適用于多基因型的豇豆高效再生體系的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了適用于多基因型的豇豆高效再生體系的建立方法，所述方法包括前處理、不定芽的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、不定芽的伸長、生根培養(yǎng)、煉苗和移栽步驟。在前處理過程中，所用植物生長調(diào)節(jié)劑為濃度為1-4mg/L的6-BA或濃度為0.001-0.1mg/L的TDZ；在不定芽的誘導(dǎo)過程中，所用植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA和KT組合或KT和IBA組合，6-BA的濃度為0.8-1.2mg/L，KT的濃度為0.02-2mg/L，IBA的濃度為0.15-0.25mg/L；在不定芽的伸長過程中，所用植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA和IBA，6-BA的濃度為0.5mg/L，IBA的濃度為0.1-0.3mg/L。本發(fā)明不僅適應(yīng)于多基因型豇豆的再生培養(yǎng)，而且具有誘導(dǎo)率高、不定芽誘導(dǎo)數(shù)目多、不定芽長、不定芽干重高以及實(shí)施條件不苛刻的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的推廣前景。
【專利說明】適用于多基因型的豇豆高效再生體系的建立方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及適用于多基因型的豇豆高效再生體系的建立 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 豇豆是重要的蔬菜作物，在我國栽培歷史悠久，除西藏等高寒地區(qū)外均有種植，以 南方各省市栽培較多。豇豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值很高，其籽粒富含蛋白質(zhì)（占干物質(zhì)總量25%)、維生素、 葉酸及鉀、鎂、鐵等礦質(zhì)元素，并且還含有人體所必需的賴氨酸與色氨酸。
[0003] 傳統(tǒng)豇豆栽培種的產(chǎn)量很低，對蟲害及真菌病害高度易感是導(dǎo)致其產(chǎn)量低的一個(gè) 主要因素。豇豆在田間生長期間及貯藏期間共有31種蟲害和超過20種病害，僅蟲害每年 就可導(dǎo)致20%_60%的損失。對于病蟲害的防治，人們主要采取使用化學(xué)藥劑、加強(qiáng)農(nóng)業(yè)管理 措施和培育抗病蟲害新品種等方式。但長期使用化學(xué)藥劑，產(chǎn)生一系列的嚴(yán)重后果：病蟲產(chǎn) 生耐藥性，藥劑的大量使用對環(huán)境造成嚴(yán)重危害，威脅人類安全，"毒豇豆"事件觸目驚心。 農(nóng)業(yè)防治耗費(fèi)大量的人力物力卻收效甚微。由于自然界缺乏有效的抗病蟲種質(zhì)資源及雜交 不親和性等，通過常規(guī)育種方法選育抗性品種較為困難。
[0004] 近年來，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，尤其是植物基因工程技術(shù)的日趨成熟，為植物 的品種改良提供了新的途徑。自1983年第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物問世以來，一些天然的抗蟲基因 (如Bt基因、蛋白酶抑制劑及凝集素等）被成功地轉(zhuǎn)入一些作物中。提高豇豆產(chǎn)量、增強(qiáng)抗 蟲性最有效的途徑就是通過基因工程將抗蟲基因從其它材料中轉(zhuǎn)入豇豆栽培品種，對其進(jìn) 行遺傳改良。在眾多轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其費(fèi)用低、拷貝數(shù)低、轉(zhuǎn)育周期短以及 能轉(zhuǎn)化較大片段等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。而以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因材料的前提是要建 立一個(gè)高效穩(wěn)定的再生受體系統(tǒng)。因此，建立豇豆高效再生體系可以為豇豆遺傳轉(zhuǎn)化體系 的建立奠定基礎(chǔ)。
[0005] 利用器官發(fā)生途徑建立豇豆再生體系有多種，主要有子葉節(jié)、子葉、真葉、上胚軸、 下胚軸、莖尖、子葉節(jié)薄細(xì)胞層、莖尖分生組織和胚尖等。其中，對子葉節(jié)再生能力研究比較 多，如李曉梅利用子葉節(jié)作為外植體獲得了較為理想的不定芽誘導(dǎo)率。然而，國內(nèi)外對豇豆 組織培養(yǎng)與植株再生研究還存在許多問題。豇豆再生能力存在基因依賴性，不同基因型之 間再生能力存在顯著差異，至今還沒有建立一個(gè)適合不同基因型的豇豆再生體系。同時(shí)，主 芽的生長一般來說更好，不定芽的干重對于再生體系的優(yōu)良也至關(guān)重要。然而，目前對如何 提商王牙的數(shù)量和提商不定牙的干重還鮮見報(bào)道。
