邳半夏鯊烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種邳半夏鯊烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。所分離出的 DNA 分子包括：編碼具有邳半夏 PtSQS 蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與 SEQIDNO.3 中從核苷酸第 127-1359 位的核苷酸序列有至少 70% 的同源性；或者所述的核苷酸序列能在 40 － 55 ℃條件下與 SEQIDNO.3 中從核苷酸第 127-1359 位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明是一種鯊烯合酶，有助于提高邳半夏中具有抗癌活性的三萜類(lèi)化合物的含量，對(duì)于保護(hù)人民的健康生長(zhǎng)有所幫助。
【專(zhuān)利說(shuō)明】邳半夏鯊烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地，本發(fā)明涉及一種在邳半夏中 表達(dá)的PtSQS蛋白（鄭半夏藍(lán)烯合酶蛋白，Tkmaia (Thunb.) Breit. squalene synthetase, PtSQS)及其核酸序列，是鄭半夏S烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 鄭半夏(/YfleBia Tkmaia (Thunb. ) Breit.)別名三葉半夏，三步跳，老灣眼 等.為天南星科，多年生草本植物，野生于山坡、溪邊陰濕的草叢中或林下，葉子有長(zhǎng)柄，初 夏開(kāi)黃綠色花。地下有白色小塊莖，可入藥。主治痰飲嘔吐、濕痰咳嗽、消痞散結(jié)、眩暈、氣 逆等癥。邳半夏中成分復(fù)雜，含有揮發(fā)性物質(zhì)，三萜類(lèi)化合物、及生物堿等多種活性物質(zhì)，其 中三萜類(lèi)化合物抗腫瘤等活性已引起人們廣泛關(guān)注。已有文獻(xiàn)報(bào)道邳半夏中含有多種三萜 類(lèi)組分，并且這些組分都具有抗腫瘤活性。近代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，藥用植物中萜類(lèi)，生物堿等 次生代謝產(chǎn)物大部分是天然活性物質(zhì)，是解決目前世界面臨的西藥毒副作用大，癌癥、艾滋 病等疑難疾病無(wú)法醫(yī)治等難題的一條新途徑。
[0003] 然而作為次生代謝產(chǎn)物，其絕對(duì)含量又是很低的，這也成為次生代謝產(chǎn)物研究開(kāi) 發(fā)的最大障礙。近年來(lái)植物基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，為利用現(xiàn)代生物技術(shù)提 高次生代謝產(chǎn)物或其前體的含量開(kāi)辟了一條嶄新的途徑。利用現(xiàn)代生物技術(shù)將次生代謝產(chǎn) 物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因（或轉(zhuǎn)錄因子）導(dǎo)入相應(yīng)的宿主中，獲得轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞系、 組織或再生植株，并進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，是實(shí)現(xiàn)從根本上提高次生代謝產(chǎn)物含量的最佳途 徑。
[0004] S烯合酶（Squalene Synthase, SQS)催化兩個(gè)分子的法尼基焦磷酸（FPP)生成 鯊烯，第一步反應(yīng)是兩分子的FPP通過(guò)異戊烯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)縮合成前鯊烯焦磷酸（PSQPP)，并 釋放出一分子無(wú)機(jī)二磷酸，在該過(guò)程中，其中一個(gè)FPP的C(I)-C(2)的雙鍵作為另一個(gè)FPP 的異戊烯基受體；第二步反應(yīng)是PSQPP在NADPH作為供氫體的情況下，通過(guò)正碳離子重排轉(zhuǎn) 化為鯊烯，該反應(yīng)發(fā)生在細(xì)胞中的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，鯊烯合酶在三萜，留醇的生物合成中起著 關(guān)鍵的作用。由于鯊烯合酶催化的底物FPP處于異類(lèi)戊二烯代謝途徑中的分支點(diǎn)，因此，調(diào) 控鯊烯合酶的活性能夠直接影響留醇、三萜類(lèi)以及FPP為前提物的其他類(lèi)異戊二烯化合物 的生物合成。因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)將SQS基因?qū)脍胂闹校@得轉(zhuǎn)基因的植物，并且 進(jìn)行大規(guī)模的栽培，是實(shí)現(xiàn)從根本上提高邳半夏三萜類(lèi)活性化合物含量的最佳途徑。
[0005] 在對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的分析中，"Plant and cell physiology (植物和細(xì)胞生理),2004, 45 (8) :976-984"和"Planta.(植物科學(xué)），2011，233:343-355"等報(bào)道了從人參和阿爾泰 柴胡中克隆了鯊烯合酶基因，NCBI網(wǎng)站上公布了銀杏，紅豆杉等的鯊烯合酶基因的序列。但 至今尚未有邳半夏SQS蛋白序列及其核酸序列的報(bào)道。
[0006] 在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開(kāi)或報(bào)道過(guò)本專(zhuān)利申請(qǐng)中提及的邳半夏 PtSQS蛋白序列及其核酸序列。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種邳半夏PtSQS蛋白編碼序 列。使其包含所說(shuō)基因的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體，被所說(shuō)的表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的所說(shuō)基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物 種子及植物組織，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物將具有顯著提高的次生代謝產(chǎn)物含量。
[0008] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明所分離出的DNA分子包括：編碼具有 邳半夏PtSQS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO. 3中從核 苷酸第127-1359位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40 - 55°C條件下與SEQ ID NO. 3中從核苷酸第127-1359位的核苷酸序列雜交。
[0009] 較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地， 所述的序列具有SEQ ID NO. 3中從核苷酸第127-1359位的核苷酸序列。
