一種添加中藥單體的人精液冷凍保護劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供過一種添加中藥單體的人精液冷凍保護劑，所述冷凍保護劑包括中藥單體和人精液基礎冷凍保護劑，其中，所述中藥單體為金絲桃苷或淫羊藿苷。通過將中藥單體金絲桃苷、淫羊藿苷添加到常用的基礎精液冷凍保護劑中并篩選中藥單體與基礎精液冷凍保護劑的配比關系，制備出性能優(yōu)異的人精液冷凍保護劑，配合快速冷凍和快速解凍的方法，可以獲得優(yōu)異的精液保存效果，同時，本發(fā)明為中藥單體在精液冷凍保護劑中的應用開辟了新的篇章，不僅證實了中藥單體作為添加入加入到精液冷凍保護劑中可以有效地改善精子的保存效果，同時也建立了一套完整的、容易被國際認可的適合人少弱精的冷凍系統(tǒng)，解決了少弱精冷凍這一疑難問題。
【專利說明】一種添加中藥單體的人精液冷凍保護劑

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于人精液冷凍保護劑【技術領域】，具體地涉及一種添加中藥單體的人精液 冷凍保護劑。

【背景技術】
[0002] 精液冷凍保存技術已有200多年的歷史。人的精液冷凍保存可以追溯到20世紀 40年代末。目前，精液冷凍保存在我國主要應用于人類精子庫以及生育能力的保存。國內 外研究者通過幾十年對精液冷凍程序、冷凍稀釋液、解凍液等的篩選，已經建立了較為成熟 的精液冷凍保存體系。全國各生殖中心對人精液冷凍保護劑的需求量比較大，而市場上人 精液冷凍保存劑幾乎全部被國外的生物公司所壟斷，國內只有部分科研院所自行配置畜禽 精液冷凍保護劑。國內還沒有自行開發(fā)的人類精液冷凍保護劑應用于臨床，并且現(xiàn)有的商 品化的人類精液冷凍保存系統(tǒng)適合于人的正常精液，對少弱精的保存效果并不理想。
[0003] 我們前期的研究證明通過對少弱精患者進行精液冷凍保存，可以獲得盡可能多的 處理后活動精子總數(shù)（PTMS)，并應用于宮腔內人工授精（in)，使更多的患者可以接受IUI 技術的治療，可以減少患者的治療費用，讓不孕不育患者以最小的代價獲得妊娠。但隨著臨 床經驗的積累，我們發(fā)現(xiàn)市場上已有的多種精液冷凍保護劑對于少弱精患者的精液冷凍效 果均較差。2009年底出版的WHO《第五版人類精液分析與處理實驗室手冊》首次單獨列出 一個章節(jié)論述精液冷凍的標準化流程，也提到了少弱精的冷凍保護劑的特殊性，說明少弱 精的冷凍保存已經引起了國內外專家的重視，但目前對于適用于少弱精的新型冷凍保護劑 缺乏系統(tǒng)的研究，特別是針對添加中草藥成分的效用研究甚少。
[0004] 在精液冷凍保存中冷凍保護劑（CPM)是人精子超低溫貯存成功與否的關鍵。CPM 根據其主要成份和緩沖特點可分為三大類型：單一甘油型、甘油復合型和無甘油型。在精 液的冷凍過程中，最重要的低溫保護劑是甘油。甘油可以滲入細胞內，濃縮或結合胞內水 分，而且甘油也有稀釋作用，能降低溶液中鹽的濃度和冷凍液的滲透壓，從而發(fā)揮其低溫下 對精子的保護作用，但甘油對精子有毒害作用。另外冷凍方法也是影響人類精子凍貯后效 果的主要因素。目前人類精液的冷凍方法有多種，包括一步凍貯法、分步凍貯法及微機控制 程序降溫法等。歸納起來可以分為速凍和緩凍法兩大類。自從出現(xiàn)最簡單的精液稀釋液和 解凍液（保護液）以來，其設計理論和藥物組成已經形成了較為統(tǒng)一的模式，即高純度的溶 劑和化學純以上的藥物合成。冷凍精液成功的應用以后，從凍前處理到冷凍-解凍，以及為 了提高妊娠率等不同目的，又在原有成分的基礎上，添加了更多種類的"特殊"成分，如咖啡 因、八1?、6511、854、酶類、維生素、激素、微量元素及抗凍蛋白等，對"特殊活性"及"特殊作用" 的因果追求，已成為當今國內外精子保護劑的研究中心。
