建立高血壓小鼠模型的方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種建立高血壓小鼠模型的方法及其用途，所述方法是基于CRISPR/Cas9基因敲除技術建立高血壓小鼠模型的方法，所述方法包括如下步驟：步驟一、建立STK39基因敲除小鼠模型；步驟二、高血壓小鼠動物模型的鑒定；步驟三、高血壓小鼠動物模型的相關表型分析。本發(fā)明基于CRISPR/Cas9基因敲除技術提供一種高血壓小鼠模型的構建方法，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明技術方案是一種便捷、耗時短、效果好的方法。
【專利說明】建立高血壓小鼠模型的方法及其用途

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種建立高血壓小鼠模型的方法及其用途，尤其涉及一種基于CRISPR/Cas9基因敲除技術建立高血壓小鼠模型的方法及其用途。

【背景技術】
[0002]小鼠疾病模型在研究人類疾病致病機理和藥物篩選中起到了關鍵作用。在探究人類神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)精神疾病及人類認知功能、神經(jīng)環(huán)路等方面具有巨大的優(yōu)勢可成為研究和藥物篩選的重要疾病模型。
[0003]基因敲除是上世紀80年代發(fā)展起來的基于小鼠胚胎干細胞DNA同源重組原理的一項復雜的分子生物學技術，也成為“基因打靶”技術，20多年來，利用這項技術構建了數(shù)千種基因突變小鼠模型，這些基因工程小鼠不僅為生物學的研究帶來了飛越，也在醫(yī)學的發(fā)展和藥物研發(fā)中發(fā)揮了至關重要的作用。正因如此，發(fā)明此項技術的三位美英科學家聯(lián)名獲得了 2007年諾貝爾生理學/醫(yī)學獎。然后這項傳統(tǒng)的基因敲除方法雖然堪稱經(jīng)典，但因流程繁復、耗時長、費用大，幾年來備受科學界的關注和挑戰(zhàn)，大家都在尋找一種更快速、更經(jīng)濟且適用性強的新方法。
[0004]目前用來研究高血壓動物模型主要有以下幾種:1、慢性實驗性高血壓類型；2、神經(jīng)源性高血壓；3、腎源性高血壓；4、內分泌性高血壓。這些建立高血壓模型的方法大多要經(jīng)過外源性藥物或其它方法處理，甚至是通過手術手段，不能完全模擬人類的原發(fā)性高血壓，并且耗時長，成本高，而遺傳性的高血壓模型可以最大程度的模擬臨床上原發(fā)性的高血壓，也高有利于研究高血壓的發(fā)病機制，治療藥物靶點的設計。另外，遺傳性高血壓模型個體之間不存在手術操作或者藥物劑量導致的差異，其背景高度一致，可以作為新藥篩選的有用工具。
[0005]本發(fā)明所涉CRISPR/Cas9基因敲除技術是繼鋅指核酸酶、ES細胞打靶和TALEN等技術后可用于定點構建基因敲除鼠動物的第四種方法，在定向對基因進行修飾上展現(xiàn)出巨大的潛力。本發(fā)明基于CRISPR/Cas9基因敲除技術提供一種高血壓小鼠模型的構建方法，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明技術方案是一種便捷、耗時短、效果好的方法。


