百脈根erf類轉(zhuǎn)錄因子、其編碼基因及表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了百脈根ERF類轉(zhuǎn)錄因子、其編碼基因及表達(dá)載體和應(yīng)用。本發(fā)明從百脈根中分離得到ERF類轉(zhuǎn)錄因子cDNA，其核苷酸序列為SEQ ID No.1所示，所編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No.2所示。本發(fā)明還提供了含有該轉(zhuǎn)錄因子cDNA的表達(dá)載體及宿主細(xì)胞。功能分析實(shí)驗(yàn)證明，在植物中過表達(dá)ERF類轉(zhuǎn)錄因子cDNA能夠有效提高或改善植物對(duì)包括高鹽、干旱、低溫等逆境脅迫的抗性。本發(fā)明進(jìn)一步提供了它們?cè)谔岣咧参飳?duì)逆境脅迫抗性或培育耐逆境脅迫轉(zhuǎn)基因植物新品種中的應(yīng)用，包括：構(gòu)建含有所述ERF類轉(zhuǎn)錄因子cDNA的重組植物表達(dá)載體；將其轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，培育篩選得到對(duì)逆境脅迫抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
【專利說明】百脈根ERF類轉(zhuǎn)錄因子、其編碼基因及表達(dá)載體和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)錄因子，尤其涉及從百脈根（Lotus corniculatus L.)中分離的與 抗逆相關(guān)的ERF類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因，本發(fā)明進(jìn)一步涉及它們?cè)谔岣咧参锟鼓婢趁{迫 能力中的應(yīng)用，屬于ERF類轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 土壤干旱、鹽堿化嚴(yán)重阻礙了農(nóng)作物的生長(zhǎng)，降低了農(nóng)作物的產(chǎn)量，已經(jīng)成為制約 世界灌溉農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和影響生態(tài)環(huán)境的重要因素。隨著人口增加、耕地減少以及水資 源的匱乏，提高水資源利用效率、充分開發(fā)和利用鹽堿地有著極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。鹽堿地 改良是世界性難題，傳統(tǒng)措施投資大、效益低，經(jīng)過數(shù)十年實(shí)踐，利用基因工程技術(shù)提高植 物抗旱、耐鹽堿的能力，是開發(fā)利用干旱、鹽堿地資源最根本、最經(jīng)濟(jì)、最有效的途徑之一。
[0003] 植物抗逆性是受多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，單個(gè)基因表達(dá)的增強(qiáng)并不能從根本 上改良植物對(duì)多種不良環(huán)境的抵抗能力，而轉(zhuǎn)錄因子（Transcriptional Factors, TFs)是 能夠與真核生物基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件特異性結(jié)合，從而激活或抑制下游基因在 特定時(shí)間和空間轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的一類DNA結(jié)合蛋白，是目前抗逆研究最多、應(yīng)用最廣的一類 基因。
[0004] 植物逆境抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可以分：AP2/ERF、bZIP、WRKY、MYB、NAC五大類。其中 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一大類超基因家族，具有非常保守的DNA結(jié)合域，特異性的 與ERE、GCC-box等順式元件結(jié)合，調(diào)控脅迫應(yīng)答基因表達(dá)，是參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物/非 生物脅迫應(yīng)答基因表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。其中DREB和ERF是首要的兩大 類亞家族，在生物/非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，是提高植物抗逆性能的理想 候選基因。
[0005] 目前已從不同物種中分離克隆了上千個(gè)DREB/ERF基因，對(duì)近200個(gè)基因進(jìn)行了功 能驗(yàn)證，轉(zhuǎn)基因擬南芥、煙草等模式植物、水稻、玉米、大麥、小麥、大豆等糧食作物、番茄、馬 鈴薯、辣椒、花生、棉花等經(jīng)濟(jì)作物、苜蓿、三葉草、高羊茅、百脈根等牧草中過表達(dá)在不同程 度上提高了抗旱、耐鹽、高溫、冷凍、抗病蟲等抗逆性能。盡管植物抗逆基因工程的研究取得 了一些進(jìn)展，但是其重點(diǎn)均在導(dǎo)入個(gè)別功能基因來提高某種抗性，從而達(dá)不到使植物的抗 逆性得到綜合、根本性的改良。
[0006] 百脈根（Lotus corniculatus L.)是世界范圍內(nèi)廣泛種植的多年生優(yōu)良豆科牧 草，具有營(yíng)養(yǎng)豐富、耐貧瘠、耐酸堿、耐牧和飼用安全、適口性好等優(yōu)點(diǎn)。百脈根不僅是建設(shè) 生態(tài)農(nóng)業(yè)的優(yōu)質(zhì)草種，還是用于土壤改良的重要作物，在用作地被植物、保持水土、改良人 工草場(chǎng)、防止土壤荒漠化等方面具有獨(dú)特作用。另外，百脈根在西方國(guó)家也常被作為路旁和 庭院觀賞植物而栽培。植物抗逆相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的分離、鑒定及其功能分析，對(duì)闡 明抗逆分子機(jī)制、有效地進(jìn)行分子育種研究十分必要。選擇優(yōu)質(zhì)牧草百脈根為材料分離、鑒 定AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子并分析其抗逆功能，對(duì)于農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境建設(shè)以及土壤改良等 具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的之一是提供從百脈根（Lotus corniculatus L.)中分離的ERF類轉(zhuǎn)錄 因子及其編碼基因。
[0008] 本發(fā)明目的之二是提供含有上述編碼基因的重組植物表達(dá)載體以及含有該表達(dá) 載體的宿主細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明目的之三是將所述的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因應(yīng)用于提高或改善植物對(duì)于 逆境脅迫的抗性。
