一種插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，依次包括以下步驟：（1）插田泡莖段的消毒和接種：取當(dāng)年抽出的插田泡新莖，剪成帶腋芽的中度木質(zhì)化莖段進(jìn)行接種；（2）叢生芽的誘導(dǎo)；（3）不定芽的增殖；（4）再生植株的生根培養(yǎng)；（5）煉苗移栽。在上述步驟中采用了不同成分及配比的培養(yǎng)基。采用本發(fā)明的方法，能夠快速地獲得插田泡植株，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。采用本發(fā)明方法，插田泡叢生芽的不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)92.5%，不定芽增殖倍數(shù)可達(dá)7.2，植株移栽成活率可達(dá)95%以上。
【專利說明】一種插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 插田泡OftzZw1S corea/ws Miq.)，又名大烏泡、烏沙莓、菜子泡、回頭龍、兩頭草、兩 頭忙等，為薔薇科懸鉤子屬落葉小喬木，分布于陜西、甘肅、江蘇、安徽、浙江、江西、河南、湖 北、四川及貴州等省。以果實(shí)、葉、根及莖、藤著地所生的不定根入藥。果性溫，味甘、酸，具補(bǔ) 腎固精功效，主治陽萎、遺精、遺尿，也作覆盆子入藥；根、不定根性涼，味苦，具調(diào)經(jīng)活血、止 血止痛功效，主治跌打損傷、骨折、月經(jīng)不調(diào)及外傷出血。葉性涼，味苦、澀，具祛風(fēng)明目，除 濕解毒之功效，主治風(fēng)眼流淚、風(fēng)濕痹痛和狗咬傷。除藥用外，果實(shí)可直接食用或釀酒。目 前同屬的一些種已有報道，但插田泡的組織培養(yǎng)和快速繁殖尚未見報道。
[0003] 同屬多種植物的組培快繁已有報道，但紅腺懸鉤子組織培養(yǎng)與快速繁殖的報道尚 未見。懸鉤子屬植物采用的基本培養(yǎng)基絕大部分為MS培養(yǎng)基或改良MS培養(yǎng)基，極少為其它 培養(yǎng)基，如裂葉懸鉤子采用的是改良NN69培養(yǎng)基。采的外植體主要為莖段，通過直接誘導(dǎo) 叢生芽或先誘導(dǎo)愈傷組織再分化的方式，而葉片、葉柄等主要采用的是直接誘導(dǎo)不定芽。莖 段直接誘導(dǎo)叢生芽的激素組合一般是6-BA和NAA的組合或6-BA和IBA的組合，也有6-BA 和NAA的組合誘導(dǎo)莖段產(chǎn)生愈傷組織并分化的報道(地被懸鉤子）；葉片直接產(chǎn)生不定芽主 要采用的是BA和IAA的組合、BA和NAA的組合、TDZ和NAA的組合及ZT和NAA的組合。生 根主要用的基本培養(yǎng)基是1/2濃度，主要采用的是NAA，還有采用IBA，也有采用NAA與IAA 混合使用，也有體外使用0.5 g/L IBA浸下再生根的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種成活率高，利 于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明之目的，采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：一種插田泡組織培養(yǎng)與快速 繁殖的方法，依次包括以下步驟： (1)插田泡莖段的消毒和接種 取當(dāng)年抽出的插田泡新莖，剪成帶腋芽的莖段，根據(jù)木質(zhì)化程度分成輕度、中度和高 度，先用刷子于自來水下輕柔刷洗，加入適量的洗潔精溶液浸泡2-4 min，用流水沖洗0.5 h 后，在超凈臺里將莖段轉(zhuǎn)入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用無菌水沖洗3次，浸入滴加有 5滴吐溫-80,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%的HgCl2溶液內(nèi)浸泡消毒11-17 min，然后用無菌水充分浸 洗3次，以正常的極性方向接種到添加有TDZ 0. 5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的WPM基本培養(yǎng)基 中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/L，瓊脂添加量為7.0 g/L，pH為5. 8-6.0,培養(yǎng)基事 先于121°C下高溫高壓滅菌20 min。接好外植體的培養(yǎng)基先置于黑暗中10 h，隨后光照培 養(yǎng)；培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25±1°C，每光照培養(yǎng)14 h后轉(zhuǎn)入黑暗中培養(yǎng)10 h ;光照強(qiáng)度 30-40 μ mol/ (m2 · s); (2) 叢生芽的誘導(dǎo) 選取新莖中的中度木質(zhì)化莖段，先用刷子于自來水下輕柔刷洗，加入適量的洗潔精溶 液浸泡2-4 min，用流水沖洗0. 