一種濕地松松針提取物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種濕地松松針提取物，其通過如下方法制備：取新鮮濕地松松針用剪刀剪成2～3cm長，然后用高速粉碎機(jī)粉碎，取粉碎松針，以粉碎松針與水的比為1∶(10～12)加入水提取24～26h，然后用尼龍紗布過濾除去殘?jiān)?，接著用真空泵進(jìn)行抽濾，得到松針提取物原液，所述松針提取物原液利用透析純化得到具不同分子量范圍的濕地松針提取物。所述濕地松松針的提取物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中可以用來有效的抑制和殺滅青苔，改良水質(zhì)，并且對環(huán)境和其他的水生生物無毒無害，無殘留，無污染，不僅解決了水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治青苔的難題，也開發(fā)了松針新的應(yīng)用價(jià)值和前景。
【專利說明】一種濕地松松針提取物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，涉及河蟹養(yǎng)殖池塘青苔的殺滅【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種濕地松松針提取物及其在青苔殺滅領(lǐng)域中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]濕地松為松科常綠喬木，該樹種具有適應(yīng)性強(qiáng)、前期生長快和松脂產(chǎn)量高等特點(diǎn)。研究表明，濕地松松針中含有大量揮發(fā)油、色素、纖維素、氨基酸、黃酮類等化合物，其中游離的氨基酸多達(dá)18種，富含人類必需的8種氨基酸，維生素比一般的水果蔬菜高出數(shù)倍甚至數(shù)十倍，此外還含有鈣、磷、鐵、錳等多種微量元素。濕地松松針提取物也有很強(qiáng)的藥用價(jià)值，如消炎、降血脂、降血壓、抑菌、抗衰老、抗癌等，已被學(xué)術(shù)界認(rèn)可并且逐漸受到重視。據(jù)報(bào)道，松針還可用來制作優(yōu)質(zhì)的綠色畜禽飼料，禽蛋保藏中用來抗菌保鮮。
[0003]青苔是水體中藻類過度繁殖的產(chǎn)物，大量青苔生長破壞了水體藻相平衡，嚴(yán)重的破壞水質(zhì)，因此池塘里過量的青苔對水產(chǎn)養(yǎng)殖危害非常大，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。而目前采用的青苔殺滅技術(shù)有物理法、化學(xué)法、生物法等。使用物理法費(fèi)時(shí)費(fèi)力；使用化學(xué)法有撲草凈粉、硫酸銅等，對環(huán)境污染大，有殘留，不安全；使用生物法如微生態(tài)制劑等成本高，效果甚微。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種濕地松松針提取物及其應(yīng)用，通過提取濕地松松針的水溶性提取物并將其應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中，發(fā)現(xiàn)松針提取物對池塘青苔具有優(yōu)異的殺滅作用。
[0005]技術(shù)方案:本發(fā)明一種濕地松松針提取物，所述松針提取物通過如下方法制備:取新鮮濕地松松針用剪刀剪成2?3cm長，然后用高速粉碎機(jī)粉碎，取粉碎松針，以粉碎松針與水的比為1: (10?12)加入水提取24?26h，然后用尼龍紗布過濾除去殘?jiān)?，接著用真空泵進(jìn)行抽濾，得到松針提取物原液，所述松針提取物原液利用透析純化得到具不同分子量范圍的濕地松針提取物。
[0006]本發(fā)明進(jìn)一步提出了上述的濕地松松針提取物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治青苔的應(yīng)用。
[0007]優(yōu)選地，所述的濕地松針提取物利用透析得到分子量小于等于10KD的組分，將具有該分子量范圍的濕地松針提取物用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中青苔的防止。
[0008]更為優(yōu)選地，分子量小于等于1KD或3KD?10KD的濕地松針提取物具有跟優(yōu)異的抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖中青苔的效果。
[0009]本發(fā)明還進(jìn)一步提出了上述的濕地松針提取物的乙醇浸提物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治青苔的應(yīng)用。
[0010]優(yōu)選地，上述的濕地松針提取物的乙醇浸提物在使用時(shí)稀釋到1/12倍?1/2倍。