[0010] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種從百脈根（Lotus corniculatus L.) 所分離的ERF類轉(zhuǎn)錄因子cDNA(LcERF053)，其多核苷酸為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示：
[0012] (a)、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或
[0013] (b)、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或
[0014] (c)、與SEQ ID NO: 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有ERF類轉(zhuǎn)錄因子功能；或
[0015] (d)、與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸；或
[0016] (e)、在SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、取代 或插入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有ERF類轉(zhuǎn)錄因子功能的功 能或活性。
[0017] 本發(fā)明目的之二是提供由上述轉(zhuǎn)錄因子cDNA(LcERF053)所編碼的能夠提高植物 對(duì)逆境脅迫抗性的ERF類轉(zhuǎn)錄因子，其氨基酸為（a)或（b)所示：
[0018] (a)、SEQ ID No. 2 所示的氨基酸；
[0019] (b)、將SEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有ERF類轉(zhuǎn)錄因子功能或活性的蛋白變體；
[0020] 其中，SEQ ID NO. 2的氨基端第100至163位氨基酸殘基序列為AP2/ERF結(jié)合域 的編碼序列（SEQ ID No. 3)，該結(jié)合域第14位（113位）氨基酸為丙氨酸（A)，第19位（118 位）氨基酸為天冬氨酸（D)，此類結(jié)構(gòu)域能夠與GCC box順式作用元件結(jié)合而啟動(dòng)抗病防衛(wèi) 基因或抗逆應(yīng)答基因的表達(dá)。
[0021] 本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn)生，這些操作方法通常為本 領(lǐng)域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備ERF轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列變體或片段，其中 由于誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知。其中，保守的取代是將一種氨基酸殘基 替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。
[0022] 本發(fā)明所述的ERF轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因包括天然存在的序列和變體兩種形式。 "變體"意指基本相似的序列，對(duì)于多核苷酸，變體包含天然多核苷酸中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處 一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入或/和替換。對(duì)于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼 的簡(jiǎn)并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變體。諸如此類天然存在的變體可通過現(xiàn)有的 分子生物學(xué)技術(shù)來鑒定。變體多核苷酸還包括合成來源的多核苷酸，例如采用定點(diǎn)誘變所 得到的仍編碼SEQ ID No. 2所示的氨基酸的多核苷酸變體，或者是通過重組的方法（例如 DNA改組）。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過以下分子生物技術(shù)手段來篩選或評(píng)價(jià)變體多核苷酸所 編碼蛋白的功能或活性：DNA結(jié)合活性、蛋白之間的相互作用，瞬時(shí)研究中基因表達(dá)的激活 情況或轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的效應(yīng)等。
[0023] 本發(fā)明還提供了含有所述ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA(LcERF053)的重組植物表達(dá)載體以 及含有該重組植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0024] 將所述ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接，得到可以在植物中表 達(dá)該編碼基因的重組植物表達(dá)載體；該重組植物表達(dá)載體可以由5'端非編碼區(qū)，SEQ ID No. 1所示的多核苷酸和3'非編碼區(qū)組成，其中，所述的5'端非編碼區(qū)可以包括啟動(dòng)子序 列、增強(qiáng)子序列或/和翻譯增強(qiáng)序列；所述的啟動(dòng)子可以是組成性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、 組織或器官特異性啟動(dòng)子；所述的3'非編碼區(qū)可以包含終止子序列、mRNA切割序列等。 合適的終止子序列可取自根癌農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒，例如章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶終止 區(qū)。
[0025] 另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將SEQ ID No. 1所示的多核苷酸進(jìn)行優(yōu)化以增強(qiáng)或改 善在植物中的表達(dá)效率。例如。可采用目標(biāo)植物的偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化來合成多核苷酸以 增強(qiáng)或改善在目標(biāo)植物中的表達(dá)效率。
[0026] 該重組植物表達(dá)載體還可含有用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記 基因用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。標(biāo)記基因包括：編碼抗生素抗性的基因以及賦予除草 化合物抗性的基因等。此外，所述的標(biāo)記基因還包括表型標(biāo)記，例如半乳糖苷酶和熒光 蛋白等。
[0027] 本發(fā)明還涉及將所述的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA引入到植物中以提高植物對(duì)逆境脅迫 的抗性。