[0010] 本發(fā)明分離出的邳半夏PtSQS蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO. 3氨基酸序列 的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ IDN0. 3序列的多肽。
[0011] 本發(fā)明所提供的載體DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。它包含所述的DNA 分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
[0012] 本發(fā)明用上述載體。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是煙草。
[0013] 在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的" DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其 兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開(kāi)，而且 已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
[0014] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"邳半夏PtSQS蛋白（或多肽）編碼序列"指編碼具有邳半夏 PtSQS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3中第127-1359位核苷酸序列及其簡(jiǎn) 并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO. 3序列的編碼框第127-1359位核苷酸中，有一 個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn) 并性，所以與SEQ ID NO. 3中第127-1359位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也 能編碼出SEQ ID NO. 3所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán) 緊條件下與SEQ ID NO. 3中從核苷酸第127-1359位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該 術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO. 3中從核苷酸第127-1359位的核苷酸序列的同源性至少70%，較 佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。
[0015] 該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的邳半夏PtSQS蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 3中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：若干個(gè)（通常為 1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)）核苷酸的缺失、插入和/或取代， 以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(gè)（通常為60個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為30個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為10個(gè) 以?xún)?nèi)，最佳地為5個(gè)以?xún)?nèi)）核苷酸。
[0016] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"邳半夏PtSQS蛋白或多肽"指具有邳半夏PtSQS蛋白活性的 SEQ ID NO. 3序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然邳半夏PtSQS蛋白相同功能的SEQ ID NO. 4序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：若干個(gè)（通常為1-50個(gè)，較佳 地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末 端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)（通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以 內(nèi)）氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋 白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白 質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括邳半夏PtSQS蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0017] 本發(fā)明的邳半夏PtSQS蛋白多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位 變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與邳半夏PtSQS蛋白DNA雜交 的DNA所編碼的蛋白、以及利用邳半夏PtSQS蛋白多肽的血清獲得的多肽或蛋白。
[0018] 在本發(fā)明中，"邳半夏PtSQS蛋白保守性變異多肽"指與SEQ ID NO. 3的氨基酸序 列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所 替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
[0019] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種邳半夏鯊烯合酶基因，其特征在于：所述基因由SEQ ID NO. 1中第127-1359位 的核苷酸序列所構(gòu)成。
2. -種邳半夏鯊烯合酶，其特征在于：所述酶由SEQ ID NO. 2中第1-410位的氨基酸 序列所構(gòu)成。
3. -種含有權(quán)利要求1所述的邳半夏鯊烯合酶基因的完整編碼閱讀框序列的質(zhì)粒。
4. 一種含有權(quán)利要求1所述的邳半夏鯊烯合酶基因的完整編碼閱讀框序列的植物表 達(dá)載體。
5. -種用權(quán)利要求1所述的邳半夏鯊烯合酶基因轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植物。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104388446SQ201410566830
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】曹小迎, 蔣繼宏, 張文娟, 張盼盼, 陳集雙 申請(qǐng)人:江蘇師范大學(xué)