5 h后，在超凈臺里將莖段轉(zhuǎn)入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用無菌水沖洗3次，浸入滴加有5滴吐溫-80的0. 1% HgCl2溶液內(nèi)浸泡消毒13-14 min，然后用無菌水充分浸洗3次，以正常的極性方向接種到添加有TDZ 0-2. 0 mg/L，6-BA 0-5. 0 mg/L，IAA 0-5. 0 mg/L，CH 0-1.0 mg/L的WPM基本培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中的蔗糖 添加量為30 g/L，瓊脂添加量為7 g/L，pH為5. 8-6. 0,培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓滅菌 20 min。接好外植體的培養(yǎng)基先置于黑暗中10 h，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為 (25±1)°C，光照時間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 yrnoVOn2 · s); (3) 不定芽的增殖 將上一步誘導(dǎo)獲得的不定芽叢切成2-3株不定芽的芽塊，接種到添加有TDZ 0-2. 0 mg/L，6-BA 0-5.0mg/L，IAA 0-5.0 mg/L，CH O-LO mg/L 的 WPM 基本培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為（25±1)°C，光照時間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 ymol/ (m2 · s); (4) 再生植株的生根培養(yǎng) 切取葉片嫩綠、生長旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到12. 5%-100% WPM，NAA 0-1.0 mg/L，IAA 0-2.0 mg/L，AC 0-2.0 mg的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加的蔗糖為10-50 g/L， 瓊脂添加量為7. 0 g/L，pH 5. 8-6. 0 ; (5) 煉苗移栽 待生根的組培苗的苗高長至5 cm以上，根長超過5 cm時，松開組培瓶的瓶蓋，往瓶中 注入少量清水，防止培養(yǎng)基干裂，但先不移開瓶蓋，12 h后半挪開瓶蓋，再過12 h，移走瓶 蓋，讓燈光直照再生植株培養(yǎng)2 d。然后小心地將培養(yǎng)基搗碎，拿出再生植株，用水小心將殘 留的瓊脂洗凈，將植株定植于珍珠巖，泥炭重量比為I :(1-5)的混合基質(zhì)中，澆透水并用 透明的聚乙烯塑料薄膜覆蓋以保溫保濕，室內(nèi)溫度控制在24-28°C之間。
[0006] 作為優(yōu)選方案：所述步驟（1)中接種的莖段為木質(zhì)化中度莖段，消毒時間為13-14 min〇
[0007] 作為優(yōu)選方案：所述步驟（2)中的WPM培養(yǎng)基添加有TDZ 0· 5 mg/L，6-BA 2. Omg/ L，IAA 0· 5 mg/L，CH 0·1-0. 2 mg/L。
[0008] 作為優(yōu)選方案：所述步驟（3)中WPM培養(yǎng)基添加有TDZ 0· 3 mg/L，6-BA I. 0 mg/ L，IAA I. 0 mg/L，CH 0·1-0. 2 mg/L。
[0009] 作為優(yōu)選方案：所述步驟（4)中的生根培養(yǎng)基為50-100%WPM，NAA 0. I mg/L，IAA 0. 2 mg/L，AC 0. I -Ο. 2 mg/L。
[0010] 作為優(yōu)選方案：所述步驟（5)中混合基質(zhì)的珍珠巖，泥炭重量比為I: 5。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的有益效果是：采用本發(fā)明的方法，能夠快速地獲得插 田泡植株，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。采用本發(fā)明方法，插田泡叢生芽的不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)92. 5%，不 定芽增殖倍數(shù)可達(dá)7. 2,植株移栽成活率可達(dá)95%以上。