一種通過抑制受精卵極體釋放獲得異源多倍體泥鰍的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通過抑制受精卵極體釋放獲得異源多倍體泥鰍的方法，它以二倍體泥鰍、四倍體泥鰍和大鱗副泥鰍為繁殖親本進行雜交獲得雜交受精卵，在獲得受精卵的第5分鐘時，將雜交受精卵浸泡在2-3℃冰水中進行冷休克處理，處理的持續(xù)時間為30-35分鐘，最后在室溫條件下進行孵化，飼養(yǎng)，獲得泥鰍異源多倍體。該方法分別獲得異源三倍體泥鰍、異源四倍體泥鰍以及異源五倍體泥鰍，其誘導泥鰍異源多倍體種類多，數(shù)量大，誘導成功率高，后代生長快，12月齡比正常自交對照組體重平均增加-19.99％～142.34％，增重效果明顯，具有較強的推廣效益。
【專利說明】-種通過抑制受精卵極體釋放獲得異源多倍體泥頌:的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及魚類雜交選育W及多倍體育種領域，更具體地說，它涉及一種通過抑 制受精卵極體釋放獲得異源多倍體泥餓的方法。

【背景技術】
[0002] 泥餓（Misgurnus anguillicauda1:us)和大鱗副泥餓（Paramisgurnus d油；ryanus) 是我國重要的兩種淡水經(jīng)濟餓類，2011年我國兩種餓類產量超過23萬噸。兩種餓類除了我 國西藏高原地區(qū)外，全國其他地區(qū)均有分布。近年來，由于自然資源的銳減，野生捕揚泥餓 遠遠不能滿足市場的需要，開展泥餓育種，選育優(yōu)良品種的任務迫在眉睫。在魚類育種工作 中，常用的兩種技術包括：雜交選育W及多倍體育種。雜交育種后代通過篩選可W獲得遺傳 了兩個甚至多個物種或地理群體的優(yōu)勢，在生長速度、抗逆性、抗病性和肉質等方面都表現(xiàn) 出雜種優(yōu)勢。比如湖南師范大學利用紅側和湘江野纏進行屬間雜交形成的雜交后代在生長 速度、肉質、抗病力W及存活率都表現(xiàn)出了雜種優(yōu)勢。
[0003] 同時，由于多倍體魚類在生長速度和可育性方面表現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢，使得多倍 體選育在魚類育種中占據(jù)重要位置。魚類誘導多倍體的方式有兩種方式，一是通過休克抑 制卵子第二極體的釋放獲得H倍體，二是通過抑制受精卵第一次有絲分裂獲得四倍體。根 據(jù)受精卵的來源不同，可W分為同源多倍體和異源多倍體。通過休克抑制自交后代獲得的 多倍體稱之為同源多倍體，而通過休克抑制雜交后代獲得的多倍體稱之為異源多倍體。迄 今為止，國內外學者陸續(xù)開展了水晶彩側，纏魚、羅非魚、虹轉等魚類的同源四倍體誘導，而 異源四倍體的誘導主要是通過遠緣雜交自發(fā)形成獲得，如遠緣雜交四倍體"湘云獨rw及興 國紅纏和紅側雜交后代四倍體。中國專利CN1969616A公開了一種誘導團頭妨和H角妨雜 交異源四倍體的方法，獲得團頭妨異源四倍體群體，但誘導成功率不高。
[0004] 目前，通過理化方法獲得同源或異源多倍體成功的案例較少，主要表現(xiàn)在誘導率 低、崎形率高W及嵌合體比率高等，從而導致誘導四倍體難W存活下來，難W建立較大規(guī)模 的穩(wěn)定群體。而通過抑制卵子第二極體的釋放獲得誘導H倍體成功的案例較多，在虹轉、黃 顯魚、真觸、大黃魚都相繼獲得成功，誘導成功率高，后代存活率明顯高于誘導四倍體。
