一種短小芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種短小芽孢桿菌菌株，其保藏編號(hào)為CCTCC M2013263。本發(fā)明的短小芽孢桿菌能夠改善對(duì)蝦消化道優(yōu)勢(shì)菌群的組成和數(shù)量，形成并維持良好的消化道微生態(tài)平衡，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、空間競(jìng)爭(zhēng)或分泌細(xì)菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖。能夠激活對(duì)蝦酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、熱休克蛋白、脂多糖-葡聚糖結(jié)合蛋白、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子等與抗病原感染相關(guān)分子的表達(dá)，減緩病毒在對(duì)蝦體內(nèi)的增值速率。本發(fā)明的短小芽孢桿菌可以添加到對(duì)蝦飼料原料中，也可以直接施用于對(duì)蝦養(yǎng)殖水環(huán)境中。CCTCC M 201326320130616
【專利說(shuō)明】一種短小芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于益生菌篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種短小芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)在細(xì)菌分類上隸屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes) (低G+C革蘭氏陽(yáng)性菌）、芽孢桿菌綱（Bacilli)、芽孢桿菌目（Bacillal es)、芽孢桿菌科 (Bacillaceae)、芽孢桿菌屬（Bacillus)。短小芽孢桿菌普遍存在于土壤及植物體表，也是 人、動(dòng)物腸道內(nèi)常見(jiàn)的共生菌之一。短小芽孢桿菌是1989年美國(guó)食品藥物管理局（FDA)和 美國(guó)飼料公定協(xié)會(huì)（AAFCO)公布的44種可直接飼喂且通常認(rèn)為是安全的微生物之一。短小 芽孢桿菌分泌蛋白能力強(qiáng)且胞外蛋白酶活性低，因此具有分泌表達(dá)外源蛋白的天然優(yōu)勢(shì)， 利用它們可望建立高效的原核分泌表達(dá)系統(tǒng)。
[0003] 短小芽孢桿菌和其它芽孢桿菌一樣，具有營(yíng)養(yǎng)體-芽孢-營(yíng)養(yǎng)體的獨(dú)特生活周期 史，抗逆能力強(qiáng)、繁殖速度快、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，具有可抵抗酸、高溫、干燥等不良環(huán)境條件等 優(yōu)勢(shì)，適宜大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。短小芽孢桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中可分泌蛋白酶、纖維素酶、 淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶、麥芽糖酶、多聚糖降解酶、堿性蛋白酶、β -半乳糖苷酶、果聚糖 酶等多種酶類，其豐富的胞外酶系不僅有助于飼料的消化吸收，可降解內(nèi)外環(huán)境中的有機(jī) 殘余物，促進(jìn)良性生態(tài)循環(huán)。短小芽孢桿菌的防病能力源于對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦體內(nèi)外生態(tài)環(huán)境的 改善和機(jī)體免疫力的提高，將其應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境改良劑、飼料添加劑等有廣闊的前景。
[0004] 但目前對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用的短小芽孢桿菌菌株較少，且存在著菌種生物學(xué)性狀 平平，活菌數(shù)量偏低，作用效果不穩(wěn)定等不足，特別是還沒(méi)有抗對(duì)蝦病毒病菌株的應(yīng)用。病 毒性疾病是危害對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)的主要病害，約占對(duì)蝦病害總損失率的六成；特別是對(duì)蝦白 斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus,簡(jiǎn)稱WSSV)引起白斑病，由于宿主范圍廣、感 染死亡率高，是我國(guó)乃至全世界影響最大、危害最為嚴(yán)重的病毒性疾病。本發(fā)明涉及的短小 芽孢桿菌菌株，優(yōu)先考慮菌株的抗病毒活性，通過(guò)反復(fù)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌株可提高對(duì)蝦溶 菌酶、過(guò)氧化氫酶、酚氧化酶、磷酸酶、超氧化物歧化酶等相關(guān)免疫酶活性，增強(qiáng)對(duì)蝦非特異 免疫功能，減少病毒感染的機(jī)會(huì)，從而有效阻斷病毒病的發(fā)生與流行。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種短小芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用，該菌株來(lái)源于對(duì)蝦消化 道，具有增強(qiáng)對(duì)蝦細(xì)胞和體液的免疫水平，特別是提高對(duì)蝦抗病毒感染能力的生物學(xué)活性。
[0006] 本發(fā)明的短小芽孢桿菌LV012 (Bacillus pumilus LV012)菌株于2013年6月16 日保藏在武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2013263。
[0007] 上述的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)LV012菌株是從對(duì)奸消化道中分離的。
[0008] 短小芽孢桿菌LV012菌株可用于制備短小芽孢桿菌LV012發(fā)酵菌液。
