一種甘蔗梢腐病抗性鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，是將配制好的甘蔗梢腐病病原菌孢懸液注射到甘蔗苗生長(zhǎng)點(diǎn)上，同時(shí)設(shè)空白無菌水為對(duì)照，接種后的甘蔗苗培養(yǎng)10～15天后調(diào)查病原菌繁殖情況，根據(jù)發(fā)病程度和發(fā)病病情指數(shù)將甘蔗品種對(duì)甘蔗梢腐病的抗病性分為免疫、抗病、中抗和感病四個(gè)級(jí)別。本發(fā)明所采用的注射接種方式對(duì)甘蔗苗梢腐病進(jìn)行鑒定，該方法更接近于田間甘蔗苗期感染梢腐病的實(shí)際情況，能直觀的表現(xiàn)出不同品種甘蔗苗對(duì)甘蔗梢腐病的抗性水平。
【專利說明】一種甘蔗梢腐病抗性鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，屬于作物病害抗性鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 甘鹿梢腐?。≒okkah Boeng Disease)病原為串珠鐮孢（Fusarium moniliformae)，無性階段可產(chǎn)生串珠狀分生孢子或者假頭狀產(chǎn)孢，有性態(tài)為串珠赤霉菌 (Gibberella moniliformis)。甘鹿梢腐病主要發(fā)生在甘鹿的幼嫩葉片和梢部，感病后引起 植株梢部腐爛，故名梢腐病。植株感染后心葉呈現(xiàn)梯形凹凸扭曲，有縱裂，梢頭部葉片常纏 在一起發(fā)生變形，并出現(xiàn)明顯的褐色皺紋。植株受害嚴(yán)重時(shí)，其生長(zhǎng)點(diǎn)周圍的組織會(huì)變軟變 褐，心葉壞死，形成梢腐，導(dǎo)致整株甘蔗枯死，對(duì)甘蔗的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生很大的影響。1921在 印度尼西亞爪哇首次報(bào)道了該病，目前該病幾乎遍及所有的甘蔗生產(chǎn)國(guó)和地區(qū)，已發(fā)展成 一種世界性病害。
[0003] 在我國(guó)，由于新臺(tái)糖22的大面積推廣種植，品種單一，梢腐病在我國(guó)蔗區(qū)的發(fā)生 呈逐漸加重趨勢(shì)，導(dǎo)致該病已成為甘蔗生長(zhǎng)前中期的主要病害。甘蔗梢腐病在我國(guó)蔗區(qū)普 遍發(fā)生，在高溫高濕天氣持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的年份，部分地區(qū)梢腐病發(fā)病率在25 %以上，最高達(dá) 40%，已對(duì)我國(guó)甘蔗生產(chǎn)和糖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。
[0004] 但至今尚未建立高效、準(zhǔn)確的甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，鑒于我國(guó)甘蔗梢腐病發(fā) 生逐漸加重的趨勢(shì)，因此建立一套快速有效的甘蔗梢腐病抗性鑒定方法并篩選抗性種質(zhì)資 源和品種勢(shì)在必行。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)我國(guó)甘蔗梢腐病抗性鑒定方法的空白，本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、快 速、準(zhǔn)確的甘蔗梢腐病抗性鑒定方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方法如下：
[0007] -種甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，包括以下步驟：
[0008] 1)配制甘蔗梢腐病病原菌孢懸液
[0009] 將甘蔗梢腐病病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上活化，挑取邊緣菌絲接種在滅菌后的 馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，離心、過濾收集菌體，用無菌水制成濃度為1 X 106? 1 X 107CFU/ml的甘蔗梢腐病病原菌孢懸液備用；
[0010] 2)參試甘蔗苗的準(zhǔn)備
[0011] 將各品種的甘蔗種消毒、播種，出苗后長(zhǎng)至3?4片完全葉，備用；
[0012] 3)接種鑒定
