蘋果組培苗熱處理結(jié)合化學(xué)處理的脫毒方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蘋果病毒脫除方法。該方法是將蘋果組培苗莖尖接種于含15-25μg/mL病毒醚的培養(yǎng)基中，升溫至34-36℃條件下進行恒溫?zé)崽幚?。本發(fā)明的優(yōu)點為：植株的存活率高、脫毒效果好、所需時間短，選用的化學(xué)藥劑不具有寄主選擇性，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】蘋果組培苗熱處理結(jié)合化學(xué)處理的脫毒方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蘋果病毒脫除方法，特別涉及一種蘋果組培苗熱處理結(jié)合化學(xué)處 理的脫毒方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國栽植的蘋果普遍感染多種病毒。蘋果花葉病毒（ApMV)、蘋果褪綠葉斑病毒 (ACLSV)、蘋果莖痘病毒（ASPV)和蘋果莖溝病毒（ASGV)是侵染蘋果的最常見病毒。蘋果感 染ApMV后，葉片上會出現(xiàn)大小不一的鮮黃色或黃白色斑塊，形成花葉，還可能出現(xiàn)沿葉脈 褪綠黃化的網(wǎng)紋型癥狀。ACLSV、ASGV和ASPV在多數(shù)蘋果栽培品種中呈潛隱性，不表現(xiàn)癥 狀，只在少數(shù)感病品種或指示植物上表現(xiàn)癥狀。在我國蘋果主要栽培區(qū)，3種潛隱病毒的帶 毒株率高達80%?100%，每年使蘋果減產(chǎn)約17%?40%。如果土壤貧瘠、水肥欠缺、管理 不善或利用了對病毒較敏感的砧木和品種時，會使植株衰弱死亡，造成果園殘缺不全，甚至 全園毀滅。蘋果病毒主要通過嫁接傳染，隨帶毒繁殖材料（如苗木、接穗、營養(yǎng)系砧木等） 遠距離傳播擴散，迄今尚未發(fā)現(xiàn)任何傳毒介體。蘋果一旦感染病毒，就很難防治。
[0003] 采用脫毒技術(shù)，培育無病毒原種，建立用于繁殖接穗和營養(yǎng)系砧木的母本園，栽植 無病毒苗木，是防治病毒病的根本措施。目前用于蘋果脫毒的方法主要包括莖尖培養(yǎng)、熱處 理和化學(xué)處理等。這些方法都存在不足之處，采用莖尖培養(yǎng)的方法，切取的莖尖大小一般為 0. 1-0. 5mm，操作困難，且成活率低；由于蘋果對溫度較為敏感，熱處理脫毒過程中，植株的 成活率與溫度呈反比，脫毒率與溫度正比，兼顧成活率和脫毒率，就需延長處理時間；蘋果 化學(xué)處理常用的藥劑為病毒醚（Ribavirin)，脫毒的脫除效果與藥劑的濃度成正比，且當(dāng)其 濃度高于25 y g/mL時，將對植株產(chǎn)生嚴重的藥害。目前，一直沒有既能夠保證成活率，又能 獲得很好的脫毒效果的蘋果病毒脫除方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于，提供一種植株成活率高、脫毒效果好、處理時間短的蘋果組培 苗熱處理結(jié)合化學(xué)處理的脫毒方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] 蘋果組培苗熱處理結(jié)合化學(xué)處理的脫毒方法，蘋果組培苗生長在含有15-25 y g/ mL病毒醚（Ribavirin)的培養(yǎng)基中，同時在34-36°C的條件下進行恒溫?zé)崽幚?。具體是將 蘋果組培苗莖尖接種于含15-25 y g/mL病毒醚的培養(yǎng)基中，升溫至34-36°C條件下進行恒 溫?zé)崽幚?。所述蘋果組培苗莖尖可為0. 1-1. 〇cm，優(yōu)選0. 7cm。
[0007] 所述恒溫?zé)崽幚硖幚頃r間為18-25天，優(yōu)選20天。
[0008] 在溫度為36°C，病毒醚（Ribavirin)的濃度為25 ii g/mL的條件下，蘋果病毒的脫 除效果最好。
[0009] 所述方法還包括在升溫之前先在24°C下培養(yǎng)1天，然后，依次升溫培養(yǎng)：28°C培養(yǎng) 1天、30°C培養(yǎng)1天、32°C培養(yǎng)1天。
[0010] 所述含15-25 i! g/mL病毒醚的培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加病毒醚，使病毒醚終 濃度為15-25 y g/mL，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中添加終濃度為lmg/L6-芐氨基嘌呤和 終濃度為〇. lmg/L萘乙酸得到的培養(yǎng)基。
[0011] 上述病毒醚（Ribavirin,Virazole?)又名病毒唑，化學(xué)名為1-@-D-呋喃核糖 基-1H-1，2,4,-三氮唑-3-羧酰胺。
[0012] 所述方法中，整個處理過程中，光照時間12-16小時/天，光照強度1800-2200LUX， 優(yōu)選光照強度2000LUX，光照時間16小時/天。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點如下：
[0014] 1.處理植株成活率高。本發(fā)明中的熱處理溫度和化學(xué)藥劑濃度都較低，對植株的 生長影響較小，植株的死亡率低。
[0015] 2.再生植株的脫毒效果好。本發(fā)明將熱處理和化學(xué)處理結(jié)合后，脫毒效率明顯高 于單獨熱處理或化學(xué)處理。
[0016] 3.脫毒處理時間短。本發(fā)明中蘋果試管苗脫毒處理需要的時間為20天，與單獨熱 處理或化學(xué)處理相比時間明顯縮短。

【具體實施方式】
[0017] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的試驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常 規(guī)生化試劑公司購買得到的。下述實施例中使用的病毒醚（Ribavirin，Virazole?)又名 病毒唑，化學(xué)名為1-0 -D-呋喃核糖基-1H-1，2,4,-三氮唑-3-羧酰胺。