[0009] 短小芽孢桿菌LV012發(fā)酵菌液制備方法如下：從_80°C保存的菌種挑取少量劃線 于2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養(yǎng)液中， 37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子液接種于地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵 溫度控制在37°C ;當(dāng)發(fā)酵液0D600值達(dá)到1. 2?1. 4時(shí)，終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液；發(fā)酵液 中短小芽孢桿菌LV012活菌濃度彡109CFU/mL。
[0010] 短小芽孢桿菌LV012的發(fā)酵液成分質(zhì)量百分比為：蛋白胨，0. 5% ;酵母粉，0. 1% ; 蔗糖，1.5% ;氯化鈉，2.5% ;硫酸鐵，0.05% ;硫酸鎂，0.004% ;硫酸錳，0.01 %。
[0011] 本發(fā)明的短小芽孢桿菌LV012篩選自對(duì)蝦消化道，具有：①改善對(duì)蝦消化道優(yōu)勢(shì) 菌群的組成和數(shù)量，形成并維持良好的消化道微生態(tài)平衡，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、空間競(jìng)爭(zhēng)或分泌 細(xì)菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖；②通過(guò)提高對(duì)蝦溶菌酶、過(guò)氧化氫酶、酚氧化 酶、磷酸酶、超氧化物歧化酶等相關(guān)免疫酶活性，增強(qiáng)對(duì)蝦非特異免疫功能，減少病毒感染 的機(jī)會(huì)；③激活對(duì)蝦酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、熱休克蛋白、脂多糖-葡聚糖結(jié) 合蛋白、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子等與抗病原感染相關(guān)分子的表達(dá)，減緩病毒在對(duì)蝦體內(nèi) 的增值速率；④提高對(duì)蝦蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，促進(jìn)對(duì)蝦消化能力和飼料養(yǎng)分的 消化，提高對(duì)蝦抗應(yīng)激反應(yīng)能力等多種生物學(xué)功能。本發(fā)明的短小芽孢桿菌LV012可以添 加到對(duì)蝦飼料原料中，也可以直接施用于對(duì)蝦養(yǎng)殖水環(huán)境中。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的菌株進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0013] 實(shí)施例1 :短小芽孢桿菌的篩選
[0014] 本發(fā)明的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)LV012菌株篩選自凡納濱對(duì)蝦消化 道。將采集的健康對(duì)蝦樣品放在盛有海水的充氣袋中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。無(wú)菌操作臺(tái)上用75% 的酒精擦拭活蝦體表進(jìn)行消毒，無(wú)菌操作將活蝦解剖，取出對(duì)蝦腸道組織。將取出的腸道 組織用無(wú)菌的PBS (pH = 7. 0)緩沖液沖洗3-4次后，用無(wú)菌研磨棒研磨均勻。之后用無(wú)菌 PBS緩沖液適當(dāng)稀釋，取0. Iml涂布于2216E固體培養(yǎng)基上，倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)16h-20h。觀察2216E平板上細(xì)菌的菌落形態(tài)，對(duì)菌落形態(tài)一致的細(xì)菌進(jìn)行編號(hào)，無(wú)菌條 件下用接種環(huán)挑取優(yōu)勢(shì)菌單菌落接種于2216E海水固體培養(yǎng)基中進(jìn)行反復(fù)純化培養(yǎng)。純化 后的單菌落接種于2216E海水液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為180rpm/min，28°C振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16h-20h，取0. 8ml菌懸液放入保種管中，再加入0. 2ml的70%滅菌甘油，混勻，用封口膜封 好，放于-80°C冰箱保存。
[0015] 篩選的短小芽孢桿菌在2216E培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)：菌落直徑約l-2mm，菌落呈圓 形，乳白色、不透明，表面呈蠟狀，有凸起且邊緣整齊。
[0016] 碳源利用情況為α -環(huán)式糊精、β -甲基-D-葡萄糖苷、D -阿糖醇、腺苷、D-丙氨 酸、2' -脫氧腺苷、β -環(huán)式糊精、松二糖、L-丙氨酸、麥芽三糖、D-阿洛酮糖、木糖醇、D-蘋(píng) 果酸、D-甘露醇、D-蜜三糖/棉子糖、D-木糖、L-天門(mén)冬酰胺、琥珀酸單甲基酯、D-甘露糖、 L-鼠李糖、丙酮酸甲酯、5' -磷酸腺苷、D-半乳糖、D-松三糖、吐溫80、龍膽二糖、γ -羥丁 酸、P-羥基苯乙酸、β-甲基-D-半乳糖苷、α-酮戊二酸、2, 3-丁二醇、6-磷酸-D-葡萄 糖、苦杏仁苷在Biolog碳源消耗中呈現(xiàn)陽(yáng)性。
[0017] 其它生理生化特性：淀粉水解呈陰性，明膠液化陰性，氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，過(guò)氧化氫 酶試驗(yàn)陽(yáng)性。
[0018] 短小芽孢桿菌LV012菌株可用于制備短小芽孢桿菌LV012發(fā)酵菌液。
