一株蘋果根際自毒物質(zhì)降解菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株蘋果根際自毒物質(zhì)降解菌及其應(yīng)用，該菌株分類命名為生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)BL2，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月28日，保藏編號：CGMCC No.9619。本發(fā)明菌株在液體搖瓶培養(yǎng)的情況下，對根皮苷、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、焦性沒食子酸均具有很好的降解效果。液體搖床培養(yǎng)3天，紫外分光光度計法測定結(jié)果顯示：降解率分別為，根皮苷36％、對羥基苯甲酸34％、鄰苯二甲酸31％、焦性沒食子酸65％。表明，BL2菌株對四種自毒物質(zhì)均具有很好的降解效果，對緩解自毒物質(zhì)引起的連作障礙具有潛在的應(yīng)用價值。
CGMCC No.9619
2014.08.28
【專利說明】一株蘋果根際自毒物質(zhì)降解菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株蘋果根際自毒物質(zhì)降解菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果（Malus pumila)是舊薇科（Rosaceae)蘋果屬（pomaceous)植物，落葉喬木， 葉橢圓形，花白色帶有紅暈。果實圓形，味甜或略酸，是常見水果，具有豐富的營養(yǎng)成分，有 食療、輔助治療功能，是廣為大眾接受且喜愛的水果之一。近年來，蘋果主產(chǎn)區(qū)由于連年種 植導致的連作障礙已成為制約蘋果生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)問題。蘋果連作障礙產(chǎn)生的主要原因包 括土壤理化性狀惡化，土傳病蟲害加重，自毒物質(zhì)產(chǎn)生的自毒作用，其中自毒物質(zhì)對植物的 毒害作用是導致植物連作障礙的形成原因之一。
[0003] 自毒作用（Autotoxicity)是指某些植物可通過地上部淋溶、根系分泌和植株殘 茬腐解等途徑來釋放一些物質(zhì)對同茬或下茬同種或同科植物生長產(chǎn)生抑制作用。研究發(fā)現(xiàn) 酚酸類物質(zhì)是導致蘋果連作障礙的主要自毒物質(zhì)。酚酸類物質(zhì)可以通過影響植物的膜系 統(tǒng)、光合作用、酶活性、土壤微生物活性和土壤理化性質(zhì)等，對植物生長產(chǎn)生抑制作用。導致 蘋果連作障礙的酚酸物質(zhì)主要有根皮苷、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸，焦性沒食子酸等。目 前尚未找到去除蘋果酚酸類自毒物質(zhì)的有效方法，微生物對自毒物質(zhì)的降解作用被認為是 一條很好的途徑，既可以降低自毒物質(zhì)的含量，又不對環(huán)境產(chǎn)生危害。據(jù)不完全統(tǒng)計，已發(fā) 現(xiàn)包括黃孢原毛平革菌和粘質(zhì)沙雷菌屬等20多個屬的植物根際細菌具有降解自毒物質(zhì)潛 能的報道。但是，有關(guān)蘋果根際細菌對多種自毒物質(zhì)的降解未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株蘋果根際自毒物質(zhì)降解菌及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] -株蘋果根際自毒物質(zhì)降解菌，該菌株分類命名為生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum)BL2,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地 址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月28日，保藏編號：CGMCC No.9619。
[0007] 該菌株的菌落及菌體特征為：本發(fā)明的蘋果根際自毒物質(zhì)降解菌在LB培養(yǎng)基（酵 母浸膏，5g ;蛋白胨，IOg ;氯化鈉 ，IOg ;蒸餾水，IOOOmL ;瓊脂，15-20g;12rC滅菌20min ; PH7.0。）上培養(yǎng)48h后菌落呈圓形不透明，表面光滑，淡黃色。菌體呈螺旋狀，不產(chǎn)芽孢，革 蘭氏染色陰性。
[0008] 該菌株的生理生化特征為：氧化酶試驗陽性、接觸酶試驗陽性、甲基紅試驗陰性、 v-p試驗陰性、淀粉水解試驗陰性、硝酸鹽還原試驗陽性、脲酶試驗陰性、吲哚試驗陰性、硫 化氫試驗陽性、檸檬酸鹽利用試驗陽性、運動性試驗陽性、L-阿拉伯糖試驗陽性、D-木糖試 驗陽性、蔗糖試驗陽性、麥芽糖試驗陽性、精氨酸利用試驗陽性、明膠液化試驗陰性。
[0009] 該菌株的最適培養(yǎng)條件為：LB培養(yǎng)基：蛋白胨IOg,酵母浸膏5g，NaCl IOg,蒸饋水 IOOOml ;溫度：3(TC，pH 7· 0。
[0010] 該菌株可以用于制備微生物菌劑；應(yīng)用時，培養(yǎng)CGMCC 9619,得菌懸液，作為液態(tài) 菌劑，菌液的濃度優(yōu)選為2. 0 X 108cfu/ml。