[0005] 多年的臨床實踐證明中醫(yī)藥治療少弱精可以明顯改善患者精子質量，有一定療 效。研究發(fā)現(xiàn)菟絲子的水煎劑對人精子的運動功能和膜功能有明顯的促進作用，菟絲子可 能有益于治療男性不育，并可能有助于提高人工授精的成功率。在豬和牛顆粒凍精研究中 表明中藥提取液在冷凍-解凍過程中可以有效保護精子，提高精子的生存質量和受精潛 能。上述水煎劑雖然起到了一定的效果，但由于中藥提取液成分復雜，難以受到國際認可， 因此尋求單一中藥劑方用于精子冷凍保護劑是本領域需要解決的技術難題。


【發(fā)明內容】

[0006] 發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種添加中藥單體的人精 液冷凍保護劑，其可以有效地保存人精液，特別是對于人少弱精也具有優(yōu)異的保存效果。
[0007] 技術方案：為實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明提出一種添加中藥單體的人精液冷凍保 護劑，所述冷凍保護劑包括中藥單體和人精液基礎冷凍保護劑，其中，所述中藥單體為金絲 桃苷或淫羊藿苷。更為優(yōu)選地，所述冷凍保護劑僅僅包括中藥單體金絲桃苷和人精液基礎 冷凍保護劑；或者所述冷凍保護劑僅僅包括重要單體淫羊藿苷和人精液基礎冷凍保護劑。
[0008] 優(yōu)選地，所述的中藥單體與人精液基礎冷凍保護劑的質量體積比為0. 2?2. Ong/ ml 〇
[0009] 具體地，所述的人精液基礎冷凍保護劑為TGG基礎液。其他用于人精液冷凍保護 的人精液冷凍保護劑也同樣適用。
[0010] 本發(fā)明還提出了上述添加中藥單體的人精液冷凍保護劑在人精液冷凍保護中的 應用，在使用時，將人精液與所述添加中藥單體的人精液冷凍保護劑以體積比I : (1?2) 混合后利用快速冷凍和快速解凍法對精液進行冷凍保存。
[0011] 基于上述研究，本發(fā)明進一步提出了中藥單體在制備用于人正常精液冷凍保存的 精液冷凍保護劑尤其是制備用于人少弱精子的精液保護劑中的應用，其中，所述的中藥單 體為金絲桃苷或淫羊藿苷。
[0012] 菟絲子是一種生理構造特別的寄生植物，其組成的細胞中沒有葉綠體，利用爬藤 狀構造攀附在其他植物，并且從接觸宿主的部位伸出尖刺，戳入宿主直達韌皮部，吸取養(yǎng)分 以維生，更進一步還會儲存成淀粉粒于組織中。中藥菟絲子為雙子葉植物藥旋花科植物菟 絲子、南方菟絲子、金燈藤等的種子，具有補腎益精、養(yǎng)肝明目、固胎止泄之功效。
[0013] 菟絲子的含生物堿、蒽醌、香豆素、黃酮、甙類、甾醇、鞣酸、糖類等。黃酮類有：槲皮 素（Quercetin)、紫云英式、金絲桃式（Hyperin);留醇類有：膽留醇（Cholesterol)、菜油甾 醇（Cam-pesterol)、0 -谷留醇（0 -Sitosterol)、豆留醇（Stig-masterol)、0 -香樹脂醇 (3-Amyrenol)，亦含微量元素如鍶、鑰、鈣、鎂、鐵、錳、鋅、銅等以及多種氨基酸（種子中的 游離氨基酸和水解后的總氨基酸為5. 3%，其中必需氨基酸的含量占42. 8% )。
