一種優(yōu)化百合胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存效果的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種優(yōu)化百合胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存效果的方法，為采用含有碳納米材料的玻璃化溶液處理百合胚性愈傷組織以提高其保存效果，具體包括：預(yù)培養(yǎng)、裝載液處理、玻璃化溶液處理和液氮保存步驟，其中所述玻璃化溶液含有0.1~0.5g/L石墨烯量子點(diǎn)。本發(fā)明中公開(kāi)的方法對(duì)百合胚性愈傷組織的保存效果優(yōu)化顯著，通過(guò)添加石墨烯量子點(diǎn)作為外源物質(zhì)對(duì)植物玻璃化超低溫保存起到促進(jìn)作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種優(yōu)化百合胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存效果的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物或其局部的保存領(lǐng)域，具體涉及一種優(yōu)化百合胚性愈傷組織玻璃 化超低溫保存效果的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 超低溫保存是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)現(xiàn)代種質(zhì)資源離體保存技術(shù)。通常 在液氮中保存，被保存材料細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎完全停止，處在相對(duì)穩(wěn)定的 生物學(xué)狀態(tài)，達(dá)到長(zhǎng)期保存種質(zhì)的目的，超低溫保存是目前唯一不需要連續(xù)繼代的中長(zhǎng)期 保存方式。玻璃化法超低溫保存是將細(xì)胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護(hù) 劑組成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下固化成非結(jié)晶的玻 璃化態(tài)，并以這種玻璃態(tài)在低溫下保存。玻璃化法因操作簡(jiǎn)單快捷，成本低，適宜保存種類(lèi) 廣泛，保存材料遺傳性穩(wěn)定，保存效果好等優(yōu)點(diǎn)，是近十年來(lái)用于優(yōu)良種質(zhì)資源中長(zhǎng)期保存 的首選方法。
[0003] 百合是百合科百合屬的草本植物，為世界著名的球根花卉，具有花色豐富、姿態(tài)優(yōu) 美的特色。百合被廣泛運(yùn)用在園林布景、切花、鮮花和盆栽觀賞等方面。中國(guó)作為百合分布 中心，種質(zhì)資源豐富，但多數(shù)野生種仍屬于瀕危植物。百合作為多年生球莖草本，不能通過(guò) 低溫種子庫(kù)進(jìn)行保存，目前主要的保存方式為田間種植保存，易在保存過(guò)程中出現(xiàn)褐變、腐 爛，百合的中長(zhǎng)期保存問(wèn)題亟待解決。
[0004] 國(guó)外關(guān)于百合的超低溫研究開(kāi)始于上世紀(jì)90年代，利用百合莖尖為外植體，通過(guò) 超低溫保存的成活率僅為8. 45%，隨著對(duì)超低溫體系的不斷改進(jìn)，在玻璃化溶液PVS2出現(xiàn) 后，成活率顯著提升，開(kāi)始被應(yīng)用于不同類(lèi)型的材料。國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究起步較晚，已初步摸 索出百合超低溫保存各關(guān)鍵步驟的保存條件，豐富了百合超低溫保存體系。但關(guān)于百合胚 性愈傷組織作為材料進(jìn)行超低溫保存的研究還很少，還未建立百合胚性愈傷組織的超低溫 保存體系。因此建立百合胚性愈傷組織超低溫保存體系并加以?xún)?yōu)化，提高百合胚性愈傷組 織凍后存活率，對(duì)百合的研究與產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有很重要的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種新的提高百合胚性愈 傷組織保存效果的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中植物及其組織中長(zhǎng)期保存難以實(shí)現(xiàn)，以及超低 溫保存的植物或其組織恢復(fù)生長(zhǎng)率低的缺點(diǎn)。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的或者其他目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007] 一種提高百合胚性愈傷組織保存效果的方法，采用玻璃化法超低溫保存的方法對(duì) 百合胚性愈傷組織進(jìn)行保存，具體步驟如下：