[0011]具體地，所述的濕地松針提取物的乙醇浸提物通過如下方法制備:
[0012]利用裝載有2/3吸附柱體積的AB-8樹脂的吸附柱分別吸附所述不同截留分子量的松針提取物，然后用6倍吸附柱體積的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，分別收集各倍段體積的洗脫液并分別濃縮；將濃縮后的洗脫液分別用IKD分子截留量透析袋進(jìn)行流動(dòng)水透析24h得到不同洗脫倍段的濕地松針提取物的乙醇浸提物。
[0013]優(yōu)選地，所述的乙醇的濃度為20wt %?95wt %，優(yōu)選地，所述乙醇的濃度為40wt % ?70wt % 或 70wt % ?95wt %。
[0014]有益效果:本發(fā)明提供了一種濕地松松針的提取物，研究發(fā)現(xiàn)，所述濕地松松針的提取物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中可以用來有效的抑制和殺滅青苔，改良水質(zhì)，并且對環(huán)境和其他的水生生物無毒無害，無殘留，無污染，不僅解決了水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治青苔的難題，也開發(fā)了松針新的應(yīng)用價(jià)值和前景，同時(shí)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，上述濕地松松針的乙醇浸提液同樣具有優(yōu)異的抑制和殺滅青苔的作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為不同分子量松針提取液對青苔的抑制作用結(jié)果(培養(yǎng)48h)；
[0016]圖2為不同溶劑洗脫的松針提取液對青苔抑制作用結(jié)果(培養(yǎng)48h)，其中BV表示倍段體積；
[0017]圖3為乙醇洗脫松針提取液液不同稀釋倍數(shù)對青苔抑制作用結(jié)果(培養(yǎng)48h)；
[0018]圖4為不同濃度乙醇洗脫松針提取液對青苔抑制作用結(jié)果(72h)；
[0019]圖5為不同洗脫體積乙醇洗脫松針提取液對青苔抑制作用結(jié)果(70%乙醇培養(yǎng)72h)。

【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明所使用的試驗(yàn)材料和儀器如下:
[0021]試驗(yàn)材料:濕地松松針采江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)博園，青苔采撈于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院池塘；乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純；AB-8大孔吸附樹脂，勾玉鄭州市勤實(shí)科技有限公司；透析袋(分子截留量1KD)、透析袋(分子截留量3KD)、透析袋(分子截留量10KD)。
[0022]儀器:HY-02高速粉碎機(jī)，北京市環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司；SHZ_D循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電子萬用爐，天津市泰斯特儀器有限公司；砂芯層析交換柱。
[0023]實(shí)施例1不同分子量的濕地松松針提取物松對青苔的抑制作用。
[0024](I)制備原液
[0025]取新鮮濕地松松針用剪刀剪成2?3cm長，然后用高速粉碎機(jī)粉碎，取粉碎松針10g,以料液比1: 10的比例分別加入自來水提取24h，然后用尼龍紗布過濾除去殘?jiān)?，用真空泵進(jìn)行抽濾，得到樣品為原液。
[0026](2) IKD分子量截留透析
[0027]用IKD分子量截留透析袋取濕地松的自來水提取液(原液)200mL(防止透析外液濃度過低)置于100mL燒杯中進(jìn)行透析，透析12h后取出透析外液(小于IKD成分)置于4°C冰箱中保存。再加入500mL蒸餾水繼續(xù)透析，4h后更換蒸餾水，并重復(fù)3?5次，使透析袋內(nèi)小于IKD的成分透析完全，保留透析內(nèi)液，即得到截留分子量大于IKD的成分。
[0028](3) 3KD分子量截留透析
[0029]用3KD分子量截留透析袋對1KD分子量截留透析后的透析袋內(nèi)液置于1000mL燒杯中進(jìn)行透析，透析12h后取出透析外液(大于1KD小于3KD成分)置于4°C冰箱中保存。再加入500mL蒸餾水繼續(xù)透析，4h后更換蒸餾水，并重復(fù)3?5次，使透析袋內(nèi)小于3KD的成分透析完全，保留透析袋內(nèi)液，即為大于3KD的成分。
[0030](4) 10KD分子量截留透析