[0019] 短小芽孢桿菌LV012發(fā)酵菌液制備方法如下：從-80°c保存的菌種挑取少量劃線 于2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養(yǎng)液中， 37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子液接種于地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵 溫度控制在37°C ;當(dāng)發(fā)酵液0D600值達(dá)到1. 2?1. 4時(shí)，終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液；發(fā)酵液 中短小芽孢桿菌LV012活菌濃度彡109CFU/mL。
[0020] 短小芽孢桿菌LV012的發(fā)酵液成分質(zhì)量百分比為：蛋白胨，0. 5% ;酵母粉，0. 1% ; 蔗糖，1.5% ;氯化鈉，2.5% ;硫酸鐵，0.05% ;硫酸鎂，0.004% ;硫酸錳，0.01 %。
[0021] 實(shí)施例2:
[0022] 將制得的IOOmL短小芽孢桿菌LV012溶液與IOKg基礎(chǔ)對(duì)蝦飼料原料（含魚(yú)粉 30%、蝦粉10%、豆粉25%、花生粉25%、面粉3%、玉米粉3%、復(fù)合維生素1% )混合，制 成含短小芽孢桿菌LV012的免疫飼料。各種原料分別粉碎過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱重后逐級(jí)充分 混勻，以褐藻酸鈉作為粘合劑，加適量水用小型絞肉機(jī)擠壓制成顆粒飼料，在40°C條件下烘 干至水分含量10%以下，分袋包裝，于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0023] 健康凡納濱對(duì)蝦300余尾，實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦初始平均體長(zhǎng)為6. 3cm，隨機(jī)為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照 組2個(gè)處理組，每個(gè)處理組有3個(gè)平行，每個(gè)平行組養(yǎng)殖對(duì)蝦50尾。實(shí)驗(yàn)組連續(xù)4天投喂 免疫飼料，3天投喂基礎(chǔ)飼料，7天一個(gè)循環(huán)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段一直投 喂基礎(chǔ)飼料。水溫24-26°C，連續(xù)充氣；每日換水1次，日換水量為1/3 ;每日投喂飼料4次， 日投餌量約為1. 2-1. 4克/10尾，投喂Ih后吸去剩余飼料，并根據(jù)殘餌的多少調(diào)節(jié)投餌量。 免疫飼料養(yǎng)殖21天后，進(jìn)行白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV)人工注射 感染實(shí)驗(yàn)。感染前1天停止投喂飼料，次日每尾對(duì)蝦在第2腹節(jié)處注射50 μ L WSSV粗提液 (濃度為〇. 16g/mL)，以PBS溶液為陰性對(duì)照組。攻毒后各組繼續(xù)投喂相應(yīng)飼料，每天及時(shí) 撿出死蝦，記錄死亡數(shù)量，14d后結(jié)束感染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每日平均累計(jì)死亡率結(jié)果 見(jiàn)下表，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在感染4d內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組累積死亡率為差異不顯著（P>0. 05); 從第5d始各組均呈明顯的上升趨勢(shì)，對(duì)照組累積死亡率較實(shí)驗(yàn)組差異顯著（P〈0. 05);至感 染實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天對(duì)照組的累積死亡率為100%，實(shí)驗(yàn)組的累積死亡率為63. 3%。

【權(quán)利要求】
1. 一種短小芽孢桿菌，其特征在于，所述的短小芽孢桿菌的保藏編號(hào)為CCTCC M 2013263。
2. 權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌是從對(duì)蝦消化道中分離的。
3. 權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌在制備飼料添加劑中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的飼料為對(duì)蝦飼料。
5. -種對(duì)蝦飼料，其特征在于，所述的對(duì)蝦飼料中添加有權(quán)利要求1所述的短小芽孢 桿菌。
6. -種菌液，其特征在于，所述的菌液是用權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌發(fā)酵制備 的。
7. 如權(quán)利要求6所述的菌液，其特征在于所述的菌液中短小芽孢桿菌活菌濃度 彡 109CFU/mL。
8. 發(fā)酵制備權(quán)利要求6所述菌液的方法，其特征在于，所述方法如下： 從-80°C保存的菌種挑取少量劃線于2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h獲得單菌落， 取一單菌落接種于2216E培養(yǎng)液中，37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子液接種于地衣 芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在37°C ;當(dāng)發(fā)酵液0D600值達(dá)到1. 2?1. 4時(shí)， 終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵液成分質(zhì)量百分比為：蛋白胨 0.5 % ;酵母粉0. 1% ;蔗糖1.5% ;氯化鈉2.5% ;硫酸鐵0.05 % ;硫酸鎂0.004 % ;硫酸 0? 01%。
【文檔編號(hào)】A23K1/18GK104388337SQ201410582638
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】宋曉玲, 李玉宏, 張慶利, 許華, 黃倢 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所