[0028] 本發(fā)明提供了一種提高植物對(duì)逆境脅迫抗性的方法，包括：將本發(fā)明從百脈根中 分離的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA引入到目標(biāo)植物或植物細(xì)胞中，有效提高目標(biāo)植物對(duì)逆境脅迫的 抗性。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種培育耐逆境脅迫的轉(zhuǎn)基因植物新品種的方法，包括：構(gòu)建含 有所述從百脈根中分離的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA的重組植物表達(dá)載體；將所構(gòu)建的重組植物 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中，培育篩選得到對(duì)逆境脅迫抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物新品 種。
[0030] 其中，所述的逆境脅迫包括高鹽、干旱、低溫等逆境。
[0031] 所述的"引入"指將ERF轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)氲街参锛?xì)胞內(nèi)部這樣的方式將多核苷 酸或多肽遺傳轉(zhuǎn)化到植物中。將所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法為本領(lǐng)域所習(xí) 知，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法或病毒介導(dǎo)法等。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"指被引入的多核苷 酸構(gòu)建體整合至植物細(xì)胞的基因組中并能通過其子代遺傳；"瞬時(shí)轉(zhuǎn)化"指多核苷酸被引入 到植物中但只能在植物中暫時(shí)性表達(dá)或存在。
[0032] 轉(zhuǎn)化方案以及將所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可視用于轉(zhuǎn)化的植物（單 子葉植物或雙子葉植物）或植物細(xì)胞的類型而變化。將所述多核苷酸或多肽引入植物細(xì)胞 的合適方法包括：顯微注射、電穿孔、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、直接基因轉(zhuǎn)移以及高速?gòu)椀擂Z擊 等。在特定的實(shí)施方案中，可利用多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法將本發(fā)明的ERF轉(zhuǎn)錄因子基因提供給植 物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的ERF轉(zhuǎn)錄因子基因可通過將植物與病毒或病毒核酸接觸 來引入到植物中，通常，這樣的方法涉及將本發(fā)明的ERF轉(zhuǎn)錄因子基因構(gòu)建體引入病毒DNA 或RNA分子中。
[0033] 利用常規(guī)方法可使已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株（McCormick et al. Plant Cell Reports. 1986. 5:81-84)。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)化任何植物種類，包括但不限于：?jiǎn)巫尤~植 物或雙子葉植物。更優(yōu)選的，所述的目標(biāo)植物包括農(nóng)作物、蔬菜或觀賞植物、果樹等，例如， 可以是玉米、水稻、高粱、小麥、大豆、馬鈴薯、大麥、番茄、菜豆、花生、甘蔗或棉花等。
[0034] 為了分析本發(fā)明從百脈根（Lotus corniculatus L.)中分離的ERF類轉(zhuǎn)錄因子 cDNA(LcERF053)的功能，本發(fā)明首先構(gòu)建了含有LcERF053基因的重組植物高效表達(dá)載體， 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)化到擬南芥中；通過Hyg抗性、基因組PCR及RT-PCR篩選鑒定陽性 苗，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥苗進(jìn)行高鹽、干旱等抗逆性分析并且對(duì)其相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定， 通過測(cè)定生理生化指標(biāo)分析看出，轉(zhuǎn)LcERF053基因擬南芥植株的植株含水量、可溶性糖和 脯氨酸等含量高于對(duì)照，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的大量積累有助于減少滲透脅迫和干旱脅迫對(duì) 植物的傷害，說明過表達(dá)LcERF053基因能調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量從而提高轉(zhuǎn)基因擬南 芥的抗旱性和滲透脅迫抗性。功能轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明，在植物中過表達(dá)LcERF053基因能夠有效 提高或改善植物對(duì)包括高鹽、干旱、低溫等逆境脅迫的抗性，在提高植物抗逆反應(yīng)中起著重 要作用，說明LcERF053基因所編碼的蛋白具有ERF類轉(zhuǎn)錄因子的功能。
[0035] 本發(fā)明所渉及到的術(shù)語定義
[0036] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者 類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
[0037] 術(shù)語"轉(zhuǎn)錄因子"是能夠與真核生物基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件特異性結(jié)合， 從而激活或抑制下游基因在特定時(shí)間和空間轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的一類DNA結(jié)合蛋白。
[0038] 術(shù)語"多核苷酸"或"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷 酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生 的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包 括PNA (肽核酸）、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非 另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡(jiǎn)并 密碼子取代）和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以 上所選（或所有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn) 并密碼子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ;0htsuka 等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8:91-98(1994))。