[0014] 菟絲子有效成分主要包括金絲桃苷，又名槲皮素-3-0- P -D-吡喃半乳糖苷。屬于 黃酮醇苷類化合物。苷元為槲皮素，糖基為吡喃半乳糖，由槲皮素的3位0原子以P糖苷鍵 與糖基相連。金絲桃苷分布廣泛，具有抗炎、解痙、利尿、止咳、降壓、降低膽固醇、蛋白同化、 局部和中樞鎮(zhèn)疼以及對心、腦血管的保護作用等多種生理活性，是一種重要的天然產物。
[0015] 淫羊藿（Epimedium brevicornum Maxim)為小蘗科淫羊藿屬植物，亦名仙靈脾，是 我國傳統(tǒng)補益類中藥。藥理實驗顯示淫羊藿具有補腎壯陽、擴張血管、抗氧化、抗菌抗病毒 作用，可以提高機體免疫功能和預防骨質疏松，臨床多用復方治療糖尿病、男性不育癥、防 治骨質疏松癥、治療腎陽虛癥等，但具體藥理作用是哪一些單體和哪一個單體化合物在起 主導作用，還有待于進一步研究。菟絲子含有的糖類、蛋白質、維生素等物質有的在現(xiàn)今通 用的西式稀釋液中已經作為常用成分而添加，有些則未在稀釋液中出現(xiàn)過。
[0016] 淫羊藿主要成分淫羊藿甙（Icariin，ICA)能明顯促進幼年小鼠附睪及精囊腺的 發(fā)育。菟絲子醇提物（SCE)能明顯促進小鼠睪丸及附睪的發(fā)育[4]。在體幼年小鼠及離體培 養(yǎng)的大鼠睪丸間質細胞研究了 ICA及SCE對雄性生殖內分泌的影響，發(fā)現(xiàn)ICA能使小鼠附 睪及精囊腺增重；SCE則能使睪丸及附睪同時增重。說明淫羊藿和菟絲子分別具有雄性激 素及促性腺激素樣作用，這可能與淫羊藿及菟絲子的"壯陽"作用有關。體外實驗亦表明， ICA及SCE均能明顯促進大鼠間質細胞睪酮的基礎分泌。同時通過對精子毛細管穿透實驗 和低滲腫脹實驗評估精子活動功能及其膜功能結果表明，菟絲子對精子的運動功能和膜功 能亦有促進作用，且不影響尾膜的滲透功能。最新的研究亦表明，淫羊藿、菟絲子等中藥對 豬精液較好的冷凍保存效果主要得益于其本身所含的各種化學物質，這些物質相互協(xié)同， 可能改變了精子細胞膜中磷脂和膽固醇的含量或者比例，也可能通過溶解磷脂而使精子膜 具有一定的流動性，盡可能的保護膜脂的有效性，改善精子細胞的通透性，防止冷凍時精子 遭受的低溫損傷。同時中藥提取液中的維生素也可通過抑制不飽和脂肪酸的氧化水平而增 強精子的活力。在冷凍過程中對精子能夠起到抗凍和耐低溫的保護作用，同時保證精子的 代謝需要，并且具有殺菌、消炎、抗病毒等作用。另外，菟絲子可以增加SOD活性，抑制體內 過氧化脂質的生成，對精子細胞具有一定的抗衰老、抗氧化作用；中藥在多種成分的共同作 用下提高了精子的抗凍性，改善了凍后精子的質量。
[0017] 此外，菟絲子、淫羊藿等中藥中富含的Zn、Cu、Mn、Se等多種組成精子代謝有關的 多種酶的成分，對精子的形成和形態(tài)具有重要作用。Zn是精子結構組成部分，直接參與精 子的生成、成熟、激活以及獲能過程，維護細胞膜的結構穩(wěn)定和生理通透性，使精子具有良 好的活動力。精子中Zn的作用主要通過抑制降解酶的活性來保護精子中脫氧核糖核酸酶 免遭破壞，從而增強精子的運動能力，提高精子的凍后品質。有研究亦表明淫羊藿、菟絲子 作為稀釋液時增加了 Zn的含量，維護了精子細胞膜的結構和通透性。同時與魚腥草共同作 用，促進了精子的運動性能。Waberski等報道，稀釋液在保存精子活性的同時，也產生一定 的負面影響，導致精子活力喪失和精子膜損傷。如果精液稀釋過度，尤其是使用單純的化學 電解質時對精子的損傷更大。這可能是稀釋液的某些成分導致精子細胞的一些重要成分失 去功效，同時稀釋劑中單一的保護劑也可能對精子的質膜結構和活性產生不良影響，從而 影響精子質膜功能，降低凍后精子質量。
