金線蓮種子與真菌共生萌發(fā)快速成苗的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種金線蓮種子與絲核菌共生萌發(fā)快速成苗的方法，由金線蓮種子與共生真菌共生萌發(fā)成原球莖，由共生真菌持續(xù)為原球莖提供營(yíng)養(yǎng)，原球莖成長(zhǎng)分化為金線蓮幼苗的快速育苗模式。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、成本低廉，整個(gè)培育過(guò)程僅需一種育苗培養(yǎng)基、僅需一次轉(zhuǎn)移金線蓮的原球莖即可成苗，從金線蓮種子與真菌共生到培育成金線蓮幼苗僅需70—90天的培育期，培育金線蓮幼苗的周期比傳統(tǒng)的金線蓮種子無(wú)菌播種育苗周期縮短30—60天以上；所培育出的金線蓮幼苗抗病力強(qiáng)，移栽成活率達(dá)95%以上，培育過(guò)程當(dāng)中不使用任何化學(xué)合成物質(zhì)，非常容易轉(zhuǎn)化成為大規(guī)模工廠化培育金線蓮幼苗的模式。CGMCC No.97282014.09.28
【專利說(shuō)明】金線蓮種子與真菌共生萌發(fā)快速成苗的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來(lái)說(shuō)是金線蓮種子與真菌共生萌發(fā)快速成苗 的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 金線蓮為地生蘭，種子細(xì)微，比毛發(fā)還細(xì)小，不具胚乳，無(wú)發(fā)芽能力，只有在真菌 共生下，才促進(jìn)種子萌發(fā)生長(zhǎng)，但其發(fā)芽率很低。而金線蓮對(duì)生態(tài)環(huán)境要求也極為嚴(yán)苛，多 生長(zhǎng)在常綠闊葉林的溝邊，小溪邊的土質(zhì)松散，陰涼潮濕地帶，所以野生金線蓮的成苗率就 更低，或?yàn)槿f(wàn)分之一。由于金線蓮的自然繁殖率極低，生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重破壞，以及人為的盲 目采挖，野生金線蓮已經(jīng)日趨枯竭，瀕臨滅絕。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員紛紛加強(qiáng)對(duì)金線蓮 的藥用價(jià)值開發(fā)力度，金線蓮中許多具備藥理活性成分的化合物不斷地被發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證，金 線蓮的藥用價(jià)值和保健功能為越來(lái)越多的人們所認(rèn)知，市場(chǎng)需求越來(lái)越大。
[0003] 現(xiàn)有蘭科植物的繁育模式一組培工廠（金線蓮莖段為外植體無(wú)菌組培和金線蓮 種子無(wú)菌播種）繁育金線蓮，雖然可以繁育大量的金線蓮組培苗，但存在著許多不足：首 先，育苗工藝繁瑣，需要配制3或4種培養(yǎng)基質(zhì)，原球莖需要轉(zhuǎn)接3次或4次。其次，育苗的 生產(chǎn)成本較高，需要無(wú)菌的工作環(huán)境；育苗周期較長(zhǎng)，至少需要110-120天的培育時(shí)間，甚 至更長(zhǎng)的培育周期。
[0004] 金線蓮組培苗從無(wú)菌的環(huán)境移栽到自然的生長(zhǎng)環(huán)境，導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢、植株抗病力 低、有效藥用成分達(dá)不到要求，對(duì)金線蓮的藥用價(jià)值開發(fā)形成制約。
[0005] 在自然界中，整個(gè)蘭科植物的生活史都與共生真菌緊密聯(lián)系著，共生真菌促進(jìn)蘭 科植物種子萌發(fā)，為萌發(fā)的原球莖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)其轉(zhuǎn)化成幼苗成長(zhǎng)。