[0011] 菌劑的使用方法：移苗時蘸根、緩苗后灌根80ml菌劑每棵苗。
[0012] 經(jīng)研究表明，用紫外分光光度法測定培養(yǎng)3d后CGMCC 9619菌株對四種自毒物質(zhì) 即根皮苷、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、焦性沒食子酸的降解率，結(jié)果如下：第1天降解率 27%、32%、29%、30% ;第 2 天降解率 32%、32%、29%、36% ;第 3 天降解率 36%、34%、 31%、65%。高效液相色譜法測定3d后各菌株對自毒物質(zhì)的降解能力，降解率分別為根皮 苷84 %、對羥基苯甲酸72 %、鄰苯二甲酸91 %、焦性沒食子酸84 %。以上研究結(jié)果表明，BL2 菌株對四種自毒物質(zhì)均具有很好的降解效果，對緩解自毒物質(zhì)引起的連作障礙具有潛在的 應(yīng)用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 一株蘋果根際自毒物質(zhì)降解菌，該菌株分類命名為生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum)BL2,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地 址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月28日，保藏編號：CGMCC No. 9619 ；
[0014] 圖1為紫外分光光度法測定本發(fā)明菌株對四種自毒物質(zhì)3天內(nèi)降解率柱形圖；
[0015] 圖2為高效液相色譜法測定本發(fā)明菌株對自毒物質(zhì)3天后降解率柱形圖。

【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0017] 一株蘋果根際自毒物質(zhì)降解菌，該菌株分類命名為生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum)BL2,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地 址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月28日，保藏編號：CGMCC No.9619。
[0018] (I)CGMCC 9619 的篩選
[0019] 以鄰苯二甲酸為唯一碳源富集降解菌的過程：取山東泰安北集坡鎮(zhèn)西百子坡村 (N36° 04' 54.9" E117。08' 51.3")蘋果根際土樣IOg放于加有鄰苯二甲酸（其 質(zhì)量濃度為 l〇〇〇mg/L)的 90mL 基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（NH4Cl 0· 5g ;NaCl Ig ;K2HP04 · 3H20 I. 3g ; MgSO4 · 7Η200· 4g ;蒸餾水 IOOOmL ;pH7. 2)中，30°C，180r/min 搖床培養(yǎng) 7d 后，以 5%接種 量轉(zhuǎn)接至新的含鄰苯二甲酸基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3次連續(xù)富集，鄰苯二甲酸濃度分別為 1000mg/L,1200mg/L,1400mg/L〇
[0020] 以鄰苯二甲酸為唯一碳源分離降解菌的過程：取富集后的培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后 (10_3、10_4、10_ 5、10_6)分別涂布于含1400mg/L的鄰苯二甲酸基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基平板上，30°C 培養(yǎng)。待平板上出現(xiàn)單菌落后，挑取單菌落分別劃線于鄰苯二甲酸基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基中， 得到5株不同生長形態(tài)的細菌分離物，反復劃線進行純化，將純化后的菌落接種至LB固體 斜面培養(yǎng)基中（酵母浸膏，5g ;蛋白胨，IOg ;氯化鈉 ，IOg ;蒸餾水，IOOOmL ;瓊脂，15-20g ; 121°C滅菌 20min;pH7.0。）保存。
[0021] 通過紫外分光光度法（根皮苷，對羥基苯甲酸，鄰苯二甲酸，焦性沒食子酸的最 大吸收波長選取分別為325nm ;248nm ;291nm ;302nm)、高效液相色譜法（高效液相色譜參 數(shù)條件：紫外檢測波長280nm，流動相為乙腈和水（用乙酸調(diào)節(jié)pH2. 8)，柱溫30°C，流速 I. OmL/min。采用雙泵系統(tǒng)，梯度洗脫，0-35min，乙腈從5%提高到35%，35-40min，乙腈保 持35%，40-42min，乙腈從35%下降到5%。每個分析周期結(jié)束后基線平穩(wěn)IOmin后進樣， 以去除干擾成分，保證分析結(jié)果的穩(wěn)定性和重復性）測定降解率，從分離得到的5株菌中篩 選出1株對根皮苷、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、焦性沒食子酸均具有降解效果的細菌（降 解率見表1，表2)，記為BL2。