[0008] 1)預(yù)培養(yǎng)：將百合胚性愈傷組織置于預(yù)培養(yǎng)基上，在0?KTC下預(yù)培養(yǎng)1?4天；
[0009] 2)裝載液處理：室溫下，將百合胚性愈傷組織在裝載液中浸泡處理40?60分鐘 后移除裝載液；
[0010] 3)玻璃化溶液處理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡脫水處理百合胚性愈傷組 織40?60分鐘；
[0011] 4)液氮保存：保持百合胚性愈傷組織浸泡在玻璃化溶液中的狀態(tài)，并將其置于液 氣中保存；
[0012] 所述玻璃化溶液為含有0. 1?0. 5g/L石墨烯量子點(diǎn)的玻璃化冷凍。
[0013] 優(yōu)選地，所述 MS 培養(yǎng)液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/LFeS04 ? 7H20, lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L煙酸，0? 5mg/L鹽酸批咳醇，0? lmg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨 酸，0.83mg/L KI，6. 2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4.440,8.61^/1^1^04.71120,0.2511^/1 Na2MoO 4 ? 2H20,0? 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0? 025mg/LCoCl2 ? 6H20,余量為水，所述 MS 培養(yǎng)液的 pH 為 5. 8。
[0014] 優(yōu)選地，上述步驟1)中所述預(yù)培養(yǎng)基為含有0. 4?0. 8mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng) 基。
[0015] 優(yōu)選地，上述步驟1)中所述預(yù)培養(yǎng)基為含有0. 7mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基。
[0016] 優(yōu)選地，所述 MS 固體培養(yǎng)基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/LKH2P04， 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/LFeS04 ? 7H20, lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L煙酸，0? 5mg/L鹽酸批B多醇，0? lmg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨酸， 0. 83mg/L KI,6. 2mg/L H3BO3, 22. 3mg/L MnSO4 ? 4H20, 8. 6mg/L ZnSO4 ? 7H20, 0. 25mg/L Na2MoO4 ? 2H20,0? 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0? 025mg/L CoCl2 ? 6H20, 30g/L 蔗糖，lOg/L 瓊脂粉， 余量為水，所述MS固體培養(yǎng)基的pH為5. 8。
[0017] 更優(yōu)選地，步驟1)中所述百合胚性愈傷組織在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件為：在4°C 下培養(yǎng)2天。
[0018] 優(yōu)選地，所述裝載液為含有1?2mol/L丙三醇、0? 3?0? 5mol/L鹿糖和5? IOmmol/L KNO3 的 MS 培養(yǎng)液。
[0019] 優(yōu)選地，所述裝載液為含有2mol/L丙三醇、0. 4mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS 培養(yǎng)液。
[0020] 優(yōu)選地，上述步驟2)中，室溫下，將百合胚性愈傷組織在裝載液中浸泡處理60分 鐘后移除裝載液；
[0021] 優(yōu)選地，上述步驟3)中，在0°C下使用玻璃化溶液浸泡脫水處理百合胚性愈傷組 織60分鐘。
[0022] 優(yōu)選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞 砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 5g/L石墨烯量子點(diǎn)的MS培養(yǎng)液。
[0023] 更優(yōu)選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亞砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 3g/L石墨烯量子點(diǎn)的MS培養(yǎng)液。