[0006] 研究金線蓮種子與共生真菌共生萌發(fā)快速成苗的方法，是完全模擬蘭科植物在 自然界中的自然生長(zhǎng)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)金線蓮種子與共生真菌背后的共生規(guī)律，實(shí)現(xiàn)從金線蓮種 子與真菌共生萌發(fā)的有性繁育和快速成苗，這一種繁育模式具有成苗周期短，僅需70 - 90 天；成苗抗病力和抗逆性強(qiáng)；金線蓮成苗的有效藥用成分接近野生金線蓮。這一由金線蓮 種子和真菌共生萌發(fā)快速繁育金線蓮幼苗的生產(chǎn)模式，可為其它珍稀蘭科植物品種的保育 開辟一個(gè)全新的高效繁育模式。
[0007] 目前，國(guó)內(nèi)外能夠把真菌的共生技術(shù)運(yùn)用在蘭科植物的有性繁育和人工規(guī)模化栽 培品種是天麻，由上世紀(jì)80年代徐錦堂研發(fā)而成。此后，國(guó)內(nèi)外的許多蘭科真菌研究專家 學(xué)者對(duì)其它蘭科植物的共生真菌、真菌與蘭科植物種子共生機(jī)理作了深入全面的理論研究 和實(shí)踐運(yùn)用，但是還沒有能夠?qū)崿F(xiàn)從蘭科植物種子和真菌共生萌發(fā)、萌發(fā)的原球莖繼續(xù)成 長(zhǎng)發(fā)育成幼苗規(guī)?；耘噙@一關(guān)鍵階段技術(shù)的突破。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種金線蓮種子與真菌共生萌發(fā)快速成苗的方法，是全國(guó)首 創(chuàng)的培育仿野生金線蓮與真菌共生成苗的快速生長(zhǎng)模式。
[0009] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是： 金線蓮種子與真菌共生萌發(fā)快速成苗的方法，包括如下步驟， (1) 金線蓮共生萌發(fā)真菌的分離、純化： 選取野生金線蓮健壯幼苗根狀莖的頂端突起部位、或是根狀莖的節(jié)上突起部位；將這 一部位用70%酒精表面消毒3_5s，置于清水瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)、分離、純化； (2) 制備金線蓮共生萌發(fā)真菌的液體菌種： 將分離純化后的金線蓮有效共生萌發(fā)真菌一絲核菌（Rhizoctoniasp.),保藏號(hào)為CGMCCNo. 9728,從低溫保藏的斜面試管活化后，制備成液體共生菌種備用； 液體菌種的配制比例為：20%馬鈴薯提取液：1一5%山毛櫸科樹葉提取液：0. 5-1. 5% 白砂糖； 所述山毛櫸科樹葉提取液的制備采用現(xiàn)有技術(shù)，具體是將山毛櫸科樹葉與水按1 :5的 比例混合，煮沸半小時(shí)，濾出原液制成； (3) 制備金線蓮共生萌發(fā)絲核菌的固體培養(yǎng)基： 培養(yǎng)基由山毛櫸科樹葉、山毛櫸科木屑、麥麩或米糠按照比例混合，再經(jīng)過(guò)高溫殺菌， 然后將絲核菌的液體菌種接種到培養(yǎng)基上，在溫度為25°C-27°C的環(huán)境下培養(yǎng)，待共生真 菌長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基，等待播種； 所述培養(yǎng)基原料配制的比例為：山毛櫸科樹葉30-45% :山毛櫸科木屑30-45% :米糠 或麥麩10-40%，培養(yǎng)基的含水量為60-62%; (4) 金線蓮種子的播種與暗培養(yǎng)： 將成熟的金線蓮種子撒播在長(zhǎng)滿共生真菌的培養(yǎng)基上，在溫度為25- 27°C的環(huán)境下， 暗培養(yǎng)45-60天，金線蓮種子與共生真菌共生萌發(fā)成長(zhǎng)為粗壯的原球莖，原球莖長(zhǎng)度達(dá)可 達(dá)L5_3cm; (5) 金線蓮原球莖的轉(zhuǎn)移與光培養(yǎng)： 將粗壯的金線蓮原球莖轉(zhuǎn)移至山毛櫸科樹葉：山毛櫸科木屑體積比為1 :1?1 :3的混 合基質(zhì)中，在光照強(qiáng)度為1000-3000LUX，光照時(shí)間為10-12h/d，溫度為25°C-27°C的條件 下，光培養(yǎng)20-30天，即可成長(zhǎng)為具有原生態(tài)的仿野生金線蓮幼苗，金線蓮幼苗高度可達(dá) 5cm以上。