[0022] (2) CGMCC 9619 菌種鑒定
[0023] 基因組DNA的提?。簩⒎蛛x得到的菌株劃線接種到LB固體培養(yǎng)基上于30°C中培 養(yǎng)24h后，挑取單菌落于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中30°C，150r/min搖床培養(yǎng)24h。具體 方法參閱文獻（Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short Protocols in Molecular Biology. Chichester: John Wiley&Sons, Inc, 1995:36-40·)。將取得的 DNA 溶于 40 μ L TE 緩沖液（IOmM Tris-HCl，ImM EDTA，PH = 8. 0)中，然后保存于-20°C冰箱備用。
[0024] 16S rDNA序列擴增引物由上海生物工程有限公司合成，正向引物27F :5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，如 SEQ ID NO. 1 ;反向引物 1492R :5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3，，如 SEQ ID NO. 2。
[0025] PCR 擴增反應(yīng)體系：Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L，IOXBuffer 5 μ L，MgCl23 μ L， dNTPs (10mmol/L) 1 μ L，引物 27F 1 μ L，引物 1492R 1 μ L，模板 0· 5 μ L，ddH20 補足至 50 μ L。 反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，30個循環(huán)； 72°C延伸10min。16S rDNA的測序工作由上海生物工程有限公司完成。
[0026] 16S rDNA基因序列，見如SEQ ID NO. 3。將所測16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中 的序列比對，結(jié)果表明：本發(fā)明的菌株位于系統(tǒng)發(fā)育樹中固氮螺菌屬（Azospirillum sp.) 分支中，與 Azospirillum lipoferum ncimb 11861 (Z29619. 1)和 Azospirillum melinis TMCY 0552(DQ022958. 1)兩株菌有最近的親緣關(guān)系，其16S rRNA基因序列相似性都為 99%。
[0027] 該菌株在LB培養(yǎng)基（酵母浸膏，5g ;蛋白胨，IOg ;氯化鈉 ，IOg ;蒸饋水，IOOOmL ;瓊 月旨，15-20g;12rC滅菌20min;pH7.0。）上培養(yǎng)48h后菌落呈圓形不透明，表面光滑，淡黃 色。菌體呈螺旋狀，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陰性。該菌株的生理生化特征為：氧化酶試驗陽 性、接觸酶試驗陽性、甲基紅試驗陰性、v-p試驗陰性、淀粉水解試驗陰性、硝酸鹽還原試驗 陽性、脲酶試驗陰性、吲哚試驗陰性、硫化氫試驗陽性、檸檬酸鹽利用試驗陽性、運動性試驗 陽性、L-阿拉伯糖試驗陽性、D-木糖試驗陽性、蔗糖試驗陽性、麥芽糖試驗陽性、精氨酸利 用試驗陽性、明膠液化試驗陰性。與參考菌株Azospirillum melinis相比5% NaCl條件 下生長情況、運動性與參考菌株不符，其余生理生化試驗均與參考菌株符合。與參考菌株 Azospirillum lipoferum相比，菌落形態(tài)相符，脲酶實驗、接觸酶實驗與參考模式菌株性狀 不符，其余生理生化試驗均與參考模式菌株符合。由以上菌落、菌體形態(tài)，生理生化特征和 16S rDNA 序列分析，鑒定 CGMCC 9619 為生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum)。
[0028] ⑶降解試驗
[0029] 培養(yǎng)基及菌種制備：分別配制含鄰苯二甲酸（lg/L)的無機鹽培養(yǎng)基（NH4Cl 0· 5g ;NaCllg ;K2HP04 ·3Η20 I. 3g ;MgS04 ·7Η20 0· 4g ;蒸餾水 IOOOmL ;ρΗ7· 2)，含對羥基苯甲 酸（lg/L)的無機鹽培養(yǎng)基（NH4Cl 0· 5g ;NaCl Ig ;Κ2ΗΡ04 · 3H20 I. 3g ;MgS04 · 7Η20 0· 4g ; 蒸餾水IOOOmL ;pH7. 2)，含焦性沒食子酸（lg/L)的無機鹽培養(yǎng)基（NH4Cl 0. 5g ;NaCl Ig ; K2HPO4 · 3Η201· 3g ;MgS04 · 7H20 0· 4g ;蒸餾水 IOOOmL ;ρΗ7· 2)，含根皮苷（20mg/L)的無機 鹽培養(yǎng)基（NH4Cl 0· 5g ;NaCl Ig ;K2HP04 · 3H20 I. 3g ;MgS04 · 7H20 0· 4g ;蒸餾水 IOOOmL ; pH7. 2)適量。取IOOmL分裝于250mL錐形瓶中121°C滅菌20min，然后分別接入該菌于培養(yǎng) 基中搖床（180r/min，30°C )培養(yǎng)至對數(shù)期。