[0031]用10KD分子量截留透析袋對3KD分子量截留后的透析內(nèi)液置于1000mL燒杯中進(jìn)行透析，透析12h后取出透析外液(大于3KD小于10KD成分)置于4°C冰箱中保存。再加入500mL蒸餾水繼續(xù)透析，4h后更換蒸餾水，并重復(fù)3?5次，使透析袋內(nèi)小于10KD的成分透析完全，保留透析袋內(nèi)液，即為大于10KD的成分。
[0032](5)青苔培養(yǎng)
[0033](1)?(4)中收集的不同范圍截留分子量的透析液均旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至200mL并分別放置于200mL培養(yǎng)瓶中，對照組200mL河水，分別加2g青苔，陽光下培養(yǎng)，觀察現(xiàn)象。結(jié)果如圖1所示，青苔培養(yǎng)24h時(shí)對照液為清翠色伴有淡淡的魚腥味，其他透析液顏色均為深色；48h時(shí)3KD?1KD段顏色為黑色，且有魚腥味，1KD?3KD、大于10KD顏色加深變黑，但內(nèi)有氣泡；72h時(shí)3KD?10KD段顏色為黑色，且有腥臭味，1KD?3KD、大于10KD顏色加深變黑，但仍有氣泡，小于1KD的顏色淡黃；96h時(shí)3KD?10KD段黑色，惡臭味，小于1KD顏色也變深，有腥臭味，1KD?3KD段顏色變黑，有少量氣泡，大于10KD段也有少量氣泡。
[0034]通過比較不同分子量對青苔的抑制作用發(fā)現(xiàn)，分子量小于10KD的松針成分對青苔具有抑制作用，尤其是小于1KD和3KD?10KD段抑制效果最好。
[0035]實(shí)施例2不同濃度NaCl洗脫的松針提取液對青苔抑制作用。
[0036](1)樹脂的預(yù)處理
[0037]取1支250mL離子交換柱裝AB-8樹脂，柱內(nèi)裝入約2/3體積的樹脂，再于吸附柱內(nèi)加入相當(dāng)于裝填樹脂體積0.4?0.5倍體積的乙醇，浸泡樹脂24h。用去離子水將乙醇洗凈后，用3%的鹽酸浸泡2h，去離子水將樹脂洗至中性；再用3%的氫氧化鈉溶液浸泡2h，去離子水洗至中性待用。
[0038](2)穿透液的制備
[0039]取新鮮濕地松松針用剪刀剪成2?3cm長，然后用高速粉碎機(jī)粉碎，取粉碎松針100g，以料液比1: 10的比例分別加入自來水提取24h，然后用尼龍紗布過濾除去殘?jiān)?，用真空泵進(jìn)行抽濾，得到樣品為原液，約1000mL。從上述原液中取200mL用1KD分子量截留透析于流動(dòng)水中透析24h，再取透析內(nèi)液用10KD分子量截留的透析袋透析于1000mL燒杯中透析24h，濃縮透析液至200mL，得到濃縮液樣品穿透液(即分子量大于1KD小于10KD透析液的濃縮液)。
[0040](3)上樣吸附
[0041]取處理好的樹脂柱，加入步驟(3)中濃縮液樣品穿透液200mL于吸附柱內(nèi)，靜置約15min使其充分吸附然后后打開開關(guān)，控制流速大約為3ml/min，使吸附液慢慢流出吸附柱，進(jìn)行2次過柱，用燒杯接取流出液為穿透液。
[0042](4)洗脫
[0043]分別按下述步驟完成10種洗脫處理:
[0044]①用1200mL自來水進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對2.5-5倍段(圖中標(biāo)記為2.5-5BV，下文類似)500mL洗脫液收集(即從500mL?100mL段，下文類似)，并保留。
[0045]②用1200mL0.5 % NaCl溶液進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對
2.5-5 (2.5-5BV)倍段500mL洗脫液收集，并保留。
[0046]③用1200mLl % NaCl溶液進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對2.5-5 (2.5-5BV)倍段500mL洗脫液收集，并保留
[0047]④用1600mL4% NaCl溶液進(jìn)行8倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對2.5-5 (2.5-5BV)倍段 500mL 和 5-6 倍段(5-6BV) 200mL、6_7 倍段(6-7BV) 200mL、7_8 倍段(7-8BV) 200LmL 洗脫液收集，并保留。
[0048]⑤用1200LmL6 % NaCl溶液進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對每一倍段體積200mL 洗脫液收集，并保留，分別為 0-1BV、1-2BV、2-3BV、3-4BV、4-5BV、5-6BV。
[0049]⑥用1200mL8 % NaCl溶液進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對2.5-5倍段(2.5-5BV) 500mL洗脫液收集，并保留。