[0039] 術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白"在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。艮P， 針對(duì)多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述術(shù)語適用于天然產(chǎn)生氨 基酸聚合物以及其中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如 本文中所使用，所述術(shù)語涵蓋任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，其包括全長(zhǎng)蛋白（即抗原），其中氨基 酸殘基經(jīng)由共價(jià)肽鍵連接。
[0040] 本發(fā)明中所述"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的 條件。通常，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測(cè)程度比與其它序列雜交的可 檢測(cè)程度更高（例如超過本底至少2倍。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境 條件下將會(huì)不同，較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性或洗 滌條件可鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列。對(duì)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參考有關(guān)文獻(xiàn) (Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, ''Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays. 1993)。更具體的，所述嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定 離子強(qiáng)度PH下的熱熔點(diǎn)（Tm)約5-10°C。T mS在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交 到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度（在指定離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下）（因?yàn)槟繕?biāo)序列過量存在， 所以在T m下在平衡狀態(tài)下50%的探針被占據(jù)）。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件：其中在pH7. 0到 8. 3下鹽濃度低于約I. OM鈉離子濃度，通常為約0. 01到I. OM鈉離子濃度（或其它鹽），并 且溫度對(duì)于短探針（包括（但不限于）10到50個(gè)核苷酸）而言為至少約30°C，而對(duì)于長(zhǎng) 探針（包括（但不限于）大于50個(gè)核苷酸）而言為至少約60°C。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過加入 諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背 景雜交，視情況為10倍背景雜交。例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下：50%甲酰胺，5 X SSC和1% SDS，在42°C下培養(yǎng)；或5XSSC，1% SDS，在65°C下培養(yǎng)，在0. 2XSSC中洗滌和在65°C下于 0. 1% SDS中洗滌。所述洗滌可進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。
[0041] 本發(fā)明中所述的"多個(gè)"通常意味著2-8個(gè)，優(yōu)選為2-4個(gè)，這取決于ERF轉(zhuǎn)錄因 子三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的"替換"是指分別用不同的氨基酸 殘基取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的"缺失"是指氨基酸殘基數(shù)量的減少，也即是分別 缺少其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的"插入"是指氨基酸殘基序列的改變，相對(duì)天然 分子而言，所述改變導(dǎo)致添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
[0042] 術(shù)語"重組宿主細(xì)胞株"或"宿主細(xì)胞"意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管 使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已 知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組 中。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，宿主細(xì)胞還可為單子葉或雙子葉植物細(xì)胞。
[0043] 術(shù)語"可操作的連接"指兩個(gè)或更多個(gè)元件之間功能性的連接，可操作的連接的元 件可為鄰接或非鄰接的。
[0044] 術(shù)語"轉(zhuǎn)化"：將異源性DNA序列引入到宿主細(xì)胞或有機(jī)體的方法。
[0045] 術(shù)語"表達(dá)"：內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0046] 術(shù)語"編碼序列":轉(zhuǎn)錄成RNA的核酸序列。
[0047] 術(shù)語"重組植物表達(dá)載體"：一種或多種用于實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化的DNA載體；本領(lǐng)域中 這些載體常被稱為二元載體。二元載體連同具有輔助質(zhì)粒的載體是大多常用于土壤桿菌介 導(dǎo)轉(zhuǎn)化的。二元載體通常包括=T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的順式作用序列、經(jīng)工程化處理以便能夠 在植物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記物，待轉(zhuǎn)錄的異源性DNA序列等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0048] 圖 I LcERF053cDNA 全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增結(jié)果；M :DNA Marker 100bp，l :PCR 產(chǎn)物。
[0049] 圖2 LcERF053結(jié)構(gòu)保守域分析。
[0050] 圖3 LcERF053二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。
[0051] 圖4進(jìn)化起源分析。
[0052] 圖5 LcERF053在不同脅迫條件下的表達(dá)模式分析。
[0053] 圖6植物表達(dá)載體pH7WG2D-LcERF053構(gòu)建流程圖。