【發(fā)明內容】

[0006]針對現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種建立高血壓小鼠模型的方法及其用途，尤其是一種基于CRISPR/Cas9基因敲除技術建立高血壓小鼠模型的方法及其用途。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0008]本發(fā)明提供一種建立高血壓小鼠模型的方法，是基于CRISPR/Cas9基因敲除技術建立高血壓小鼠模型的方法，所述方法包括如下步驟:
[0009]步驟一、建立STK39基因敲除小鼠模型；
[0010]步驟二、高血壓小鼠動物模型的鑒定；
[0011]步驟三、高血壓小鼠動物模型的相關表型分析。
[0012]優(yōu)選地，步驟一中，所述建立STK39基因敲除小鼠模型，具體包括以下步驟:
[0013]A、CRISPR靶向修飾基因載體的構建；
[0014]B、小鼠促排卵和體外受精；
[0015]C、小鼠受精卵的顯微注射；
[0016]D、受精卵體外培養(yǎng)、植入受體及靶向基因修飾動物的培育。
[0017]優(yōu)選地，步驟二中，所述高血壓小鼠動物模型的鑒定包括:
[0018](I)頸椎脫臼法犧牲小鼠，提取Fl代雜合小鼠和野生對照小鼠的肝臟、骨骼肌、月旨肪、腎臟和脊髓總RNA ;逆轉錄成cDNA ;擴增目的基因，比較雜合子和野生對照小鼠的STK39
基因表達差異；
[0019](2)對CRISPR靶向位點進行DNA測序鑒定小鼠動物模型的基因型；
[0020](3)利用實時定量PCR檢測小鼠細胞中STK39基因mRNA水平的變化；
[0021](4)通過免疫熒光染色檢測小鼠細胞中STK39蛋白的缺失。
[0022]優(yōu)選地，步驟三中，所述高血壓小鼠動物模型的相關表型分析包括:
[0023]I)測量小鼠尾動脈壓；
[0024]2)通過小動物成像系統(tǒng)檢測小鼠的心功能；
[0025]3)用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中腎素、血管緊張素、醛固酮的濃度；
[0026]4)用肌張力儀測量小鼠阻力血管的收縮張力；
[0027]5)用尿素甘油膠電泳分析小鼠阻力血管中肌球蛋白調節(jié)輕鏈磷酸化；
[0028]6)尾靜脈注射高血壓藥物后檢測小鼠的尾動脈壓。
[0029]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0030](I)本發(fā)明采用CRISPR/Cas9基因敲除技術，具更高的靶向精確性；同時可可實現(xiàn)多位點同時敲除；
[0031](3)獲得突變小鼠的周期短，僅需2個月；
[0032](4)本方法無物種限制，也可在如大鼠等動物體進行操作從而獲得相應突變小鼠；
[0033](5)用本發(fā)明方法構建的小鼠具有顯著高于傳統(tǒng)方法的生殖系轉移能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為STK39敲除和對照組小鼠的血壓值；
[0035]圖2為STK39敲除后血管在各種刺激下的收縮張力變化，其中包括124mM氯化鉀溶液、1uM去甲腎上腺素(NE), 0.1uM內皮素(ETl)、1uM血管緊張素(AngII)、IuM加壓素(Vasopressin)、0.IuM 血檢素類似物(U46619)；
[0036]圖3為ELISA檢測的STK39敲除和對照組小鼠的血清中腎素(A)、血管緊張素⑶、醛固酮(C)的濃度。
[0037]圖4為STK39敲除和對照組小鼠的心功能參數(shù)；
[0038]圖5為利用STK39敲除小鼠檢測降壓藥藥效檢測實例；
[0039]其中，A為培哚普利片以1.2ug/g小鼠體重尾靜脈注射，連續(xù)五天注射期間小鼠的收縮壓變化出為苯磺酸氨氯地平片以1.5ug/g小鼠體重尾靜脈注射，連續(xù)五天注射期間小鼠的收縮壓變化。