[0013] 將步驟1)得到的甘蔗梢腐病病原菌孢懸液接種到步驟2)所述的各品種的甘蔗苗 生長(zhǎng)點(diǎn)，同時(shí)對(duì)各品種的甘蔗苗都設(shè)空白無菌水為對(duì)照；
[0014] 4)病情調(diào)查
[0015] 接種后的甘蔗苗培養(yǎng)10?15天后調(diào)查梢腐病病原菌繁殖情況，根據(jù)發(fā)病程度和 病原拓展面積，按發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)并計(jì)算病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)進(jìn)行甘蔗品 種的梢腐病抗性水平評(píng)價(jià)，甘蔗梢腐病品種抗性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0016] 免疫 病情指數(shù)￡0.01; 抗病 0.01 <病情指數(shù)夂0.0; 中抗 30.0<病情指數(shù)550.0; 感病 50.0 <病情指數(shù)。
[0017] 對(duì)于注射接種法，所述的發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0018] 0級(jí)葉片無癥狀；
[0019] 1級(jí)新葉無癥狀，一片葉片發(fā)病,接種后病原拓展面積占發(fā)病葉片面積小于5% ;
[0020] 2級(jí)新葉無癥狀，一片葉片發(fā)病，接種后病原拓展面積占發(fā)病葉片面積5%? 15%之間，包括5% ;
[0021] 3級(jí)新葉無癥狀，兩片葉片發(fā)病，接種后病原拓展面積占發(fā)病葉片面積15%? 25%之間，包括15% ;
[0022] 4級(jí)新葉部分發(fā)病，緊挨新葉的葉片有明顯黃褐色病斑，接種后病原拓展面積占 發(fā)病葉片面積25%?35%之間，包括25% ;
[0023] 5級(jí)新葉大部分或全部死亡，緊挨新葉的葉片有大面積黃褐色病斑，接種后病原 拓展面積占發(fā)病葉片面積的35%以上。
[0024] 對(duì)于剪葉接種法，所述的發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0025] 0級(jí)無病癥；
[0026] 1級(jí)剪口處黑色無擴(kuò)展，〈1mm失綠；
[0027] 2級(jí)病斑從剪口向外擴(kuò)展，1?3mm壞死斑；
[0028] 3級(jí)病斑從剪口向外擴(kuò)展，3?5mm褐斑；
[0029] 4級(jí)病斑從剪口向外擴(kuò)展，5?7mm黃褐色病斑；
[0030] 5級(jí)病斑從剪口向外擴(kuò)展，>7mm以上黃褐色病斑。
[0031] 所述的病情指數(shù)計(jì)算公式為：
[0032] 病情指數(shù)=[2 (發(fā)病等級(jí)數(shù)X相應(yīng)等級(jí)的發(fā)病棵數(shù)V (最高發(fā)病等級(jí)數(shù)X總 調(diào)查棵數(shù)）]X100。
[0033] 所述的病情指數(shù)計(jì)算公式同時(shí)適用于剪葉接種法和注射接種法。
[0034] 優(yōu)選的，步驟1)中，所述甘蔗梢腐病病原菌活化時(shí)間為2?8天。
[0035] 優(yōu)選的，步驟1)中，所述甘蔗梢腐病病原菌震蕩培養(yǎng)時(shí)間為2?8天。
[0036] 優(yōu)選的，步驟3)中,所述孢懸液注射量為10?100 ii 1。
[0037] 優(yōu)選的，步驟3)中，接種方法為剪葉法或注射法。
[0038] 本發(fā)明的有益效果是：
[0039] 1、本發(fā)明通過注射接種方式對(duì)甘蔗苗梢腐病進(jìn)行鑒定，該方法更接近于田間甘蔗 苗感染梢腐病的實(shí)際情況，能直觀的表現(xiàn)出不同品種甘蔗苗對(duì)甘蔗梢腐病的抗性水平。
[0040] 2、本鑒定方法快速、操作簡(jiǎn)便，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高，各育種單位均能通過此法開 展鑒定工作。
[0041] 3、該鑒定方法為甘蔗抗病育種前期提供技術(shù)支持，剔除部分感病品種，為后期品 種篩選減輕人力物力，該方法的推廣使用，對(duì)于篩選抗病品種和指導(dǎo)甘蔗抗病育種具有重 要意義和現(xiàn)實(shí)作用。