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例1 一種插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，依次包括以下步驟： (1)插田泡莖段的消毒和接種 取當(dāng)年抽出的插田泡新莖，剪成帶腋芽的莖段，選取木質(zhì)化程度為中度的莖段，先用牙 刷于自來水下輕柔刷洗，加入適量的洗潔精溶液浸泡2-4 min，用流水沖洗0.5 h后，在超凈 臺里將莖段轉(zhuǎn)入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用無菌水沖洗3次，浸入滴加有5滴吐溫-80 的0.1% HgCl2溶液內(nèi)浸泡消毒13-14 min，然后用無菌水充分浸洗3次，以正常的極性方 向接種到添加有TDZ 0. 5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的WPM基本培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添 加量為30 g/L，瓊脂添加量為7. 0 g/L，pH為5. 8-6. 0,培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓滅菌 20 min。接好外植體的培養(yǎng)基先置于黑暗中10 h，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為 (25±1)°C，光照時間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 μπι〇ν(πι2·8)。30 d后統(tǒng)計發(fā) 現(xiàn)，污染率低于10%，外植體成活率在80%以上。
[0013] 步驟（1)為預(yù)實(shí)驗(yàn)，用以選取最佳的叢生芽進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0014] (2)叢生芽的誘導(dǎo) 選取當(dāng)年抽出的新莖中的中度木質(zhì)化莖段，先用牙刷于自來水下輕柔刷洗，加入適量 的洗潔精溶液浸泡2-4 min，用流水沖洗0.5 h后，在超凈臺里將莖段轉(zhuǎn)入70%的酒精溶液 中浸泡2 min，用無菌水沖洗3次，浸入滴加有5滴吐溫-80的0. 1% HgCl2溶液內(nèi)浸泡消毒 13-14 min，然后用無菌水充分浸洗3次，以正常的極性方向接種到添加有TDZ 0.5 mg/L， 6-BA 2.0mg/L，IAA 0.5 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L的WPM基本培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中的蔗糖 添加量為30 g/L，瓊脂添加量為7 g/L，pH為5. 8-6. 0,培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓滅菌 20 min。接好外植體的培養(yǎng)基先置于黑暗中10 h，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為 (25±1)°C，光照時間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 μπι〇ν(πι2·8)。30 d后統(tǒng)計發(fā) 現(xiàn)，不定芽誘導(dǎo)率在92. 5%，不定芽數(shù)在5. 4,而且不定芽葉色濃綠，生長良好，株高和莖粗 適中。
[0015] (3)不定芽的增殖 將上一步誘導(dǎo)獲得的不定芽叢切成2-3株不定芽的芽塊，接種到添加有TDZ 0.3 mg/ L，6-BA 1.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L，CH 0.1-0. 2 mg/L 的 WPM 基本培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培 養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為（25±1)°C，光照時間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 ymol/ (m2 · s)。30 d后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，增殖倍數(shù)在7. 2,且無玻璃化苗，植株粗壯，且生長較快。
[0016] (4)再生植株的生根培養(yǎng) 切取葉片嫩綠、生長旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到50-100%WPM，NAA 0. I mg/L， IAA 0. 2 mg/L，AC 0. I -0. 2 mg/L的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加的蔗糖為10-50 g/L，瓊 脂添加量為7.0 g/L，pH 5. 8-6.0。30 d時統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，生根率在95%以上，根數(shù)4. 6根，根粗 適中，適于煉苗移栽。