[0030] 取培養(yǎng)至對數(shù)期的CGMCC 9619菌1%的接種量分別接種于新鮮的含根皮苷 (20mg/L)的無機鹽培養(yǎng)基，含對輕基苯甲酸（lg/L)的無機鹽培養(yǎng)基，含鄰苯二甲酸（lg/L) 的無機鹽培養(yǎng)基，含焦性沒食子酸（lg/L)的無機鹽培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)（180r/min，30°C)， 每24h取樣，測定自毒物質(zhì)的殘留量，殘留量采用紫外分光光度法和高效液相色譜測定。
[0031] 紫外分光光度法：首先對得到的樣品9000r/min離心IOmin取上清，然后用 0. 22 μ m無機過濾器過濾掉菌體，最后在相應(yīng)的波長（根皮苷325nm，對輕基苯甲酸248nm, 鄰苯二甲酸291nm，焦性沒食子酸的302nm)下測定其吸光度，并計算降解率。
[0032] 紫外分光光度法降解率的計算方法：降解率=(未接菌培養(yǎng)液吸光度-接菌培養(yǎng) 液吸光度）/未接菌培養(yǎng)液吸光度X 100 %。
[0033] 高效液相色譜法樣品準備：取搖床培養(yǎng)3d后培養(yǎng)液20mL，9000r/min離心10分 鐘，去除菌體，取等量二氯甲烷反復萃取三次，有機層合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮蒸干，用 2mL甲醇分三次溶解。然后用0. 22 μ m有機過濾器過濾，裝于2mL離心管中備用，然后高效 液相色譜儀測定殘留量，并計算降解率。參數(shù)設(shè)定：紫外檢測波長280nm，流動相為乙腈和 水（用乙酸調(diào)節(jié)ρΗ2· 8)，柱溫30°C，流速I. OmL/min。采用雙泵系統(tǒng)，梯度洗脫，0-35min，乙 腈從5 %提高到35 %，35-40min，乙腈保持35 %，40-42min，乙腈從35 %下降到5 %。每個分 析周期結(jié)束后基線平穩(wěn)IOmin后進樣，以去除干擾成分，保證分析結(jié)果的穩(wěn)定性和重復性。 [0034] 高效液相色譜法降解率計算方法：降解率=(未接菌培養(yǎng)液液相色譜峰面積-接 菌培養(yǎng)液液相色譜峰面積）/未接菌培養(yǎng)液液相色譜峰面積X 100 %。
[0035] 結(jié)果如表1、表2,圖1、圖2所示。
[0036] 紫外分光光度法測定結(jié)果顯示：3天的降解率分別為：第1天降解率27%、32%、 29%、30%;第2天降解率32%、32%、29%、36%;第3天降解率36%、34%、31%、65%。高 效液相色譜法測定結(jié)果顯示：降解率分別為根皮苷84%、對羥基苯甲酸72%、鄰苯二甲酸 91 %、焦性沒食子酸84%。以上表明BL2菌株對四種自毒物質(zhì)均具有很好的降解效果，對緩 解自毒物質(zhì)引起的連作障礙具有潛在的應(yīng)用價值。
[0037] 表1紫外分光光度法測定BL2對四種自毒物質(zhì)3天內(nèi)降解率
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一株蘋果根際自毒物質(zhì)降解菌，其特征在于，該菌株分類命名為生脂固氮螺菌 (Azospirillum lipoferum)BL2,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月28日，保藏編 號：CGMCC No. 9619。
2. 如權(quán)利要求1所述的降解菌，其特征在于，所述菌株的菌落及菌體特征為：在LB培 養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后菌落呈圓形不透明，表面光滑，淡黃色；菌體呈螺旋狀，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏 染色陰性。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的降解菌，其特征在于，所述菌株的最適培養(yǎng)條件為：LB培養(yǎng) 基：蛋白胨l〇g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，蒸餾水1000ml ;121°C滅菌20min ;溫度：30°C，pH 7. 0。
4. 如權(quán)利要求1-3任一所述菌株制備的微生物菌劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的菌劑，其特征在于，培養(yǎng)CGMCC 9619,得菌懸液，作為液態(tài)菌劑。
6. 如權(quán)利要求5所述的菌劑，其特征在于，所述液態(tài)菌劑的濃度為2. OX 108Cfu/ml。
7. 如權(quán)利要求4-6任一所述的菌劑在緩解蘋果自毒物質(zhì)引起的連作障礙中的應(yīng)用。
8. 如權(quán)利要求7所述的菌劑的應(yīng)用方法，其特征在于，移苗時蘸根、緩苗后灌根，用量 都為80ml菌劑每棵苗。
【文檔編號】A01G7/06GK104312956SQ201410568851
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】丁延芹, 毛志泉, 杜秉海, 祁國振, 劉凱, 姚良同 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學