[0006] 因此，一種適用于多種基因型、可提高主芽數(shù)量并提高不定芽干重的豇豆再生體 系的構(gòu)建方法亟待開發(fā)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適用于多基因型的豇豆高效再 生體系的建立方法。構(gòu)建方法包括以下步驟： 1) 前處理：將豇豆種子進(jìn)行滅菌，然后放入含6-BA或TDZ的MSB5培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培 養(yǎng)時(shí)間為5天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為16 h/天，6-BA的濃 度為 l-4mg/L，TDZ 的濃度為 0? 001-0. lmg/L ; 2) 不定芽的誘導(dǎo)：切取帶一個(gè)子葉的子葉節(jié)，然后放入含6-BA和KT或含KT和IBA 的MSB5培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照 時(shí)間為16 h/天，6-BA的濃度為0. 8-1. 2mg/L，KT的濃度為0. 02-0. lmg/L，IBA的濃度為 0.15-0. 25mg/L ； 3) 繼代培養(yǎng)：將步驟2)所得物的不定芽的腋芽切下，棄掉，然后將剩余物接種于含 6-BA和KT或含KT和IBA的MSBJ§養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7天，培養(yǎng)溫度為23-27°C， 光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為16 h/天； 4) 不定芽的伸長：將步驟3)所得物放入含6-BA和IBA的MSB5培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng) 時(shí)間為14天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為16 h/天，6-BA的濃度 為 0? 5mg/L，IBA 的濃度為 0? 1-0. 3mg/L ; 5) 生根培養(yǎng)：將步驟4)所得物的不定芽切下，接種在含生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶上培養(yǎng)， 培養(yǎng)時(shí)間為14天，培養(yǎng)溫度為保持在23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為16 h/天， 所述生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH=5. 8 ; 6) 煉苗：選取經(jīng)步驟5)培養(yǎng)后的根長為4-5 cm的健壯小苗，將培養(yǎng)瓶的蓋子先擰松 放置2天，再半開2天，然后再全開2 d，半開和全開蓋子期間需要不斷補(bǔ)充水分； 7) 移栽：將煉苗完成后的植株拔起，用水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝有泥炭土、珍珠巖、 草木灰和腐葉土基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，在23-27°C下，套上保鮮袋置于人工氣候箱中保濕培養(yǎng)2 d，1-2周后再移到室外進(jìn)行培養(yǎng)。
[0008] 所述的滅菌過程為：在超凈工作臺上，對豇豆種子先用75%的酒精浸泡消毒lmin， 再用0. 1%升汞浸泡消毒5min，最后用無菌水沖洗5次。
[0009] 在切取帶一個(gè)子葉的子葉節(jié)時(shí)，節(jié)點(diǎn)距上胚軸0. 5 mm,距下胚軸5 mm。
[0010] 所述營養(yǎng)缽中泥炭土、珍珠巖、草木灰和腐葉土基質(zhì)的質(zhì)量比為1:1:1:1。
[0011] 優(yōu)選的，步驟1)中的MSB5培養(yǎng)基含有6-BA，6-BA的濃度為3mg/L。當(dāng)在步驟1) 中的6-BA的濃度為3mg/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率為100% ;當(dāng)6-BA濃度小于3. 0 mg/L時(shí)，不 定芽誘導(dǎo)數(shù)隨6-BA的濃度升高而增加，而當(dāng)6-BA濃度大于3. Omg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)數(shù)會出 現(xiàn)小幅下降，選擇6-BA濃度為3. Omg/L可獲得最好的誘導(dǎo)效果。