[0018] 實施例1、蘋果組培苗熱處理結(jié)合化學(xué)處理的脫毒方法：
[0019] 1、含病毒醚（Ribavirin)培養(yǎng)基的配制：
[0020] 制備蘋果的擴繁培養(yǎng)基，配方為MS+lmg/L 6-節(jié)氨基噪呤（6-BA)+0. lmg/L萘乙酸 (NAA)，高溫滅菌，冷卻至60-70°C時，在無菌的環(huán)境中，將過濾除菌的病毒醚加入到培養(yǎng)基 中，搖勻，使其終濃度分別為15和25ii g/mL。
[0021] 2、脫毒處理：
[0022] 當(dāng)蘋果組培苗擴繁到所需數(shù)量后，選取長勢一致的植株，切取0. 7cm的莖尖，分別 將莖尖移入含15和25 y g/mL病毒醚的培養(yǎng)基中，先在室溫25°C下放置1天，然后移入光照 培養(yǎng)箱內(nèi)，依次升溫培養(yǎng)：28°C培養(yǎng)1天、30°C培養(yǎng)1天、32°C培養(yǎng)1天，最后將溫度分別升 至34°C和36°C，處理20天，該處理過程中，光照強度2000LUX，光照時間16小時/天；然后 統(tǒng)計成活情況，并切取1mm莖尖（包括主芽和> 〇. 5cm的側(cè)芽）移入新鮮的蘋果擴繁培養(yǎng) 基中，進行再生培養(yǎng)。再生培養(yǎng)的溫度為25°C，光照強度2000LUX，光照時間12小時/天。
[0023]單獨熱處理的對照：當(dāng)蘋果組培苗擴繁到所需數(shù)量后，選取長勢一致的植株，切取 〇. 7cm的莖尖，分別將莖尖移入蘋果擴繁培養(yǎng)基中，先在室溫25°C下放置1天，然后移入光 照培養(yǎng)箱內(nèi)，依次升溫培養(yǎng)：28°C培養(yǎng)1天、30°C培養(yǎng)1天、32°C培養(yǎng)1天，最后將溫度分別 升至34°C和36°C，處理20天，該處理過程中，光照強度2000LUX，光照時間16小時/天；然 后統(tǒng)計成活情況，并切取1mm莖尖（包括主芽和>〇. 5cm的側(cè)芽）移入新鮮的蘋果擴繁培養(yǎng) 基中，進行再生培養(yǎng)。再生培養(yǎng)的溫度為25°C，光照強度2000LUX，光照時間12小時/天。
[0024] 單獨化學(xué)處理的對照：當(dāng)蘋果組培苗擴繁到所需數(shù)量后，選取長勢一致的植株，切 取0. 7cm的莖尖，分別將莖尖移入含15和25 y g/mL病毒醚的培養(yǎng)基中，處理60天后，該處 理過程中，光照強度2000LUX，光照時間16小時/天；統(tǒng)計成活情況，并切取1mm莖尖（包 括主芽和3 0.5cm的側(cè)芽）移入新鮮的蘋果擴繁培養(yǎng)基中，進行再生培養(yǎng)。再生培養(yǎng)的溫 度為25°C，光照強度2000LUX，光照時間12小時/天。
[0025] 上述蘋果擴繁培養(yǎng)基為：MS+lmg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA)+0?lmg/L萘乙酸（NAA)。
[0026] 3、再生植株的病毒檢測：
[0027] 當(dāng)再生植株繼代培養(yǎng)2次后，采用RT-PCR的方法對再生植株中的病毒進行檢測， 計算脫毒效果。上述繼代培養(yǎng)的方法為：莖尖再生培養(yǎng)成完整的蘋果植株后（約培養(yǎng)60 天），在無菌的條件下，從再生培養(yǎng)后的蘋果組培苗上切取約1. 〇cm的莖尖，轉(zhuǎn)入新鮮的蘋 果擴繁培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，各個處理及其結(jié)果如表1-表3所示。
[0028]表1

【權(quán)利要求】
1. 蘋果組培苗熱處理結(jié)合化學(xué)處理的脫毒方法，是將蘋果組培苗莖尖接種于含 15-25 y g/mL病毒醚的培養(yǎng)基中，升溫至34-36°C條件下進行恒溫?zé)崽幚怼?br> 2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述恒溫?zé)崽幚淼奶幚頃r間為18-25天。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述恒溫?zé)崽幚淼奶幚頃r間為20天。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其特征在于：所述方法還包括在升溫之 前先在25°C下培養(yǎng)1天，然后，依次升溫培養(yǎng)：28°C培養(yǎng)1天、30°C培養(yǎng)1天、32°C培養(yǎng)1天。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其特征在于：所述含15-25 y g/mL病毒 醚的培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加病毒醚，使病毒醚的終濃度為15-25 y g/mL，所述基礎(chǔ)培 養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中添加終濃度為lmg/L 6-芐氨基嘌呤和終濃度為0. lmg/L萘乙酸得到的 培養(yǎng)基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述含15-25 yg/mL病毒醚的培養(yǎng)基中 病毒醚的終濃度為25ug/mL，所述恒溫?zé)崽幚淼臏囟葹?6°C。
【文檔編號】A01H4/00GK104429942SQ201410608611
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】胡國君, 董雅鳳, 張尊平, 范旭東, 任芳, 周俊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所