鄒夢雯, 申曉輝 申請人:上海交通大學