【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不 局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此 夕卜，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種修改，這些等價(jià)變化同 樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 1、接種體的制備
[0045] 分別制備甘蔗梢腐病病原菌菌株CN0?1和菌株YN41 (廣西大學(xué)甘蔗種質(zhì)資源 創(chuàng)新與遺傳改良實(shí)驗(yàn)室提供）孢懸液。兩種菌株孢懸液的制備方法相同，具體為：將甘蔗 梢腐病病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上活化3天，挑取邊緣菌絲接種在滅菌的馬鈴薯葡萄糖水 培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)3天，離心收集菌體，用滅菌的脫脂棉過濾，用無菌水調(diào)節(jié)孢子濃度至 1 X 106CFU/ml濃度。獲得菌株CN0?1孢懸液和菌株YN41孢懸液。
[0046] 2、接種材料的處理
[0047] 選取不同的甘蔗品種為接種材料，包括新臺(tái)糖22、福桂1號(hào)、福桂2號(hào)和福桂3號(hào)， 用0. 3 %多菌靈浸種20min，每桶種植10芽于溫室中，出苗后正常管理，長(zhǎng)出3?4片完全 葉時(shí)進(jìn)行接種。
[0048] 3、接種
[0049] 3. 1剪葉接種法
[0050] 操作要點(diǎn)為：首先，用無菌剪刀沾取待接孢懸液；然后，在最頂部一片完全葉葉片 中間剪5mm大小傷口。要求無菌剪刀沾取一次孢懸液，只剪切一次葉片，剪切下一張葉片 前，必須重新沾取孢懸液。
[0051] 3. 2注射接種法
[0052] 操作要點(diǎn)為：用1ml醫(yī)用注射器將20 yl孢子懸浮液注射到甘蔗生長(zhǎng)點(diǎn)。
[0053] 3. 3試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)
[0054] ①取長(zhǎng)勢(shì)相同的各品種甘蔗苗各10株，分別用剪葉接種法接種，接種體為菌株 CN0?1孢懸液；再取長(zhǎng)勢(shì)相同的各品種甘蔗苗各10株，以沾無菌水剪葉為對(duì)照。
[0055] ②取長(zhǎng)勢(shì)相同的各品種甘蔗苗各10株，分別用剪葉接種法接種，接種體為菌株 YN41孢懸液；再取長(zhǎng)勢(shì)相同的各品種甘蔗苗各10株，以沾無菌水剪葉為對(duì)照。
[0056] ③取長(zhǎng)勢(shì)相同的各品種甘蔗苗各10株，分別用注射接種法接種，接種體為菌株 CN0?1孢懸液；再取長(zhǎng)勢(shì)相同的各品種甘蔗苗各10株，以注射無菌水為對(duì)照。
[0057] ④取長(zhǎng)勢(shì)相同的各品種甘蔗苗各10株，分別用注射接種法接種，接種體為菌株 YN41孢懸液；再取長(zhǎng)勢(shì)相同的各品種甘蔗苗各10株，以注射無菌水為對(duì)照。
[0058] 4、病情調(diào)查
[0059] 4. 1發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)：
[0060] 接種后的甘蔗苗培養(yǎng)10天后調(diào)查梢腐病病原菌繁殖情況,根據(jù)發(fā)病程度和病原 拓展面積，按發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)并計(jì)算病情指數(shù)，發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)見表1。
[0061] 表1發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)
[0062]

【權(quán)利要求】