[0024] -種百合胚性愈傷組織的解凍及再培養(yǎng)方法，所述百合胚性愈傷組織為采用如上 述所述方法保存的百合胚性愈傷組織，所述百合胚性愈傷組織的解凍及再培養(yǎng)方法為將百 合胚性愈傷組織從液氮中取出，先水浴解凍，然后去除玻璃化溶液后用洗滌液洗滌，最后轉(zhuǎn) 入恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)。
[0025] 優(yōu)選地，水浴解凍的條件為在30?40°C的水浴中解凍60?120s。
[0026] 更優(yōu)選地，水浴解凍的條件為在40°C的水浴中解凍90s。
[0027] 優(yōu)選地，所述洗滌液為含有I. 0?I. 5mol/L蔗糖和5?lOmmol/L KNO3的MS培 養(yǎng)液。
[0028] 優(yōu)選地，所述洗滌液為含有I. 2mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培養(yǎng)液，洗滌工 藝為：用洗滌液在室溫下將百合胚性愈傷組織浸泡10?30分鐘。
[0029] 更優(yōu)選地，洗滌工藝為：用洗滌液在室溫下將百合胚性愈傷組織浸泡30分鐘，每 10分鐘更換一次洗滌液。
[0030] 優(yōu)選地，所述恢復(fù)培養(yǎng)基為含有〇? 1?3. Omg/L毒莠定、0? 1?2. Omg/L 6-節(jié)基腺 嘌呤和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。
[0031] 優(yōu)選地，所述恢復(fù)培養(yǎng)基為含有0. 5mg/L毒莠定、0. 5mg/L 6-節(jié)基腺噪呤和30g/L 蔗糖的MS培養(yǎng)基。
[0032] 優(yōu)選地，室溫下，將百合胚性愈傷組織在裝載液中浸泡處理60分鐘后移除裝載 液。
[0033] 優(yōu)選地，在0°C下使用玻璃化溶液浸泡處理百合胚性愈傷組織60分鐘。
[0034] 優(yōu)選地，百合胚性愈傷組織的制備方法參考文獻(xiàn)：Somatic embryogenesis and plant regeneration in Lilium longiflorum Thunb (A.Tribulato, P. C. Remotti, H. J. M. Loffler, Plant Cell Report, 1997)〇
[0035] 更優(yōu)選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亞砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 3g/L石墨烯量子點(diǎn)的MS培養(yǎng)液。
[0036] 更優(yōu)選地，為了證明本發(fā)明中方法的保存效果，采用相對(duì)成活率來(lái)統(tǒng)計(jì)，具體地， 在恢復(fù)培養(yǎng)30天后利用氯化三苯四氮唑（縮寫(xiě)為T(mén)TC)法統(tǒng)計(jì)百合胚性愈傷組織相對(duì)成活 率，并輔以熒光素二乙酸酯（縮寫(xiě)為FDA)染色法觀察。
[0037] 根據(jù)納米科學(xué)原理，向冷凍保護(hù)劑中添加納米材料能夠有效提高冷凍保護(hù)劑的粘 度和熱導(dǎo)率，改變冰晶的形成狀況、減少對(duì)細(xì)胞的傷害。本發(fā)明對(duì)百合胚性愈傷組織在玻璃 化超低溫條件下保存，先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后依次用裝載液、玻璃化溶液處理，最后在液氮中 超低溫保存，其中玻璃化溶液又為添加了石墨烯量子點(diǎn)的玻璃化溶液，這種外源物質(zhì)的添 加配合方法中的其他工藝，能夠有效的提高百合胚性愈傷組織的保存效果。按照本發(fā)明公 開(kāi)的保存方法，采用濃度為〇. 1?〇. 5g/L的石墨烯量子點(diǎn)作為外源物質(zhì)使用時(shí)，百合胚性 愈傷組織玻璃化超低溫保存后的恢復(fù)生長(zhǎng)率顯著提高，本發(fā)明中公開(kāi)的方法對(duì)百合胚性愈 傷組織的保存效果優(yōu)化顯著，通過(guò)添加石墨烯量子點(diǎn)作為外源物質(zhì)對(duì)植物玻璃化超低溫保 存起到促進(jìn)作用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中百合胚性愈傷組織超低溫保存恢復(fù)生長(zhǎng)的FDA染色照 片。FDA能夠進(jìn)入活細(xì)胞原生質(zhì)體內(nèi)產(chǎn)生熒光，可以作為判斷細(xì)胞死活的標(biāo)志。