[0050]⑦用1200mL10 % NaCl溶液進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對2.5-5 (2.5-5BV)倍段500mL洗脫液收集，并保留。
[0051 ] ⑧用1200mL95 %乙醇進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對2.5-5倍段(2.5-5BV) 500mL洗脫液收集，并保留。
[0052]⑨用1600mL蒸餾水進(jìn)行8倍體積洗脫樹脂柱，以便樹脂的回收利用。
[0053]⑩用1200mL(4)中的穿透液進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對2.5_5倍段500mL洗脫液收集，并保留
[0054](5)濃縮
[0055]對步驟(4)中各組中收集到的洗脫液分別濃縮至200mL。
[0056](6)透析
[0057]對所有步驟(5)中的200mL的濃縮洗脫液用IKD分子截留量透析袋進(jìn)行流動(dòng)水24h脫鹽透析，將各個(gè)透析袋內(nèi)的NaCl洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至體積為200mL用于青苔培養(yǎng)。
[0058](7)青苔培養(yǎng)
[0059]取(6)中得到的所有透析后的NaCl洗脫液各200mL置于培養(yǎng)瓶中和，以及透析后的95%乙醇洗脫液濃縮至200mL后再用95%乙醇分別稀釋到1/2倍、1/4倍、1/6倍、1/8倍、1/12倍，體積均為200mL，另取200mL河水做對照，每個(gè)燒杯中加2g青苔。觀察其現(xiàn)象。
[0060]結(jié)果如圖2所示，青苔培養(yǎng)24h時(shí)，95%乙醇洗脫液對苔蘚有著明顯的抑制作用，蒸餾水洗脫液和NaCl溶液洗脫液對苔蘚無抑制作用；48h時(shí)95%乙醇洗脫液稀釋1/2倍、1/4倍、1/6倍灰色，有腥臭味；96h時(shí)95 %乙醇洗脫液1/2倍、1/4倍、1/6倍抑制效果最好，有腥臭味，他無明顯變化。結(jié)果表明，蒸餾水、NaCl溶液洗脫液對苔蘚無抑制作用，95%乙醇洗脫液對苔蘚有抑制作用。95%乙醇洗脫液稀釋1/2倍、1/4倍、1/6倍對苔蘚具有明顯的抑制作用，顏色變深，且有腥臭味，95%乙醇洗脫液稀釋1/8倍、1/12倍效果比較差，如圖3所示。
[0061]實(shí)施例3不同濃度乙醇洗脫的松針提取液對青苔抑制作用。
[0062](I)樹脂的預(yù)處理
[0063]取I支250mL離子交換柱裝AB-8樹脂，柱內(nèi)內(nèi)裝入約2/3體積的樹脂，再于吸附柱內(nèi)加入相當(dāng)于裝填樹脂體積0.4?0.5倍體積的乙醇，浸泡樹脂24h。用去離子水將乙醇洗凈后，用3%的鹽酸浸泡2h，去離子水將樹脂洗至中性；再用3%的氫氧化鈉溶液浸泡2h，去離子水洗至中性待用。
[0064](2)穿透液的制備
[0065]取新鮮濕地松松針用剪刀剪成2?3cm長，然后用高速粉碎機(jī)粉碎，取粉碎松針100g，以料液比1: 10的比例分別加入自來水提取24h，然后用尼龍紗布過濾除去殘?jiān)谜婵毡眠M(jìn)行抽濾，得到樣品為原液。取原液200mL用1KD分子量截留透析袋流動(dòng)水中透析24h，再取透析內(nèi)液用10KD分子量截留透析袋1000mL燒杯中透析24h，濃縮透析液至200mL，為濃縮液樣品穿透液，即分子量為1KD?10KD的濃縮液。
[0066](3)上樣吸附
[0067]取處理好的樹脂柱，加入樣品200mL于吸附柱內(nèi)，靜置約15min使其充分吸附然后打開開關(guān)，控制流速大約為3mL/min，使吸附液慢慢流出吸附柱，進(jìn)行2次過柱，用燒杯接取流出液為穿透液
[0068](4)洗脫
[0069]分別按下述步驟完成7種洗脫處理:
[0070]①用1200mL10 % NaCl溶液進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對每一倍段體積200mL洗脫液收集，并保留。
[0071 ] ②用1600mL蒸餾水進(jìn)行8倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對每一倍段體積200mL洗脫液收集，并保留。
[0072]③用1200mL20 %乙醇進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對每一倍段體積200mL洗脫液收集，并保留。
[0073]④用1200mL40 %乙醇進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對每一倍段體積200mL洗脫液收集，并保留。
[0074]⑤用1200mL70 %乙醇進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對每一倍段體積200mL洗脫液收集，并保留。