[0054] 圖7重組質(zhì)粒pH7WG2D-LcERF053菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0055] 圖8含有表達(dá)載體pH7WG2D-LcERF053的農(nóng)桿菌GV3101的菌落PCR ;M: 100 ;+ :陽 性對(duì)照，-:農(nóng)桿菌GV3101 (陰性對(duì)照）。
[0056] 圖9轉(zhuǎn)LcERF053基因擬南芥的DNA水平的PCR檢測(cè)結(jié)果；M: IOOOObpMarker ;+ : 陽性對(duì)照，-:陰性對(duì)照。
[0057] 圖10轉(zhuǎn)LcERF053基因擬南芥的RNA水平的PCR檢測(cè)；M: IOOOObp marker ;+ :陽 性對(duì)照，-:陰性對(duì)照。
[0058] 圖11鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因 LcERF053擬南芥以及野生型擬南芥的存活率。
[0059] 圖12鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因 LcERF053擬南芥以及野生型擬南芥的相對(duì)含水量和電導(dǎo) 率變化結(jié)果；Wt為野生型擬南芥；L4、LlO和L12為轉(zhuǎn)基因 LcERF053擬南芥的不同株系。

【具體實(shí)施方式】
[0060] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0061] 實(shí)施例1百脈根LCERF053轉(zhuǎn)錄因子的分離、鑒定與克隆
[0062] 1材料與方法
[0063] I. 1 材料
[0064] I. I. 1植物材料培養(yǎng)及脅迫處理
[0065] 以百脈根-"Leo"為材料，選成熟飽滿、無病蟲害的種子，用0. 1 %升汞浸泡 15-20min，無菌水沖洗3次，瞭干，把消過毒的種子置于B5培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 30天，用150mM的氯化鈉處理12h、24h，采集葉片立即液氮速凍，保存于-80°C冰箱中備用。
[0066] I. 1. 2菌株與質(zhì)粒
[0067] 大腸桿菌（Escherichia coli) :DH5 α 本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存
[0068] PMD19-T克隆載體 購(gòu)自TaKaRa生物公司
[0069] 1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0070] I. 2. 1百脈根總RNA的提取（試劑盒法）
[0071] L 2. 2第一鏈cDNA的合成（按天跟公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行）
[0072] I. 2. 3 ERF轉(zhuǎn)錄因子基因 cDNA的克隆 [0073] 1. 2. 3. 1引物的設(shè)計(jì)與合成
[0074] 表1克隆LcERF053cDNA全長(zhǎng)的引物序列
[0075]

【權(quán)利要求】
1. 從百脈根（Lotus corniculatus L.)分離的ERF類轉(zhuǎn)錄因子cDNA，其特征在于，其 多核苷酸為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或 (b) 、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、與SEQ ID NO: 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多核苷 酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有ERF類轉(zhuǎn)錄因子功能；或 (d) 、與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸；或 (e) 、在SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、取代或插 入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有ERF類轉(zhuǎn)錄因子功能的功能或 活性。
2. 權(quán)利要求1所述cDNA編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸為（a)或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 2所示的氨基酸； (b) 、將SEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有ERF類轉(zhuǎn)錄因子功能或活性的蛋白變體。
3. 與順式作用元件結(jié)合而啟動(dòng)抗病防衛(wèi)基因或抗逆應(yīng)答基因表達(dá)的ERF類轉(zhuǎn)錄因子 的結(jié)構(gòu)域，其特征在于：其氨基酸序列為SEQ ID NO. 3所示。
4. 含有權(quán)利要求1所述cDNA的表達(dá)載體。
5. 按照權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于：所述表達(dá)載體是重組植物表達(dá)載體。
6. 權(quán)利要求1所述的cDNA在提高植物對(duì)逆境脅迫抗性中的應(yīng)用。
7. 按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，包括：構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述cDNA的重組植物表達(dá) 載體；將所構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中，培育篩選得到對(duì)逆境脅迫 抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
8. -種培育耐逆境脅迫的轉(zhuǎn)基因植物新品種的方法，包括：構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述 cDNA的重組植物表達(dá)載體；將所構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中，培育 篩選得到對(duì)逆境脅迫抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物新品種。
9. 權(quán)利要求2所述的蛋白或權(quán)利要求3所述的結(jié)構(gòu)域在提高植物對(duì)逆境脅迫抗性中的 應(yīng)用。
10. 按照權(quán)利要求6、7或9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的逆境脅迫包括高鹽、干旱 或低溫。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104293802SQ201410488539
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】吳燕民, 李詩(shī)剛, 孫占敏, 周美亮, 李金博 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司