[0039] 圖1中有左到右分別為對(duì)照組超低溫保存后的百合胚性愈傷組織、實(shí)驗(yàn)組1超低 溫保存后的百合胚性愈傷組織、實(shí)驗(yàn)組2超低溫保存后的百合胚性愈傷組織、實(shí)驗(yàn)組3超低 溫保存后的百合胚性愈傷組織。如圖1所示，亮度越大表示熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，細(xì)胞活力越高。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū) 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0041] 本發(fā)明實(shí)施例中所用的百合胚性愈傷組織參照Somatic embryogenesis and plant regeneration in Lilium longiflorum Thunb (A.Tribulato, P. C. Remotti, H. J.M.Loffler, Plant Cell Report, 1997)中記載方法，獲得百合胚性愈傷組織。
[0042] 本發(fā)明實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)試劑的配方如下：
[0043] I) MS 培養(yǎng)液為：MS 培養(yǎng)液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 ? 7H20， lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L煙酸，0? 5mg/L鹽酸批咳醇，0? lmg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨 酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4 ?fflWJ.emg/L ZnSO4 .71120,0.2511^/ LNa2MoO4 ? 2H20,0? 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0? 025mg/L CoCl2 ? 6H20,余量為水，所述 MS 培養(yǎng)液 的pH為5. 8。
[0044] 2)MS 固體培養(yǎng)基為：MS 固體培養(yǎng)基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3, 170mg/LKH2P04,370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/ LFeSO4 *7H20, lOOmg/L 肌醇，0? 5mg/L 煙酸，0? 5mg/L 鹽酸批卩多醇，0? lmg/L 鹽酸硫胺素，2mg/ L甘氨酸,〇? 83mg/L KI，6. 2mg/L H3B03,22. 3mg/L MnSO4 .4H20,8. 6mg/LZnS04 *71120,0. 25mg/ L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,30g/L 蔗糖，lOg/L 瓊脂 粉，余量為水，所述MS固體培養(yǎng)基的pH為5.8。
[0045] 3)預(yù)培養(yǎng)基為含有0? 7mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。
[0046] 4)裝載液為：含有2mol/L丙三醇、0. 4mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培養(yǎng)液。
[0047] 5)玻璃化溶液為：含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞砜、 0. 4mol/L蔗糖和0. 3g/L石墨烯量子點(diǎn)的MS培養(yǎng)液。
[0048] 6)洗滌液為含有I. 2mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培養(yǎng)液。
[0049] 7)恢復(fù)培養(yǎng)基為含有I. 5mg/L毒莠定、0? 5mg/L 6-芐基腺嘌呤和30g/L蔗糖的MS 培養(yǎng)基。
[0050] 實(shí)施例
[0051] 1)將繼代培養(yǎng)20天的百合胚性愈傷組織在含有0. 7mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基 上在4°C下低溫預(yù)培養(yǎng)2天；
[0052] 2)轉(zhuǎn)至裝載液中室溫浸泡處理60分鐘；
[0053] 3)轉(zhuǎn)入玻璃化溶液中在0°C條件下脫水處理60分鐘；
[0054] 4)最后置于液氮中超低溫保存。
[0055] 步驟3)結(jié)束后，無(wú)需除去玻璃化溶液，直接將浸泡于玻璃化溶液中的百合胚性愈 傷組織置于液氮中超低溫保存。
[0056] 按照上述步驟將百合胚性愈傷組織分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。
[0057] 其中，實(shí)驗(yàn)組的玻璃化溶液中分別含有0. Ig/L、0. 3g/L、0. 5g/L的石墨烯量子點(diǎn)。