[0017] 其中50-100%WPM指的是培養(yǎng)基中WPM基本培養(yǎng)基的濃度，其它物質(zhì)的濃度不受影 響。50% WPM就是指WPM基本培養(yǎng)基配方里的所有物質(zhì)用量為原來的1/2。
[0018] (5)煉苗移栽 待生根的組培苗的苗高長至5 cm以上，根長超過5 cm時，松開組培瓶的瓶蓋，往瓶中 注入少量清水，防止培養(yǎng)基干裂，但先不移開瓶蓋，12 h后半挪開瓶蓋，再過12 h，移走瓶 蓋，讓燈光直照再生植株培養(yǎng)2 d。然后小心地將培養(yǎng)基搗碎，拿出再生植株，用水小心將殘 留的瓊脂洗凈，將植株定植于珍珠巖，泥炭重量比為I: 5的混合基質(zhì)中，澆透水并用透明 的聚乙烯塑料薄膜覆蓋以保溫保濕，室內(nèi)溫度控制在24-28°C之間。待新葉長出，即可揭開 薄膜并葉面噴霧保持濕潤，適應(yīng)3-5 d后即可移栽大田中，移栽成活率可達(dá)95%以上。
[0019] 文中所涉及的縮略詞含義： AC活性炭 6-BA 6-芐氨基腺嘌呤 CH水解酪蛋白 IAA吲哚乙酸 NAA萘乙酸 TDZ噻苯?。撊~脲） 實(shí)施例2 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于步驟（1):插田泡莖段的消毒和接種：取當(dāng)年抽出的 插田泡新莖，剪成帶腋芽的莖段，根據(jù)木質(zhì)化程度分成輕度、中度和高度，先用牙刷于自來 水下輕柔刷洗，加入適量的洗潔精溶液浸泡2-4 min，用流水沖洗0.5 h后，在超凈臺里將 莖段轉(zhuǎn)入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用無菌水沖洗3次，浸入滴加有5滴吐溫-80的 0. 1% HgCl2溶液內(nèi)浸泡消毒11-17 min，然后用無菌水充分浸洗3次，以正常的極性方向 接種到添加有TDZ 0. 5 mg/L，6-BA 2. 0 mg/L的WPM基本培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添 加量為30 g/L，瓊脂添加量為7. 0 g/L，pH為5. 8-6. 0,培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓滅菌 20 min。接好外植體的培養(yǎng)基先置于黑暗中10 h，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為 (25±1)°C，光照時間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 μπι〇ν(πι2·8)。30 d后統(tǒng)計發(fā) 現(xiàn)，污染率低于10%，外植體成活率在80%以上，其中木質(zhì)化中度莖段〉木質(zhì)化輕度莖段〉木 質(zhì)化重度莖段，滴加有5滴吐溫-80的0. 1% HgCl2溶液內(nèi)浸泡消毒13-14 min為最佳消毒 時間，既消毒完全又不損傷外植體，無污染，外植體成活率達(dá)95%。
[0020] 表1不同部位取材的外植體和消毒時間對污染率和成9活率的影響

【權(quán)利要求】
1. 一種插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于依次包括以下步驟： (1) 插田泡莖段的消毒和接種 取當(dāng)年抽出的插田泡新莖，剪成帶腋芽的莖段，根據(jù)木質(zhì)化程度分成輕度、中度和高 度，先用刷子于自來水下輕柔刷洗，加入適量的洗潔精溶液浸泡2-4 min，用流水沖洗0.5 h 后，在超凈臺里將莖段轉(zhuǎn)入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用無菌水沖洗3次，浸入滴加有5 滴吐溫-80,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的取(：12溶液內(nèi)浸泡消毒11-17 min，然后用無菌水充分浸洗 3次，以正常的極性方向接種到添加有TDZ 0. 5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的WPM基本培養(yǎng)基中， 該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/L，瓊脂添加量為7.0 g/L，pH為5. 8-6.0,培養(yǎng)基事先于 121°C下高溫高壓滅菌20 min ;接好外植體的培養(yǎng)基先置于黑暗中10 h，隨后光照培養(yǎng)；培 養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25±1°C，每光照培養(yǎng)14 h后轉(zhuǎn)入黑暗中培養(yǎng)10 h;光照強(qiáng)度30-40 μ mol/ (m2 · s)； (2) 叢生芽的誘導(dǎo) 選取新莖中的中度木質(zhì)化莖段，先用刷子于自來水下輕柔刷洗，加入適量的洗潔精溶 液浸泡2-4 min，用流水沖洗0. 