[0075]⑥用1200mL95 %乙醇進(jìn)行6倍體積洗脫樹脂柱，并用燒杯對每一倍段體積200mL洗脫液收集，并保留。
[0076]⑦用1600mL蒸餾水進(jìn)行8倍體積洗脫樹脂柱，以便樹脂的回收利用。
[0077](5)透析
[0078]對步驟(4)中各組所有收集的洗脫液濃縮至200mL后選擇1KD分子量截留透析袋流動(dòng)水透析24h，然后分別將透析袋內(nèi)的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至200mL。
[0079](6)青苔培養(yǎng)
[0080]取(5)中所有透析后的洗脫液各200mL于培養(yǎng)瓶中，加2g青苔，并做對照。觀察其現(xiàn)象，結(jié)果如圖4至圖5所示。
[0081]結(jié)果表明，用20%、40%、70%、95% 4種不同濃度的乙醇洗脫大孔樹脂吸附的松針提取液，其中40 %?70 %與70 %?95 %乙醇洗脫液對苔蘚的抑制有非常明顯的效果，顏色很深，并有腥臭味，如圖4所示。結(jié)果表明，40 %?70 %與70 %?95 %乙醇洗脫液對苔蘚有抑制效果。
[0082]如圖5 所示，青苔培養(yǎng) 72h 時(shí)，70% 乙醇 0-1 倍段(0-1BV)、2-3BV、3_4BV、4_5BV，95%乙醇0-lBV、l-2BV、2-3BV、3-4BV、4-5BV都有顯著地顏色變化，其他洗脫液無明顯變化。同時(shí)，觀察發(fā)現(xiàn)，96h 時(shí) 70% 乙醇 0-18￥、2-38￥、3-48￥、4-58￥、5-68￥，95%乙醇 0-1BV、1-2BV、2-3BV、3-4BV、4-5BV、5-6BV顏色變黑，并有淡淡的臭水味，其他洗脫液無明顯變化。結(jié)果表明，40% -70%乙醇0-lBV、2-3BV、3-4BV、4-5BV、5-6BV洗脫松針提取液對青苔有明顯的抑制效果。70% -95%乙醇洗脫松針提取液0-6BV對青苔有抑制作用。
[0083] 綜上所述，松針有效成分分子量IKD?1KD對青苔有抑制作用，且分子量在3KD?1KD抑制效果最好；乙醇洗脫液原液至1/6倍對苔蘚具有明顯的抑制作用；40% -95%乙醇洗脫松針提取液對苔有明顯的抑制作用；40%?70%乙醇2?6BV洗脫液與70%?95wt%乙醇洗脫松針提取液O?6BV對青苔有明顯的抑制作用。
【權(quán)利要求】
1.一種濕地松松針提取物，其特征在于，所述松針提取物通過如下方法制備:取新鮮濕地松松針用剪刀剪成2?3(3111長，然后用高速粉碎機(jī)粉碎，取粉碎松針，以粉碎松針與水的比為1: (10?12)加入水提取24?261！，然后用尼龍紗布過濾除去殘?jiān)?，接著用真空泵進(jìn)行抽濾，得到松針提取物原液，所述松針提取物原液利用透析純化得到具不同分子量范圍的濕地松針提取物。
2.權(quán)利要求1所述的濕地松松針提取物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治青苔的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的濕地松針提取物的分子量小于等于 10X0。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的濕地松針提取物的分子量小于等于 11(0 或 31(0 ?10X0。
5.權(quán)利要求1所述的濕地松針提取物的乙醇浸提物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治青苔的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的濕地松針提取物的乙醇浸提物在使用時(shí)稀釋到1/12倍?1/2倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的濕地松針提取物的乙醇浸提物通過如下方法制備: 利用裝載有2/3吸附柱體積的八8-8樹脂的吸附柱分別吸附所述不同截留分子量的松針提取物，然后用6倍吸附柱體積的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，分別收集各倍段體積的洗脫液并分別濃縮；將濃縮后的洗脫液分別用1X0分子截留量透析袋進(jìn)行流動(dòng)水透析2處得到不同洗脫倍段的濕地松針提取物的乙醇浸提物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的乙醇的濃度為20被％?95被
【文檔編號】A01N65/06GK104365680SQ201410510937
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】趙明珍, 王會(huì)聰, 張萍, 凡軍民, 陸靜, 萬啟俊 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院