【具體實施方式】
[0040]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0041]實施例1
[0042]本實施例涉及一種建立高血壓小鼠模型的方法，是基于CRISPR/Cas9基因敲除技術建立高血壓小鼠模型的方法，所述方法包括如下步驟:
[0043]步驟一、建立STK39基因敲除小鼠模型；
[0044]步驟二、高血壓小鼠動物模型的鑒定及相關表型分析；
[0045]步驟三、高血壓小鼠動物模型的能量代謝、胰島素、胰高血糖素評價。
[0046]步驟一中，所述建立STK39基因敲除小鼠模型，具體包括以下步驟:
[0047]A、CRISPR靶向修飾基因載體的構建；
[0048]B、小鼠促排卵和體外受精；
[0049]C、小鼠受精卵的顯微注射；
[0050]D、受精卵體外培養(yǎng)、植入受體及靶向基因修飾動物的培育。
[0051]步驟二中，所述高血壓小鼠動物模型的鑒定包括:
[0052](I)頸椎脫臼法犧牲小鼠，提取Fl代雜合小鼠和野生對照小鼠的肝臟、骨骼肌、月旨肪、腎臟和脊髓總RNA ;逆轉錄成cDNA ;擴增目的基因，比較雜合子和野生對照小鼠的STK39
基因表達差異；
[0053](2)對CRISPR靶向位點進行DNA測序鑒定小鼠動物模型的基因型；
[0054](3)利用實時定量PCR檢測小鼠細胞中STK39基因mRNA水平的變化；
[0055](4)通過免疫熒光染色檢測小鼠細胞中STK39蛋白的缺失。
[0056]實施例2相關表型分析
[0057]1、小鼠血壓的測量
[0058]將實施例1得到的小鼠，飼養(yǎng)到三到八個月可以用來進行血壓測量。本發(fā)明中采用的是尾動脈套管法測小鼠血壓，所用儀器為上海奧爾科特的無創(chuàng)血壓儀。在實驗數(shù)據(jù)采集之前，都要對實驗組和對照組小鼠進行為期五天的訓練，具體方法為，在每天上午十到十一點，每只小鼠置于32度恒溫箱中，連續(xù)測十到二十分鐘。待到小鼠血壓測量穩(wěn)定后開始采集數(shù)據(jù)，每只小鼠連續(xù)測五天，取平均值作為這只小鼠的血壓值，敲除組和對照組小鼠各測十只小鼠做統(tǒng)計，具體結果如圖1所示。
[0059]2、血管平滑肌張力測定
[0060]阻力血管的肌張力是通過丹麥DMT儀器公司的四通道肌張力儀記錄的，具體方法為:將小鼠的腸系膜二級血管從腸系膜結締組織中分離出來，剪成1.4毫米長的血管條，然后用兩根20微米直徑的細鋼絲穿入血管腔，用螺絲固定到連接著傳感器的組織浴槽中。然后將血管條以最放松的狀態(tài)在HEPES-Tyrode (H-T)生理溶液中平衡30分鐘，通過調節(jié)螺旋測微尺逐步將血管內壓調到體內10mmHg的張力狀態(tài)，作為初始張力。在調到基礎張力狀態(tài)后，平衡30分鐘，然后用124mM氯化鉀H-T溶液或者去甲腎上腺素，血管緊張素等激動劑刺激血管通過張力傳感器實時記錄血管收縮力，結果如圖2所示。
[0061]3、腎素血管緊張素系統(tǒng)測定
[0062]STK39敲除組和對照組的小鼠血清中的腎素、醛固酮、血管緊張素是通過商業(yè)化的ELSIA試劑盒檢測的。具體過程如下:首先從視網(wǎng)膜下毛細血管叢采血到加有抗凝劑EDTA的管中，1000g、4度離心15分鐘，取上清，分裝凍存于-80度冰箱。在做ELISA檢測時，將血清加到有腎素、醛固酮或者血管緊張素的96孔板中，孵育洗滌后用辣根過氧化物酶法顯色，用酶標儀在450nm波長下讀取光吸收值，根據(jù)標準曲線換算出每一個樣本中的腎素、醛固酮或者血管緊張素濃度，結果如圖3所示。
[0063]4、心功能檢測
[0064]小鼠的心功能參數(shù)是通過Vevo 770TM小動物超聲成像系統(tǒng)檢測的。將小鼠用阿佛汀麻醉后，置于37度加熱臺上，然后用RMV707B探頭檢測胸骨旁短軸切面M型超聲圖像。讀取M型超聲圖像測量左心室內經(jīng)切面，計算出射血分數(shù)、短軸收縮率、左心室內經(jīng)參數(shù)，結果如圖4所示。
[0065]5、部分高血壓藥物檢測
[0066]為了檢測降壓藥物的藥效，我們通過尾靜脈注射的方法將藥物注射到STK39敲除組和對照組的小鼠體內，然后測量血壓變化情況。經(jīng)過檢測的藥物有苯磺酸氨氯地平片，培哚普利片。其中，苯磺酸氨氯地平片在STK39敲除的小鼠中降壓效果不明顯，而培哚普利片可以使對照和敲除組的小鼠的血壓都降低，結果如圖5所示。
[0067]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質內容。
【權利要求】
1.一種建立高血壓小鼠模型的方法，是基于CRISPR/Cas9基因敲除技術建立高血壓小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 步驟一、建立STK39基因敲除小鼠模型； 步驟二、高血壓小鼠動物模型的鑒定； 步驟三、高血壓小鼠動物模型的相關表型分析。
2.根據(jù)權利要求1所述的建立高血壓小鼠模型的方法，其特征在于，步驟一中，所述建立STK39基因敲除小鼠模型，具體包括以下步驟: A、CRISPR靶向修飾基因載體的構建； B、小鼠促排卵和體外受精； C、小鼠受精卵的顯微注射； D、受精卵體外培養(yǎng)、植入受體及靶向基因修飾動物的培育。
3.根據(jù)權利要求1所述的建立高血壓小鼠模型的方法，其特征在于，步驟二中，所述高血壓小鼠動物模型的鑒定包括: (1)頸椎脫臼法犧牲小鼠，提取Fl代雜合小鼠和野生對照小鼠的肝臟、骨骼肌、脂肪、腎臟和脊髓總RNA ;逆轉錄成cDNA ;擴增目的基因，比較雜合子和野生對照小鼠的STK39基因表達差異； (2)對CRISPR靶向位點進行DNA測序鑒定小鼠動物模型的基因型； (3)利用實時定量PCR檢測小鼠細胞中STK39基因mRNA水平的變化； (4)通過免疫熒光染色檢測小鼠細胞中STK39蛋白的缺失。
4.根據(jù)權利要求1所述的建立高血壓小鼠模型的方法，其特征在于，步驟三中，所述高血壓小鼠動物模型的相關表型分析包括: 1)測量小鼠尾動脈壓； 2)通過小動物成像系統(tǒng)檢測小鼠的心功能； 3)用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中腎素、血管緊張素、醛固酮的濃度； 4)用肌張力儀測量小鼠阻力血管的收縮張力； 5)尾靜脈注射高血壓藥物后檢測小鼠的尾動脈壓。
5.一種根據(jù)權利要求1所述的建立高血壓小鼠模型的方法在高血壓疾病研究中的應用。
6.一種根據(jù)權利要求1所述的建立高血壓小鼠模型的方法在治療高血壓藥物篩選中的應用。
7.一種根據(jù)權利要求1所述的建立高血壓小鼠模型的方法在建立定點基因突變小鼠中的應用。
【文檔編號】A01K67/027GK104293831SQ201410510115
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權日:2014年9月28日
【發(fā)明者】馬孟 申請人:上海云舜生物技術有限公司