5 h后，在超凈臺里將莖段轉(zhuǎn)入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用無菌水沖洗3次，浸入滴加有5滴吐溫-80的0. 1% HgCl2溶液內(nèi)浸泡消毒13-14 min，然后用無菌水充分浸洗3次，以正常的極性方向接種到添加有TDZ 0-2. 0 mg/L，6-BA 0-5. 0 mg/L，IAA 0-5. 0 mg/L，CH 0-1.0 mg/L的WPM基本培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中的蔗糖 添加量為30 g/L，瓊脂添加量為7 g/L，pH為5. 8-6. 0,培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓滅菌 20 min;接好外植體的培養(yǎng)基先置于黑暗中10 h，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為 (25±1)°C，光照時間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 ymoVOn2 · s); (3) 不定芽的增殖 將上一步誘導(dǎo)獲得的不定芽叢切成2-3株不定芽的芽塊，接種到添加有TDZ 0-2. 0 mg/L，6-BA 0-5. Omg/L，IAA 0-5.0 mg/L，CH 0-1.0 mg/L 的 WPM 基本培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為（25±1)°C，光照時間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 μ mol/ (m2 · s); (4) 再生植株的生根培養(yǎng) 切取葉片嫩綠、生長旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到12. 5%-100% WPM，NAA 0-1.0 mg/L，IAA 0-2.0 mg/L，AC 0-2.0 mg的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加的蔗糖為10-50 g/L， 瓊脂添加量為7. 0 g/L，pH 5. 8-6. 0 ; (5) 煉苗移栽 待生根的組培苗的苗高長至5 cm以上，根長超過5 cm時，松開組培瓶的瓶蓋，往瓶中 注入少量清水，防止培養(yǎng)基干裂，但先不移開瓶蓋，12 h后半挪開瓶蓋，再過12 h，移走瓶 蓋，讓燈光直照再生植株培養(yǎng)2 d ;然后小心地將培養(yǎng)基搗碎，拿出再生植株，用水小心將殘 留的瓊脂洗凈，將植株定植于珍珠巖，泥炭重量比為1 :(1-5)的混合基質(zhì)中，澆透水并用 透明的聚乙烯塑料薄膜覆蓋以保溫保濕，室內(nèi)溫度控制在24-28°C之間。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于：所述 步驟（1)中接種的莖段為木質(zhì)化中度莖段，消毒時間為13-14 min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于：所述 步驟（2)中的 WPM 培養(yǎng)基添加有 TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0mg/L，IAA 0.5 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/Lo
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于：所述 步驟（3)中WPM培養(yǎng)基添加有TDZ 0.3 mg/L，6-BA 1.0 mg/L，IM 1.0 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于：所述 步驟（4)中的生根培養(yǎng)基為 50-100%WPM，NAA 0· 1 mg/L，IAA 0· 2 mg/L，AC 0· 1 -0· 2 mg/ L〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種插田泡組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于：所述 步驟（5)中混合基質(zhì)的珍珠巖，泥炭重量比為1: 5。
【文檔編號】A01H4/00GK104221865SQ201410510772
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】孫駿威, 朱誠, 王飛娟, 江瓊, 丁艷菲, 蔡沖 申請人:中國計量學(xué)院