[0018] 有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明通過將中藥單體金絲桃苷、淫羊藿苷添加到常 用的基礎精液冷凍保護劑中并篩選中藥單體與基礎精液冷凍保護劑的配比關系，制備出性 能優(yōu)異的人精液冷凍保護劑，配合快速冷凍和快速解凍的方法，可以獲得優(yōu)異的精液保存 效果，同時，本發(fā)明為中藥單體在精液冷凍保護劑中的應用開辟了新的篇章，不僅證實了中 藥單體作為添加入加入到精液冷凍保護劑中可以有效地改善精子的保存效果，同時也建立 了一套完整的、容易被國際認可的適合人少弱精的冷凍系統(tǒng)，解決了少弱精冷凍這一疑難 問題。

【具體實施方式】
[0019] 實驗樣品及材料：
[0020] 本發(fā)明選擇生殖醫(yī)學科門診精液常規(guī)檢查標本，正常精液3份，少弱精10份。
[0021] 正常精液選擇密度和活率均較好的精液，少弱精選擇密度在10?20 X 106,活率較 好的精液。
[0022] 正常精液處理前精子質量（精子與冷凍保護劑按體積比I : 1或1 : 2混合）：
[0023] 密度：45±5.0X106 ;活率：70.67 % ±5. 13 ;a+b(前向活動精子百分比）： 51.00% ±5.20 ;c (非前向活動精子百分比）：19.67% ±3.79
[0024] 少弱精處理前精子質量（精子與冷凍保護劑按體積比I : 1混合）：
[0025] 密度：16.00±2.45\106;活率：61.90%±6.12;&+13(前向活動精子百分比） ： 43. 20% ±5.98 ;c (非前向活動精子百分比）：18. 70% ±5. 93
[0026] 少弱精處理前精子質量（精子與冷凍保護劑按體積比I : 1混合）：
[0027] 密度：17.00±2.65\106;活率：62.67%±2.52;&+13(前向活動精子百分比） ： 47.67% ±8.08 ;c (非前向活動精子百分比）：15.00% ±8. 19
[0028] 金絲桃苷（批號：110737-200415)和淫羊藿苷（批號：111521-201205)均來自中 國食品藥品檢定研究院。
[0029] 本發(fā)明選擇基礎液（TGG)為對照組，TI?T3組分別為在Iml TGG中加入0. 25ng、 0? 5ng、I. Ong金絲桃苷，Yl?Y3組分別在Iml TGG中加入0? 5ng、L 0、ng和2. Ong淫羊藿 苷。Cl為所照組，即TGG基礎液。
[0030] 實驗方法：
[0031] (1)基礎液（TGG)的配置。
[0032] A)配置無菌臺式溶液：1000ml 凈化水中添加 CaCl2O. 2g，KCl 0? 2g，Na2HPO4O. 05g， MgCl26H20 0? 2g，NaCl 8. 0g。NaHCO3L 0g，右旋葡萄糖 I. 0g，用 lmol/1 的 NaOH 和 HCl 溶液 調整PH至7. 4。