[0012] 優(yōu)選的，步驟2)中的MSB5培養(yǎng)基含有6-BA和KT，6-BA的濃度為I. Omg/L，KT的 濃度為〇? 〇6mg/L。當(dāng)6-BA為L 0 mg/L，KT濃度小于0? 06 mg/L時(shí)，不定芽數(shù)量以及不定 芽主芽數(shù)量隨KT濃度升高而增加，當(dāng)6-BA的濃度為I. Omg/L，KT的濃度為0. 06mg/L時(shí)，不 定芽數(shù)量以及不定芽主芽數(shù)量達(dá)到最多。
[0013] 優(yōu)選的，步驟4)中的MSB5培養(yǎng)基中，6-BA的濃度為0. 5mg/L，IBA的濃度為0. 2mg/ L。當(dāng)6-BA的濃度為0. 5mg/L，IBA的濃度小于0. 2mg/L時(shí)，不定芽長度、主芽長度、不定芽鮮 重和不定芽干重隨IBA的濃度升高而相應(yīng)增長和增加。當(dāng)6-BA的濃度為0. 5mg/L，IBA的 濃度為〇. 2mg/L時(shí)，不定芽長度和主芽長度達(dá)到最長，不定芽鮮重和不定芽干重達(dá)到最高。 [0014] 本發(fā)明具有如下有益效果： 1、適用于多個(gè)基因型，有較大推廣前景； 2、 不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)95%以上，不定芽誘導(dǎo)數(shù)多，最高可達(dá)12.91個(gè)； 3、 不定芽鮮重和不定芽干重高，生長良好的不定芽有利于之后遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立； 4、 實(shí)施步驟簡單，實(shí)施條件不苛刻。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1經(jīng)過前處理后的無菌苗； 圖2帶一個(gè)子葉的子葉節(jié)； 圖3誘導(dǎo)培養(yǎng)后的不定芽； 圖4切掉腋芽的外植體； 圖5伸長培養(yǎng)后的不定芽； 圖6生根培養(yǎng)后的不定根； 圖7煉苗結(jié)束后的再生苗； 圖8移栽苗。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只是用 于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017] 實(shí)施例1 選取大小均勻、飽滿的豇豆種子，在超凈工作臺上先用75%的酒精浸泡消毒lmin，再用 〇. 1%升汞浸泡消毒5min，再用無菌水沖洗5次，然后置于培養(yǎng)皿內(nèi)的無菌濾紙上，用消毒 后的鑷子將種子接種在培養(yǎng)基上，每瓶接種10粒種子。將豇豆種子放入含6-BA或TDZ的 MSB5培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為5天，培養(yǎng)溫度為25°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為 16 h/天。再于含6-BA和KT或含KT和IBA的MSB5培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7天， 培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為16 h/天，設(shè)6組實(shí)驗(yàn)組，第一實(shí)驗(yàn) 組中，采用6-BA與KT組合，6-BA的濃度為0. 8mg/L，KT的濃度為0. 02mg/L，第二實(shí)驗(yàn)組中， 采用6-BA與KT組合，6-BA的濃度為I. Omg/L，KT的濃度為0. 06mg/L ;第三實(shí)驗(yàn)組中，采用 6-BA與KT組合，6-BA的濃度為I. 2mg/L，KT的濃度為0. lmg/L ;第四實(shí)驗(yàn)組中，采用KT和 IBA組合，KT的濃度為0? 02mg/L，IBA的濃度為0? 15mg/L ;第五實(shí)驗(yàn)組中，采用KT和IBA 組合，KT的濃度為0. 06mg/L，IBA的濃度為0. 20mg/L ;第六實(shí)驗(yàn)組中，采用KT和IBA組合， KT的濃度為0. lmg/L，IBA的濃度為0. 25mg/L ;實(shí)驗(yàn)結(jié)果取六組實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)平均值。
[0018] 6-BA和TDZ前處理對不定芽誘導(dǎo)的影響見表1。