[0010] 本發(fā)明提供的菌種絲核菌（Rhizoctoniasp.)，已于2014年9月28日保藏于中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo. 9728。
[0011] 所述步驟（2)液體菌種制備的周期為：5-7天，在溫度為25°C-27°C條件下培養(yǎng)。
[0012] 本發(fā)明將獲得的真菌接種在消毒后的山毛櫸科樹葉上，將成熟的金線蓮種子撒播 在帶菌的樹葉上進(jìn)行共生萌發(fā)培養(yǎng)，以檢驗(yàn)所得的真菌對(duì)金線蓮種子共生萌發(fā)的有效性， 以金線蓮種子的萌發(fā)率和金線蓮原球莖的生長(zhǎng)速度作為兩個(gè)主要篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出最有效 的金線蓮共生萌發(fā)菌，并對(duì)此共生真菌進(jìn)行分子鑒定和保存。此方法分離金線蓮種子有效 萌發(fā)共生真菌的分離效率在60%-80%以上。目前篩選出最有效的金線蓮共生萌發(fā)真菌，種 子萌發(fā)率在15-20%之間。這一分尚方法相對(duì)于傳統(tǒng)的利用金線蓮根部分尚有效共生萌發(fā) 真菌的方法更簡(jiǎn)單、快速；分離效率高10倍以上。
[0013] 本發(fā)明金線蓮種子與真菌共生萌發(fā)快速成苗的方法，工藝流程簡(jiǎn)單，成本低，育苗 周期比傳統(tǒng)的種子無(wú)菌播種和組培方法時(shí)間縮短一半甚至一倍以上；而且育苗全程不添加 任何人工合成化學(xué)物質(zhì)；金線蓮從種子與所分離篩選的共生萌發(fā)真菌結(jié)合共生萌發(fā)成原球 莖，共生真菌持續(xù)為原球莖提供營(yíng)養(yǎng)，成長(zhǎng)分化成金線蓮幼苗，育苗全程僅需一種固體培養(yǎng) 基和經(jīng)一次轉(zhuǎn)移，培育周期僅在70- 90天；金線蓮幼苗已經(jīng)攜帶共生真菌，與無(wú)菌的金線 蓮組培苗相比更具抗病力和抗逆性；所培育的金線蓮幼苗的有效藥用成分更接近野生金線 蓮的有效藥用成分。這一育苗方法的發(fā)明，可為其它珍稀蘭科植物的繁育及瀕危珍稀蘭花 品種的保育產(chǎn)生一定的借鑒意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為金線蓮種子； 圖2為金線蓮根狀莖的突起部位； 圖3為實(shí)施例金線蓮原球莖與絲核菌共生萌發(fā)36天的照片； 圖4為實(shí)施例金線蓮原球莖與絲核菌共生萌發(fā)60天的照片； 圖5為實(shí)施例金線蓮原球莖與絲核菌共生萌發(fā)70天的照片； 圖6為實(shí)施例金線蓮共生幼苗與絲核菌共生萌發(fā)85天的照片； 圖7為實(shí)施例金線蓮共生幼苗與絲核菌共生萌發(fā)93天的照片。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不是對(duì)本發(fā)明的限定。 實(shí)施例
[0016] 金線蓮種子與共生真菌共生萌發(fā)快速成苗的方法，包括以下步驟： (1)金線蓮共生萌發(fā)真菌的分離、純化： 選取野生金線蓮健壯幼苗根狀莖的頂端突起部位(如圖2所示)，將這一部位用70%酒 精表面消毒3_5s，置于清水瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)、分離、純化； 已經(jīng)篩選好的金線蓮共生萌發(fā)真菌一絲核菌（Rhizoctoniasp.)，已于2014年9月28 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)保藏號(hào)為CGMCC No.9728。
[0017] (2)液體菌種的制備：將絲核菌CGMCCNo. 9728的菌株自低溫保藏斜面試管活化 后，制備成液體共生菌種備用；液體菌種的配制比例為：20%馬鈴薯提取液、2%山毛櫸科樹 葉提取液、1%白砂糖，在室溫為25°C-27°C的條件下培養(yǎng)5-7天備用。