[0005] 我國有較為豐富的泥餓資源，特別是湖北地區(qū)同時分布有二倍體泥餓（2N = 50) 和四倍體泥餓（4N = 100)野生資源，同時還廣泛分布有其近緣物種大鱗副泥餓（2N = 48)， 為研究泥餓的雜種選育W及研究魚類多倍體的發(fā)生提供了優(yōu)良的研究材料。將雜交育種和 多倍體育種兩種方法相結合，培育泥餓異源多倍體不僅能夠擴大雜交優(yōu)勢，而且生產出的 不育或生殖障礙的后代可W避免遺傳污染問題。目前，關于泥餓異源多倍體誘導的系統(tǒng)研 究，國內外尚無報道。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種通過抑制受精卵極體釋放獲得異源多倍體泥餓的方法， 通過該方法可獲得高比例的異源多倍體泥餓。
[0007] 上述目的是通過w下技術方案實現(xiàn)的：
[0008] -種通過抑制受精卵極體釋放獲得異源多倍體泥餓的方法，該方法是；W二倍體 泥餓、四倍體泥餓和大鱗副泥餓為繁殖親本進行雜交獲得雜交受精卵，在獲得受精卵的第 5分鐘時，將雜交受精卵浸泡在2-3C冰水中進行冷休克處理，處理的持續(xù)時間為30-35分 鐘，最后在室溫條件下進行賠化，飼養(yǎng)，獲得泥餓異源多倍體。
[0009] 所述二倍體泥餓、四倍體泥餓和大鱗副泥餓親本來源于野生群體，選擇發(fā)育良好， 無病無害個體用作繁殖親本。
[0010] 本發(fā)明的有益效果是：
[0011] 1、本發(fā)明綜合利用了雜交技術和染色體組操作技術培育出新型的泥餓群 體，分別獲得異源H倍體泥餓、異源四倍體泥餓W及異源五倍體泥餓，其誘導率高達 81. 25% -100% ；
[0012] 2、本發(fā)明提供的方法誘導泥餓異源多倍體種類多，數(shù)量大，誘導成功率高，后代生 長快，12月齡比正常自交對照組體重平均增加-19. 99% -142. 34%，增重效果明顯；
[0013] 3、本發(fā)明采用的方法是利用冰水對受精卵進行冷休克處理，操作簡單，材料易得， 操作過程無毒無害，對操作者和受精卵均無毒性；該方法同時適用于誘導其他魚類異源多 倍體，具有較強的推廣效益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是利用流失細胞儀對異源多倍體泥餓倍性鑒定結果，參照為二倍體的大鱗 副泥餓紅細胞。圖中，a:誘導4n軍X大3雜交組合獲得異源五倍體泥餓檢測圖；b:誘導 4n軍x2ncT雜交組合獲得異源五倍體泥餓檢測圖；C:誘導站$x4nc?雜交組合獲得異源四倍 體泥餓檢測圖；d:誘導2n軍X大(至雜交組合獲得異源H倍體泥餓檢測圖。
[0015] 圖2是利用英光染料值API)對受精卵進行追蹤。圖中，a示2H軍X大度雜交受精卵 冷休克處理后發(fā)育至第50分鐘卵細胞受精核和極體變化；b示2n?x大3雜交受精卵不經(jīng)過 冷休克正常發(fā)育至第50分鐘卵細胞受精核。

【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步地詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限 制。
[0017] 實施例1最佳誘導條件的建立