[0019] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 適用于多基因型的豇豆高效再生體系的建立方法，其特征在于：包括如下步驟： 1) 前處理：將豇豆種子進(jìn)行滅菌，然后放入含6-BA或TDZ的MSB5培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培 養(yǎng)時(shí)間為5天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為16 h/天，6-BA的濃 度為 l-4mg/L，TDZ 的濃度為 0? 001-0. lmg/L ; 2) 不定芽的誘導(dǎo)：切取帶一個(gè)子葉的子葉節(jié)，然后放入含6-BA和KT或含KT和IBA 的MSB5培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照 時(shí)間為16 h/天，6-BA的濃度為0. 8-1. 2mg/L，KT的濃度為0. 02-0. lmg/L，IBA的濃度為 0.15-0. 25mg/L ； 3) 繼代培養(yǎng)：將步驟2)所得物的不定芽的腋芽切下，棄掉，然后將剩余物接種于含 6-BA和KT或含KT和IBA的MSBJ§養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7天，培養(yǎng)溫度為23-27°C， 光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為16 h/天； 4) 不定芽的伸長：將步驟3)所得物放入含6-BA和IBA的MSB5培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng) 時(shí)間為14天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為16 h/天，6-BA的濃度 為 0? 5mg/L，IBA 的濃度為 0? 1-0. 3mg/L ; 5) 生根培養(yǎng)：將步驟4)所得物的不定芽切下，接種在含生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶上培養(yǎng)， 培養(yǎng)時(shí)間為14天，培養(yǎng)溫度為保持在23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為16 h/天， 所述生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH=5. 8 ; 6) 煉苗：選取經(jīng)步驟5)培養(yǎng)后的根長為4-5 cm的健壯小苗，將培養(yǎng)瓶的蓋子先擰松 放置2天，再半開2天，然后再全開2 d，半開和全開蓋子期間需要不斷補(bǔ)充水分； 7) 移栽：將煉苗完成后的植株拔起，用水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝有泥炭土、珍珠巖、 草木灰和腐葉土基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，在23-27°C下，套上保鮮袋置于人工氣候箱中保濕培養(yǎng)2 d，1-2周后再移到室外進(jìn)行培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)所述的滅菌過程為：在超凈工作 臺上，對豇豆種子先用75%的酒精浸泡消毒lmin,再用0. 1%升萊浸泡消毒5min,最后用無 菌水沖洗5次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟2)中，在切取帶一個(gè)子葉的子葉節(jié) 時(shí)，節(jié)點(diǎn)距上胚軸0. 5 mm,距下胚軸5 mm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟7)所述營養(yǎng)缽中泥炭土、珍珠巖、草 木灰和腐葉土基質(zhì)的質(zhì)量比為1:1:1:1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中的MSB5培養(yǎng)基含有6-BA，6-BA 的濃度為3mg/L ;步驟2)中的MSB5培養(yǎng)基含有6-BA和KT，6-BA的濃度為1. Omg/L，KT的濃 度為0? 06mg/L ;步驟4)中的MSB5培養(yǎng)基中，6-BA的濃度為0? 5mg/L，IBA的濃度為0? 2mg/ L〇
【文檔編號】A01H4/00GK104381130SQ201410555006
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】唐懿, 李煥秀, 孫國超, 汪志輝, 夏惠, 賴云松, 王迅, 呂秀蘭, 涂利華, 黃志
申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)