1. 一種甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 配制甘蔗梢腐病病原菌孢懸液 將甘蔗梢腐病病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上活化，挑取邊緣菌絲接種在滅菌后的馬 鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，離心、過濾收集菌體，用無菌水制成濃度為IX 106? 1 X 107CFU/ml的甘蔗梢腐病病原菌孢懸液備用； 2) 參試甘蔗苗的準(zhǔn)備 將各品種的甘蔗種消毒、播種，出苗后長(zhǎng)至3?4片完全葉，備用； 3) 接種鑒定 將步驟1)得到的甘蔗梢腐病病原菌孢懸液接種到步驟2)所述的各品種的甘蔗苗生長(zhǎng) 點(diǎn)，同時(shí)對(duì)各品種的甘蔗苗都設(shè)空白無菌水為對(duì)照； 4) 病情調(diào)查 接種后的甘蔗苗培養(yǎng)10?15天后調(diào)查梢腐病病原菌繁殖情況，根據(jù)發(fā)病程度和病原 拓展面積，按發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)并計(jì)算病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)進(jìn)行甘蔗品種的 梢腐病抗性水平評(píng)價(jià)，甘蔗梢腐病品種抗性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)如下： 免疫病情指數(shù)< 〇. 〇1 ; 抗病 0. 01 <病情指數(shù)< 30. 0 ; 中抗 30. 0 <病情指數(shù)< 50. 0 ; 感病 50. 0 <病情指數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，其特征在于，步驟3)中，接種方法為 剪葉接種法或注射接種法。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，其特征在于，對(duì)于注射接種法，所述 的發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)如下： 〇級(jí)葉片無癥狀； 1級(jí)新葉無癥狀，一片葉片發(fā)病，接種后病原拓展面積占發(fā)病葉片面積小于5% ; 2級(jí) 新葉無癥狀，一片葉片發(fā)病，接種后病原拓展面積占發(fā)病葉片面積5%?15% 之間，包括5% ; 3級(jí)新葉無癥狀,兩片葉片發(fā)病，接種后病原拓展面積占發(fā)病葉片面積15%?25% 之間，包括15% ; 4級(jí) 新葉部分發(fā)病，緊挨新葉的葉片有明顯黃褐色病斑，接種后病原拓展面積占發(fā) 病葉片面積25%?35%之間，包括25% ; 5級(jí) 新葉大部分或全部死亡，緊挨新葉的葉片有大面積黃褐色病斑，接種后病原拓 展面積占發(fā)病葉片面積的35%以上。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，其特征在于，對(duì)于剪葉接種法，所述 的發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)如下： 〇級(jí)無病癥； 1級(jí)剪口處黑色無擴(kuò)展，〈1mm失綠； 2級(jí)病斑從剪口向外擴(kuò)展，1?3mm壞死斑； 3級(jí)病斑從剪口向外擴(kuò)展，3?5mm褐斑； 4級(jí)病斑從剪口向外擴(kuò)展，5?7_黃褐色病斑； 5級(jí)病斑從剪口向外擴(kuò)展，>7mm以上黃褐色病斑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，其特征在于，所述的病情指數(shù)計(jì)算 公式為： 病情指數(shù)=[2 (發(fā)病等級(jí)數(shù)x相應(yīng)等級(jí)的發(fā)病棵數(shù)V(最高發(fā)病等級(jí)數(shù)x總調(diào)查 棵數(shù)）]X100; 所述的病情指數(shù)計(jì)算公式同時(shí)適用于剪葉接種法和注射接種法。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，其特征在于，步驟1)中，所述甘蔗梢 腐病病原菌活化時(shí)間為2?8天。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，其特征在于，步驟1)中，所述甘蔗梢 腐病病原菌震蕩培養(yǎng)時(shí)間為2?8天。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，其特征在于，步驟3)中，所述孢懸液 注射量為10?100 u 1。
【文檔編號(hào)】A01G7/00GK104450862SQ201410614074
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】張木清, 徐世強(qiáng), 王繼華 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)