[0018] (3)制備金線蓮共生萌發(fā)絲核菌的固體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分包括：山毛櫸科樹葉、 山毛櫸科木屑、米糠，按照其重量比例為：40 : 40 : 20的比例混合配制而成，培養(yǎng)基的含 水量為60%，經(jīng)120°C高溫滅菌，滅菌時(shí)間為lh，將步驟（2)菌株的液體菌種接種到固體培 養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-14天，待大部分或是全部固體培養(yǎng)基長(zhǎng)滿共生真菌時(shí)備用。
[0019] (4)金線蓮種子的播種與暗培養(yǎng)：將成熟的金線蓮種子(如圖1所示）撒播在步驟 (3)固體培養(yǎng)基上，金線蓮種子與共生真菌共生萌發(fā)成原球莖，在室溫25-27°C的條件下，經(jīng) 過(guò)45- 60天的暗培養(yǎng)，發(fā)育成長(zhǎng)度達(dá)I. 5-3cm金線蓮原球莖，如圖3-4所示。
[0020] (5)金線蓮原球莖的轉(zhuǎn)移與光培養(yǎng)：將粗壯的金線蓮原球莖轉(zhuǎn)移到山毛櫸科樹 葉：山毛櫸科木屑體積比為1 :1的混合基質(zhì)，在室溫25°C-27°C的條件下，光照強(qiáng)度在 2000LUX，每天光照12h，光培養(yǎng)約20-30天，原球莖分化成為具有原生態(tài)的仿野生金線蓮 幼苗，幼苗高度可達(dá)5cm以上，如圖5-7所示。
[0021] 下面列表顯示本實(shí)施例共生菌株對(duì)金線蓮種子萌發(fā)率及株高的影響

【權(quán)利要求】
1.金線蓮種子與真菌共生萌發(fā)快速成苗的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 金線蓮共生萌發(fā)真菌的分離、純化： 選取野生金線蓮健壯幼苗根狀莖的頂端突起部位、或是根狀莖的節(jié)上突起部位；將這 一部位用70%酒精表面消毒3-5s，置于清水瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)、分離、純化； (2) 制備金線蓮共生萌發(fā)真菌的液體菌種： 將分離純化后的金線蓮有效共生萌發(fā)真菌一絲核菌，保藏號(hào)為CGMCC No. 9728,從低溫 保藏的斜面試管活化后，制備成液體共生菌種備用； 液體菌種的配制比例為：20%馬鈴薯提取液：1 一5%山毛櫸科樹葉提取液：0. 5 - 1. 5% 白砂糖； 山毛櫸科樹葉提取液的制備：將山毛櫸科樹葉與水按1 :5的比例混合，煮沸半小時(shí)，濾 出原液制成； (3) 制備金線蓮共生萌發(fā)絲核菌的固體培養(yǎng)基： 培養(yǎng)基由山毛櫸科樹葉、山毛櫸科木屑、麥麩或米糠按照比例混合，再經(jīng)過(guò)高溫殺菌， 然后將絲核菌的液體菌種接種到培養(yǎng)基上，在溫度為25°C - 27°C的環(huán)境下培養(yǎng)，待共生真 菌長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基，等待播種； 所述培養(yǎng)基原料配制的比例為：山毛櫸科樹葉30-45% :山毛櫸科木屑30-45% :米糠 或麥麩10-40%，培養(yǎng)基的含水量為60- 62% ; (4) 金線蓮種子的播種與暗培養(yǎng)： 將成熟的金線蓮種子撒播在長(zhǎng)滿共生真菌的培養(yǎng)基上，在溫度為25- 27°C的環(huán)境下， 暗培養(yǎng)45- 60天，金線蓮種子與共生真菌共生萌發(fā)成長(zhǎng)為粗壯的原球莖； (5) 金線蓮原球莖的轉(zhuǎn)移與光培養(yǎng)： 將粗壯的金線蓮原球莖轉(zhuǎn)移至山毛櫸科樹葉：山毛櫸科木屑體積比為1 :1?1 :3的混 合基質(zhì)中，在光照強(qiáng)度為1000-3000LUX，光照時(shí)間為10-12h/d，溫度為25°C -27°C的條件 下，光培養(yǎng)20- 30天，成長(zhǎng)為具有原生態(tài)的仿野生金線蓮幼苗。
【文檔編號(hào)】A01C1/02GK104350838SQ201410582811
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】趙有林, 崔保登 申請(qǐng)人:桂林保林生物技術(shù)有限公司