[0018] 本發(fā)明利用物理方法（冷休克處理）誘導泥餓異源多倍體，主要是通過抑制受精 卵第二極體的釋放獲得異源多倍體泥餓。按照H因素實驗設計原理，將實驗條件（休克開 始時間、休克溫度和休克處理時間）分別進行梯度設計，休克開始時間分別為受精后第4分 鐘、第5分鐘、第6分鐘；休克溫度分別為rC、2°C、3°C、4°C ;休克處理持續(xù)時間分別為25 分鐘、30分鐘、35分鐘。每個實驗組設計2個平行，通過統(tǒng)計胚胎成活率W及誘導多倍體成 功率確定合適的誘導條件用于后續(xù)實驗。
[0019] 本發(fā)明優(yōu)選的休克開始時間為受精后第5分鐘；休克溫度為2-3C;休克處理時間 為30-35分鐘。此時的胚胎成活率W及誘導多倍體成功率最高。
[0020] 實施例2泥餓異源多倍體的建立
[0021] 首先從湖北省武漢市周邊水域，捕揚野生泥餓。挑選發(fā)育良好，無病無傷作為繁殖 親本。在實驗室內利用流式細胞儀炬eckman, Quanta SC)鑒定其血細胞DNA含量用于判別 其倍性。通過對繁殖親本注射催產藥物，所用催產藥物是促排卵素2號（LRH-A2)和地歐麗 值0M)，雌魚的注射劑量為LRH-A235 y g/kg+D0M4mg/kg，雄魚劑量減半，注射方法為腹腔一 次注射法。催產藥物注射后，將雌雄魚分開暫養(yǎng)于不同水箱中，水溫24-26C。注射催產藥 物12-15小時后，解剖雄魚取出精液，將精巢與精子保存液（保存液配方；氯化軸7. 5g，氯 化鐘0. 3g，氯化巧0. 3g，葡萄糖3. Og，蒸觸水定容到lOOOmL)充分研磨過濾；再擠出不同種 類泥餓成熟雌魚的卵粒，與精子進行混勻，加曝氣水激活受精。通過觀察受精卵胚胎發(fā)育情 況，在第二極體排出前利用冰水對受精卵進行冷休克處理。通過實施例1最佳誘導條件的 摸索，實施例2具體誘導條件為受精后第5分鐘后開始冷休克處理，2-3C冰水持續(xù)休克30 分鐘。通過冷休克處理后，受精卵在室溫條件下進行賠化，飼養(yǎng)賠化獲得的泥餓苗，首先投 喂鮮活團蟲飼養(yǎng)，團蟲飼養(yǎng)5-7天后，再使用商品配合飼料飼養(yǎng)至成魚。
[0022] 按照自交和雜交，雜交分為正交和/或反交進行人工受精，獲得四個雜交誘 導組合（如軒乂乃、4nCx 2rv?、2n$x4nd、站軒大3 ) ^及；個自交組合對照組 (大大c5'、4n?x4n<5')，雜交誘導組合受精卵按照上述方法進行冰水冷休克處 理，自交組正常受精后不休克處理。按月對雜交誘導組和正常對照組進行生長指標的測量 (表 1)。
[0023] 表1泥餓異源多倍體生長狀況
[0024]

【權利要求】
1. 一種通過抑制受精卵極體釋放獲得異源多倍體泥鰍的方法，其特征在于：以二倍體 泥鰍、四倍體泥鰍和大鱗副泥鰍為繁殖親本進行雜交獲得雜交受精卵，在獲得受精卵的第 5分鐘時，將雜交受精卵浸泡在2-3°C冰水中進行冷休克處理，處理的持續(xù)時間為30-35分 鐘，最后在室溫條件下進行孵化，飼養(yǎng)，獲得泥鰍異源多倍體。
2. 根據(jù)權利要求1所述的通過抑制受精卵極體釋放獲得異源多倍體泥鰍的方法，其特 征在于：所述二倍體泥鰍、四倍體泥鰍和大鱗副泥鰍親本來源于野生群體，選擇發(fā)育良好， 無病無害個體用作繁殖親本。
【文檔編號】A01K61/00GK104396812SQ201410581532
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權日:2014年10月27日
【發(fā)明者】黃松錢, 曹小娟, 田先暢, 王衛(wèi)民 申請人:華中農業(yè)大學