[0033] B)配置TGG基礎液：在40ml上述無菌臺式溶液中加入5ml濃度為lOOmg/ml的人 白蛋白，〇.9g葡萄糖和5ml甘油。然后使用0.45微米的濾器過濾。將配置好的基礎液低溫 保存?zhèn)溆谩?br> [0034] (2)精液冷凍保護劑的配制：
[0035] 對照組：TGG ;
[0036] 金絲桃苷組：
[0037] Tl為每毫升TGG中加入0. 25ng金絲桃苷的保護液；
[0038] T2為每毫升TGG中加入0. 5ng金絲桃苷的保護液；
[0039] T3為每毫升TGG中加入I. Ong金絲桃苷的保護液；
[0040] 淫羊藿苷組：
[0041] Yl為每毫升TGG中加入0. 5ng淫羊藿苷的保護液；
[0042] Y2為每毫升TGG中加入I. Ong淫羊藿苷的保護液；
[0043] Y3為每毫升TGG中加入2. Ong淫羊藿苷的保護液；
[0044] (4)精液冷凍保護劑在正常精液和少弱精冷凍保存過程中的應用效果。
[0045] A)裝管
[0046] 待精液樣品液化完全后，分別將正常精液樣本和少弱精按照體積比I : 1和1 : 2 加入到上述步驟（3)中制備的保護液樣品加入到冷凍管中，其中，充分混勻后分別將冷凍 管綁定于冷凍支架上。
[0047] B)快速冷凍：
[0048] 將上述冷凍支架放入4°C冰箱平衡lh，將冷凍支架置于裝滿液氮的自制容器上， 距離液氮面Icm處熏蒸IOmin,然后轉入冷凍罐中保存。
[0049] C)快速解凍：
[0050] 將冷凍管從液氮中取出后，在37°C水浴中靜置lOmin。
[0051] D)檢測指標：
[0052] 將上述精液樣品冷凍前、解凍后取樣于精子專用計數(shù)板（MAKLER板），于Nikon E200f?雙目相差顯微鏡下檢查精子活力、密度等指標。
[0053] E)統(tǒng)計學處理：
[0054] 采用SPSS 22. 0對各組數(shù)據進行t檢驗和方差分析。P < 0. 05為差異有顯著性。
[0055] 實驗結果：
[0056] (1)金絲桃苷和淫羊藿苷在正常精液冷凍保存過程中的應用效果。
[0057] 分別比較添加金絲桃苷和淫羊藿苷的冷凍保護劑對正常精液的冷凍效果，結果如 表1所示。
[0058] 表 1

【權利要求】
1. 一種添加中藥單體的人精液冷凍保護劑，其特征在于，所述冷凍保護劑包括中藥單 體和人精液基礎冷凍保護劑，其中，所述中藥單體為金絲桃苷或淫羊藿苷。
2. 根據權利要求1所述的添加中藥單體的人精液冷凍保護劑，其特征在于，所述的中 藥單體與人精液基礎冷凍保護劑的質量體積比為0. 2?2. Ong/ml。
3. 根據權利要求1或2所述的添加中藥單體的人精液冷凍保護劑，其特征在于，所述的 人精液基礎冷凍保護劑為TGG基礎液。
4. 權利要求1或2所述的添加中藥單體的人精液冷凍保護劑在人精液冷凍保護中的 應用，其特征在于，在使用時，將人精液與所述添加中藥單體的人精液冷凍保護劑以體積比 1 : (1?2)混合后利用快速冷凍和快速解凍法對精液進行冷凍保存。
5. 中藥單體在制備用于人少弱精子的精液冷凍保護劑中的應用，其中，所述中藥單體 為金絲桃苷或淫羊藿苷。
【文檔編號】A01N1/02GK104255703SQ201410510972
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權日:2014年9月28日
【發(fā)明者】聶曉偉, 談勇, 陳娟, 鄒奕潔 申請人:江蘇省中醫(yī)院