[0058] 具體地，實(shí)驗(yàn)組組1的玻璃化溶液中含有0. lg/L的石墨烯量子點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)組組2的 玻璃化溶液中含有0. 3g/L的石墨烯量子點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)組組3的玻璃化溶液中含有0. 5g/L的石 墨烯量子點(diǎn)；對(duì)照組組3中不含有石墨烯量子點(diǎn)，其他與實(shí)驗(yàn)組組3相同。
[0059] 對(duì)照組中不同之處在于玻璃化溶液不含有石墨烯量子點(diǎn)，其他與實(shí)驗(yàn)組相同。
[0060] 在液氮中保存Ih后，取出，快速放入40°C水浴鍋中，解凍90s，并不時(shí)輕輕搖動(dòng)；將 玻璃化溶液吸除，加入洗滌液，室溫處理30min，每隔IOmin換一次洗滌液；洗滌后的百合胚 性愈傷組織移到恢復(fù)培養(yǎng)基培養(yǎng)30天后，計(jì)算并比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組內(nèi)百合胚性愈傷組 織的相對(duì)成活率。
[0061] 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的百合胚性愈傷組織的相對(duì)成活率見(jiàn)表1。
[0062] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種優(yōu)化百合胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存效果的方法，其特征在于，采用玻璃 化法超低溫保存的方法對(duì)百合胚性愈傷組織進(jìn)行保存，具體步驟如下： 1) 預(yù)培養(yǎng)：將百合胚性愈傷組織置于預(yù)培養(yǎng)基上，在〇?10°C下預(yù)培養(yǎng)1?4天； 2) 裝載液處理：室溫下，將百合胚性愈傷組織在裝載液中浸泡處理40?60分鐘后移 除裝載液； 3) 玻璃化溶液處理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡脫水處理百合胚性愈傷組織 40?60分鐘； 4) 液氮保存：保持百合胚性愈傷組織浸泡在玻璃化溶液中的狀態(tài)，將其置于液氮中保 存； 所述玻璃化溶液為含有〇. 1?〇. 5g/L石墨烯量子點(diǎn)的玻璃化冷凍保護(hù)液。
2. 如權(quán)利要求1所述提高百合胚性愈傷組織保存效果的方法，其特征在于，所述百合 胚性愈傷組織預(yù)培養(yǎng)基為含有〇. 4?0. 8mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基。
3. 如權(quán)利要求1所述優(yōu)化百合胚性愈傷組織玻璃化法超低溫保存效果的方法，其特征 在于，所述裝載液為含有1?2mol/L丙三醇、0· 3?0· 5mol/L鹿糖和5?10mmol/L ΚΝ03 的MS培養(yǎng)液。
4. 如權(quán)利要求1所述優(yōu)化百合胚性愈傷組織玻璃化法超低溫保存效果的方法，其特征 在于，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞砜、0. 4mol/L 蔗糖和0. 1?0. 5g/L石墨烯量子點(diǎn)的MS培養(yǎng)液。
5. -種百合胚性愈傷組織的解凍及再培養(yǎng)方法，所述百合胚性愈傷組織為采用如權(quán)利 要求1?4任一權(quán)利要求所述方法保存的百合胚性愈傷組織，所述百合胚性愈傷組織的解 凍及再培養(yǎng)方法為將百合胚性愈傷組織從液氮中取出，先水浴解凍，然后去除玻璃化溶液 后用洗滌液洗滌，最后轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)。
6. 如權(quán)利要求5所述解凍及再培養(yǎng)方法，其特征在于，水浴解凍的條件為在30?40°C 的水浴中解凍60?120s。
7. 如權(quán)利要求5所述解凍及再培養(yǎng)方法，其特征在于，所述洗滌液為含有1. 0? 1. 5mol/L蔗糖和5?10mm〇l/L ΚΝ03的MS培養(yǎng)液洗漆，洗滌工藝為：用洗滌液在室溫下將 百合胚性愈傷組織浸泡10?30分鐘。
8. 如權(quán)利要求5所述解凍及再培養(yǎng)方法，其特征在于，所述恢復(fù)培養(yǎng)基為含有0. 1? 3. Omg/L毒莠定、0. 1?2mg/L 6-芐基腺嘌呤和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】A01N3/00GK104255712SQ201410468280
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】張荻, 任麗, 陳冠群, 申曉輝 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)